Summary
हम एक कक्ष स्लाइड्स और मीडिया का उपयोग करने के लिए विकास के कई दिनों में epidermis के confocal इमेजिंग के लिए संयंत्र बीजपत्र स्थिर, रंध्रीय भेदभाव का दस्तावेजीकरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. Fluorophore टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति और subcellular स्थानीयकरण गतिशील से लगाया जा सकता है, कोशिका विभाजन और भेदभाव सेल प्रकार के दौरान उनके संभव भूमिकाओं की समझ बढ़ रही है.
Protocol
1. बीज बंध्याकरण
- 33% घरेलू ब्लीच, 0.1% ट्राइटन X-100 बीज नसबंदी समाधान तैयार करें.
- जगह वांछित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (ओं) निर्माण और 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में जीनोटाइप (ओं) और नसबंदी के समाधान के 1 मिलीग्राम लागू ले बीज. 15 मिनट के लिए nutator पर सेते हैं.
- एक बाँझ हुड में, एक pipettor का उपयोग करने के लिए ट्यूब से नसबंदी समाधान निकालने के लिए, बीज को छोड़ने के पीछे. 1 मिलीलीटर बाँझ पानी से कुल्ला. चार बार दोहराएँ.
- दो या दो से अधिक दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
2. चैंबर स्लाइड मीडिया की तैयारी
- पानी में Bacto (शुद्ध agarose नहीं) एक 200 मिलीलीटर फ्लास्क में, अग्रवाल और माइक्रोवेव के 0.5% समाधान के 20 मिलीलीटर मिश्रण जब तक भंग. सावधान रहो, जब समाधान उबलते.
- लगभग 60 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान से अच्छा है
- एक pipettor साथ अगर समाधान के 1 मिलीलीटर ले लीजिए और धीरे चैम्बर स्लाइड (लैब टेक द्वितीय संभाग # 1.5 जर्मन coverglass सिस्टम) के अंदर गिलास को कवर करने के लिए लागू होते हैं. समाधान which बहुत गर्म या बहुत जल्दी लागू गोंद या दरार गिलास पिघल सकता है.
- तुरंत अगर समाधान के एक 2 मिलीलीटर जोड़ने. अग्रवाल मीडिया अब स्लाइड चैम्बर के नीचे पूरी तरह से कवर किया जाना चाहिए. यह कम से कम मीडिया के लिए एक संयंत्र बीजपत्र है, जो चार से पांच दिनों के लिए संग्रहीत, नमी को बनाए रखने और गैस प्रसार की अनुमति से पोषक तत्व होते हैं में विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है.
- चैम्बर के साथ benchtop पर शांत स्लाइड कवर. यदि फ्लास्क कसकर कवर किया जाता है, समाधान और बचाया जा सकता है भविष्य में उपयोग के लिए reheated.
3. बीज विच्छेदन
- 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से बाँझ बीज की ट्यूब निकालें.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर एक पेपर ऊतकों प्लेस और पानी से गीला. ऊतकों को समायोजित करने के लिए एक चिकनी सतह बनाने के लिए. ऊतकों को विच्छेदन के लिए बीज को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- ट्यूब से ऊतक 20-30 बीज pipet, विदारक गुंजाइश देखने के क्षेत्र में उन्हें जगह करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
- तेज संदंश (Roboz, # 5 जीव विज्ञान टिप) का प्रयोगध्यान से अंकुर अंदर से बीज कोट को हटा दें. दोनों बाहरी और भीतरी integuments हटाया जाना चाहिए.
- जब इमेजिंग बीजपत्र, यह फायदेमंद है hypocotyl और मूलिका हटाने. बीजपत्र इस प्रोटोकॉल के तहत कई दिनों के लिए विकसित करने के लिए पर्याप्त पोषक तत्व होते हैं. यदि बरकरार, hypocotyl सीधा और लंबा नाटकीय रूप से होगा, बीजपत्र देखने का समय व्यतीत हो जाने के क्षेत्र के बाहर जा रहा है. एक स्केलपेल प्रयोग hypocotyl की मुफ्त बीजपत्र टुकड़ा.
- पानी में डूबे एक microtube या इसी तरह के में, dissected बीजपत्र पकड़ो.
- 3.4-3.6 दोहराएँ बीजपत्रों की वांछित संख्या तक पहुँच जाता है. 15-20 सफल dissections बढ़ते पहले की सिफारिश कर रहे हैं.
4. चैम्बर स्लाइड में बढ़ते बीजपत्र
- एक छोटे से (18 मिमी 2) को कवर पर्ची, अगर मीडिया के माध्यम से कटौती करने के लिए और पूरे परत चैम्बर स्लाइड गिलास आधार से ऊपर उठा.
- Pipet धारण करने से पानी की एक न्यूनतम के साथ बीजपत्र dissectedचैम्बर स्लाइड, में उठाया अगर परत के तहत ट्यूब.
- धीरे बीजपत्र पर अगर कम है. यदि अतिरिक्त पानी मौजूद है, यह एक ऊतक के साथ सोख दूर, सावधान बीजपत्रों को परेशान नहीं किया जा रहा है. नमूने अब आसानी से स्थानांतरित जब माउंट पूरा हो गया है चाहिए.
- चैम्बर स्लाइड और कदम मंच खुर्दबीन स्लाइड पर कवर रखें.
5. समय चूक इमेजिंग
- वांछित fluorophore (ओं) छवि उल्टे confocal खुर्दबीन सेट. GFP, 488 एनएम और संग्रह में एक बैंड 440-530 एनएम के पास फिल्टर के साथ उत्तेजना के लिए आरएफपी, 555 एनएम और संग्रह में एक बैंड 570-610 एनएम के पास फिल्टर के साथ उत्तेजना के लिए: LSM700 मापदंडों प्रयोग किया जाता है.
- क्षति के लिए घुड़सवार नमूनों का निरीक्षण किया. बरकरार के स्थानों कार्यक्रम, ठीक सॉफ्टवेयर में खुर्दबीन बीजपत्र मुहिम शुरू की. जेन 2009 में: 20x उद्देश्य के साथ एक बीजपत्र पर फोकस और चैम्बर स्लाइड के केंद्र के लिए उद्देश्य चाल. अधिग्रहण मोड के तहत 0.5 ज़ूम बदलने के लिए और फ्रेम आकार </ Em> 48x48 पिक्सल. पोजिशन के तहत पोजिशन चेकबॉक्स और स्कैन सिंहावलोकन ... छवि बटन का चयन करें, तो 30-35 के लिए क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर टाइल संख्या में वृद्धि हुई है. जब स्कैन पूरा हो गया है, आयाम टैब और जगह क्रॉसहेयर तहत प्रत्येक बीजपत्र पर निरीक्षण करने के पदों बटन पर क्लिक करें.
- Z श्रृंखला को शामिल सभी samples.In ज़ेन 2009 की बीजपत्र epidermis सेट: Z-ढेर चेकबॉक्स क्लिक करें. स्थिति सूची के तहत प्रत्येक स्थान का चयन करें और बटन पर जाएँ क्लिक करें. बीजपत्र epidermis के ऊपरवाला विमान पर फोकस और Z ढेर के तहत सेट पहला बटन पर क्लिक करें. न्यूनतम स्थिति है जिस पर epidermis उपयोगी दिखाई देता है फोकस करने के लिए और सेट अंतिम बटन पर क्लिक करें. इष्टतम है, जो सबसे अच्छा z-टुकड़ा मोटाई से पता चलता है, करने के लिए सेट करने के लिए अगले बटन पर क्लिक करें. प्रत्येक गर्भदल जाँच करें पुष्टि करते हैं कि इन सेटिंग्स सभी नमूनों को धरना, z मापदंडों indiv के लिए निर्धारित नहीं कर सकतेजेन 2009 में idual पदों.
- इच्छित संकल्प और लंबाई में समय श्रृंखला सेट. तीन दिनों के लिए 15-30 मिनट के अंतराल epidermal कोशिका विभाजन में प्रोटीन की गतिशीलता के लिए प्रभावी रहे हैं. इस अंतराल आवश्यक के रूप में बदला जा सकता है. ज़ेन 2009: समय श्रृंखला चेकबॉक्स क्लिक करें. समय की श्रृंखला के तहत, स्लाइडर या पाठ क्षेत्र में टाइपिंग का उपयोग कर वांछित छवियों की संख्या के लिए साइकिल सेट. अंतराल सेट करने के लिए 30 मिनट का चयन करने के लिए पुल - डाउन मेनू का उपयोग करें.
- Xyzt स्कैन बहु स्थिति शुरू करो. ध्यान दें कि पदों की संख्या स्कैन विनिर्देशों द्वारा सीमित किया जाना चाहिए, अगर कुल स्कैन समय वांछित अंतराल से अधिक है, समय अंक सही नहीं होगा. एक साथ छह पदों की एक अधिकतम संभव जब इमेजिंग GFP और आरएफपी 59 पर एक 30 मिनट के अंतराल में z-स्लाइस हमारी प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं. ज़ेन 2009: फ्रेम आकार बदलें वांछित संकल्प और प्रारंभ प्रयोग पर क्लिक करें.
6. वीडियो संपादन
- Confocal डेटा फ़ाइल से, एक अधिकतम तीव्रता प्रत्येक समय स्थिति / संयोजन और झगड़ा के रूप में एक lossless प्रारूप में छवि फ़ाइलों के रूप में निर्यात के z प्रक्षेपण. फ़ाइल नामों में स्थिति के अनुसार एक करने के लिए उन्हें एक फिल्म में गठबंधन करने के लिए सॉफ्टवेयर के लिए (जैसे, ध्रुवीय GFP_pos1_0001 POLAR GFP_pos1_0002, आदि ध्रुवीय GFP_0001_pos1 नहीं) श्रृंखला में होना चाहिए. ज़ेन 2009: उपयोग कॉपी: प्रसंस्करण टैब के अंतर्गत अलग फाइलें, तो अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन में पदों को विभाजित सबसेट. अंत में, झगड़ा के रूप में निर्यात (फ़ाइल: निर्यात, पूर्ण संकल्प छवि खिड़की - श्रृंखला).
- 7,8 फिजी प्रयोग चल bUnwarpJ 9 मैक्रो (प्लगिन्स: पंजीकरण: bUnwarpJ) द्वारा लगातार छवियों पंक्ति. मोनो को पंजीयन मोड बदलें. सभी उन्नत विकल्प डिफ़ॉल्ट मानों का उपयोग कर सकते हैं. लंबे समय चूक दृश्यों के लिए डाउनलोड करने के लिए, और मैक्रो "affine + अनुरूप लचीला 2 डी छवि पंजीकरण," स्थापित जो bUnwarpJ छवियों की एक श्रृंखला के लिए स्वचालित रूप से लागू होगा, और खुले yहमारे डेटा फ़ाइल का उपयोग: आयात: छवि अनुक्रम के लिए इसका इस्तेमाल. MOPS स्थलों निष्कर्षण और रन अचिह्नित करें.
- फिजी / ImageJ या QuickTime Pro गठबंधन छवियों के अनुक्रम को खोलने के लिए और इच्छित वीडियो प्रारूप (AVI एक अच्छा विकल्प है) में बचाने के लिए.
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Representative Results
जानकारीपूर्ण समय इस विधि के साथ एकत्र अंक का एक सेट चित्रा 3 में दिखाया गया है. सेल झिल्ली (बजे आरबी) आरएफपी और GFP अपने देशी प्रमोटर के तहत ध्रुवीय प्रोटीन जुड़े हुए है (POLAR :: POLAR GFP) के समय 30 मिनट पैमाने पर 6 के साथ चिह्नित कर रहे हैं, हम प्रोटीन स्थानीयकरण में परिवर्तन के साथ कोशिका विभाजन को देखते उन्हें पूर्ववर्ती. रंध्रीय वंश रूप में असममित कोशिका विभाजन को स्टेम सेल की तरह रंध्रीय meristemoids, जो आगे असममित डिवीजनों से गुजरना करने की क्षमता को बनाए रखने और उनकी बहन की कोशिकाओं बुलाया व्यापारियों, रंध्रीय वंश जमीन कोशिकाओं (SLGCs) कहा जाता है. SLGCs एक रंध्रीय अग्रदूत भाग्य मान नहीं है, वे अक्सर फुटपाथ कोशिकाओं में transdifferentiate, लेकिन असममित विभाजन क्षमता को फिर से शुरू करने के लिए एक और पहले से दूर स्थान दिया गया है के रूप में पत्ती का विस्तार meristemoid का उत्पादन हो सकता है. इन सभी भाग्य के अभिव्यक्ति और ध्रुवीय का स्थानीयकरण :: POLAR GFP (छवि 3, 1 वीडियो) में परिलक्षित होते हैं.
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चित्रा 1 रंध्रीय विकास की योजनाबद्ध. एक बुनियादी हेलिक्स पाश हेलिक्स प्रतिलेखन अवाक (SPCH) (SCRM) चीख, और SCRM2 कारकों द्वारा नियंत्रित चरण में Protodermal कोशिकाओं रंध्रीय meristemoid मां कोशिकाओं के रूप में वंश (एमएमसी) दर्ज करें. MMCs asymmetrically विभाजित करने के लिए एक meristemoid (एम) और रंध्रीय वंश जमीन सेल (SLGC) का उत्पादन, इस कदम कई बार होते हैं और एक व्यवस्था है जिसके द्वारा रंध्र अलग स्थान दिया गया है प्रदान कर सकते हैं. गार्ड माँ सेल (जीएमसी) meristemoid सेल राज्य संक्रमण की पहचान विशेष रूप से मूक bHLH के रूप में के रूप में अच्छी तरह से / 2 SCRM द्वारा निर्देशित है. जीएमसी और उसके भेदभाव दो परिपक्व गार्ड कोशिकाओं में (जीसी) की एक अंतिम सममित विभाजन bHLH FAMA 10/2 SCRM साथ की आवश्यकता है.ig1large.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2 बीज विच्छेदन और बढ़ते प्रक्रिया का आरेख. बीज निष्फल रहे हैं और 4 में आयोजित डिग्री सेल्सियस, बीज और कोट hypocotyls हटा दिया, और बीजपत्र इमेजिंग के लिए एक एक औंधा confocal खुर्दबीन पर चैम्बर स्लाइड में अगर मीडिया के तहत मुहिम शुरू की.
चित्रा 3 समय चूक इमेजिंग दर्शाता है ध्रुवीय :: ध्रुवीय GFP बाहर का स्थानीयकरण असममित कोशिका विभाजन से पहले. श्रृंखला A: ध्रुवीय GFP शुरू में समान रूप से वितरित करने के लिए प्रकट होता है, तो asymme से पहले लगभग दो घंटेtric डिवीजनों (arrowheads) ध्रुवीय GFP segregates प्रारंभिक meristemoid की साइट से दूर. श्रृंखला बी: प्रारंभिक असममित प्रभाग (arrowhead) के बाद, ध्रुवीय GFP दोनों कक्षों में गायब हो जाता है, तेजी से meristemoid द्वारा माँ (जीएमसी) सेल राज्य की रक्षा के लिए संक्रमण जिसका अर्थ. जीएमसी (तारांकन) symmetrically विभाजित है और रंध्रीय गार्ड कोशिकाओं के रूप differentiates, है जबकि बहन सेल POLAR GFP अभिव्यक्ति आ जाए, शायद बाद में असममित विभाजन presaging.
1 वीडियो सुव्यवस्थित, प्रवर्धन और एक रंध्रीय अग्रदूत सेल की रिक्ति के दौरान ध्रुवीय :: स्थानीयकरण ध्रुवीय GFP पंजीकृत वीडियो. शुरू में, ध्रुवीय GFP कक्ष में समान प्रतीत होता है, 39 घंटा अंकुरण के बाद यह दृढ़ता polarizes, एक विभाजन से पहले (40.0h) सेल के विपरीत छोर पर एक छोटे meristemoid रखने. सही पर बड़ा सेल भी रंध्रीय वंश पहचान आएगा, और 45 घंटा ध्रुवीय GFP स्थानीयकरण रंध्रीय अग्रदूत के निकट चाल. 47 घंटा में विभाजन एक नया (दाएं) पहले से मौजूदा meristemoid (बाएं) से दूर उन्मुख meristemoid का उत्पादन. अंत परिणाम एक सेल द्वारा दो अलग रंध्र. (वीडियो से लापता छवियाँ एकत्र की है और नहीं महत्वपूर्ण परिवर्तन का प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे थे.) फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
यह समय चूक confocal तकनीक fluorescently टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति और Arabidopsis बीजपत्र epidermis, जो ध्रुवीय और अन्य प्रोटीन गत्यात्मक रूप से बदल के मामले में उनके कार्य का एक उचित समझ के लिए महत्वपूर्ण है की व्यक्ति की कोशिकाओं में स्थानीयकरण के अनुदैर्ध्य अध्ययन की अनुमति देता है. पहले, निरंतर समय चूक इमेजिंग Arabidopsis रूट कवक संक्रमण 11 और विभज्योतक 5,12 विकास की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन इस तकनीक के बहुमुखी प्रतिभा बीजपत्र epidermis जोड़ने फैलता है और अतिरिक्त प्रोटीन के लिए इसके उपयोग की अनुमति देता है, विशेष रूप से रंध्रीय विकास के क्षेत्र के विस्तार की सहायता .
प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा है कि यह वर्तमान में बीजपत्र, जो पोषक तत्वों वे जल्दी विकास के लिए जरूरत शामिल करने के लिए प्रतिबंधित है. इसके अलावा, गर्भदल विकास बिल्कुल हवा में आया कि है क्योंकि जेल मध्यम गैस विनिमय प्रतिबंधित समान नहीं है. स्कैनिंग लासेवाओं जोखिम और कमरे में रोशनी photomorphogenesis लिए पर्याप्त हैं, बीजपत्र विस्तार और क्लोरोप्लास्ट परिपक्वता उत्प्रेरण, लेकिन रंध्र कभी कभी कम सीओ 2 एकाग्रता के कारण आसन्न जोड़े में विकसित हो सकता है. यह प्रवृत्ति केवल मीडिया की एक पतली परत और न्यूनतम बढ़ते पानी का उपयोग कर के रूप में इस प्रोटोकॉल में निर्देशित द्वारा कम किया जा सकता है.
Fluorophore चयन भी इस तकनीक के साथ सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. दोनों GFP और आरएफपी अच्छी तरह से काम करते हैं, और डबल सेल परिधि कल्पना या प्रोटीन सह स्थानीयकरण का आकलन लेबलिंग अनुमति देते हैं. कस्टम फिल्टर बहुत autofluorescence को कम करने और फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के संवेदनशील पता लगाने की अनुमति भी जब क्लोरोफिल मौजूद है. हालांकि, भी germinating बीजपत्र में फ़िल्टर CFP autofluorescence काफी मजबूत करने के लिए लगभग सभी LSM700 उपयोग करते हुए संकेत की दृश्यता रोकता है. एक वर्णक्रमीय unmixing क्षमता के साथ उपकरणों के लिए, fluorophores के एक व्यापक चयन संभव हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Amanda Rychel POLAR :: POLAR-EGFP के निर्माण के लिए समय चूक प्रोटोकॉल और लिन Pillitteri के विकास में सहायता के लिए धन्यवाद. हम भी प्रदान करने बजे आरबी का निर्माण लिए ABRC के लिए आभारी हैं. इस प्रोटोकॉल जापान विज्ञान प्रौद्योगिकी और एजेंसी से PRESTO पुरस्कार से समर्थन के माध्यम से विकसित किया गया था. ध्रुवीय पर अनुसंधान भी वाशिंगटन रॉयल्टी रिसर्च फंड (RRF-4098) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (MCB 0,855,659) के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया. KMP एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलो (डीजीई 0,718,124) है, और KUT एक अन्वेषक HHMI GBMF है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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