Summary
Nous décrivons un protocole utilisant des lames de chambre et des médias pour immobiliser cotylédons des plantes pour l'imagerie confocale de l'épiderme pendant plusieurs jours de développement, la documentation différenciation des stomates. Protéines fluorophore-marqués peuvent être suivis de manière dynamique par l'expression et la localisation subcellulaire, accroître la compréhension de leurs rôles possibles lors de la division cellulaire et la différenciation de type.
Abstract
Imagerie in vivo de la dynamique du comportement cellulaire dans une séquence de développement peut être un outil puissant pour comprendre les mécanismes de structuration des tissus. Au cours du développement animal, la prolifération cellulaire et les événements clés de structuration se produire très rapidement. Par exemple, dans Caenorhabditis elegans toutes les divisions cellulaires nécessaires au plan de corps de la larve sont terminés dans les six heures après la fécondation, avec sept cycles mitotiques 1; les mitoses seize ou plus de l'embryogenèse chez la drosophile se produire en moins de 24 heures 2. En revanche, les divisions cellulaires au cours du développement des plantes est lente, typiquement de l'ordre d'une journée 3,4,5. Cela impose un défi unique et un besoin à long terme imagerie en temps réel pour documenter les comportements dynamiques de la division cellulaire et la différenciation des événements pendant l'organogenèse végétale. Épiderme Arabidopsis est un excellent modèle pour la signalisation de l'enquête, le devenir cellulaire et le développement des plantes. Dans le cotylédon, ce tissu est constitué de cellules d'air et résistant à l'eau des chaussées entrecoupés de stomates uniformément répartie, soupapes qui s'ouvrent et se ferment pour contrôler les échanges gazeux et la perte d'eau. Un espacement correct de ces stomates est essentielle à leur fonction et leur développement suit une séquence de division asymétrique et les étapes de différenciation des cellules pour produire de l'épiderme organisé (Fig. 1).
Ce protocole permet l'observation des cellules et des protéines de l'épiderme pendant plusieurs jours de développement. Ce laps de temps permet une documentation précise des cellules souches divisions et la différenciation des cellules épidermiques, y compris les stomates et des cellules épidermiques de la chaussée. Protéines fluorescentes peuvent être fusionnés à des protéines d'intérêt pour évaluer leur dynamique au cours de la division cellulaire et les processus de différenciation. Cette technique nous permet de comprendre la localisation d'une protéine nouvelle, POLAR 6, pendant la phase de prolifération des cellules de la lignée des stomates en eépiderme cotylédon e Arabidopsis, où il est exprimé dans les cellules précédant les événements de la division asymétrique et se déplace vers une zone caractéristique du cortex cellulaire se produit peu de temps avant la division. Les images peuvent être enregistrées et vidéo simplifié facilement produit en utilisant un logiciel du domaine public de visualiser la localisation des protéines dynamique et types cellulaires comme ils changent au fil du temps.
Protocol
1. La stérilisation des semences
- Préparer la solution de stérilisation des semences: eau de javel 33%, 0,1% de Triton X-100.
- Placer les semences portant souhaité construction rapporteur fluorescent (s) et le génotype (s) dans 1,7 ml tube et appliquer 1 ml de solution de stérilisation. Incuber sur nutator pendant 15 min.
- Dans une hotte stérile, utiliser une pipette pour éliminer la solution de stérilisation du tube, laissant derrière graines. Rincer avec 1 ml d'eau stérile. Répétez quatre fois.
- Incuber à 4 ° C pendant deux jours ou plus.
2. Préparation des diapositives Chambre médias
- Mélanger 20 ml de solution 0,5% de Bacto Agar (pur agarose) dans l'eau dans une fiole jaugée de 200 ml, et à micro-ondes jusqu'à dissolution complète. Soyez prudent lorsque vous la solution à ébullition.
- Refroidir la solution à environ 60 ° C.
- Prélever 1 ml de solution d'agar avec une pipette et appliquer lentement le couvercle en verre à l'intérieur de la chambre de coulissement (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Système lamelle couvre-objet en allemand). Solution which est trop chaud ou appliquée trop rapidement peut faire fondre la colle ou du verre fissure.
- Immédiatement ajouter un deuxième ml solution d'agar. Gélose doit maintenant couvrir complètement le fond de la chambre de coulissement. Ce support minimal est suffisante pour soutenir le développement dans un cotylédon usine, qui contient des nutriments stockés, pendant quatre à cinq jours par le maintien de l'humidité et permettant la diffusion de gaz.
- Laisser refroidir sur une diapositive de table avec chambre à couvert. Si flacon est recouverte hermétiquement, la solution peut être sauvé et réchauffés pour une utilisation future.
3. Dissection semences
- Retirer le tube de semences stériles de 4 ° C de stockage.
- Placez un mouchoir en papier sur la scène d'un microscope à dissection et l'humidifier avec de l'eau. Réglez le tissu pour créer une surface lisse. Le tissu est utilisé pour stabiliser les graines pour la dissection.
- Pipeter 20-30 graines du tube sur le tissu, en prenant soin de les placer dans le champ de la portée dissection de vue.
- En utilisant des pinces pointues (Roboz, n ° 5 pointe biologie), Retirez soigneusement le tégument de l'intérieur des semis. Téguments à la fois extérieur et intérieur doivent être enlevés.
- Quand l'imagerie du cotylédon, il est avantageux de retirer l'hypocotyle et la radicule. Cotylédons contiennent des substances nutritives suffisantes pour développer pendant plusieurs jours en vertu du présent protocole. Si intacte, l'hypocotyle se redresser et allonger considérablement, passant du stade cotylédon hors du champ de vision laps de temps. Utiliser un scalpel pour découper les cotylédons libres de l'hypocotyle.
- Tenir cotylédons disséqués immergés dans l'eau, dans un microtube ou similaire.
- Répéter 3.4 à 3.6 jusqu'à ce que le nombre souhaité de cotylédons est atteinte. 15-20 dissections succès sont recommandées avant le montage.
4. Cotylédons de montage dans la chambre de coulissement
- L'utilisation d'un couvre-petit (18 mm 2), couper à travers les médias d'agar et soulever toute la couche de base en verre jusqu'à la chambre de coulissement du.
- Pipeter disséqué cotylédons avec un minimum d'eau à partir de maintenanttube dans la chambre de coulissement, sous la couche de gélose levée.
- Abaissez doucement la gélose sur les cotylédons. Si l'excès d'eau est présente, la tremper loin avec un tissu, en prenant soin de ne pas déranger les cotylédons. Les échantillons doivent plus se déplacer facilement quand montage est terminé.
- Placer le couvercle sur la diapositive chambre et faites glisser pour déplacer la platine du microscope.
5. Time Lapse d'imagerie
- Mise en place inversée microscope confocal à l'image du fluorophore désiré (s). LSM700 paramètres utilisés: pour la GFP, l'excitation à 488 nm et la collecte avec un filtre passe-bande à 440-530 nm; d'appel d'offres, l'excitation à 555 nm et la collecte avec un filtre passe-bande à 570-610 nm.
- Inspectez spécimens naturalisés pour les dommages. Programmer les emplacements des intact, bien monté cotylédons dans le logiciel de microscope. Dans le Zen 2009: Focus sur un cotylédon avec objectif 20x et objectif déplacer au centre de la chambre de coulissement. Sous Mode d'acquisition, changer Zoom à 0,5 et hauteur d'axe </ Em> à 48x48 pixels. Cochez la case Positions et l'image de synthèse Scan ... bouton sous positions, puis augmenter le nombre de carreaux horizontaux et verticaux à 30-35. Lorsque la numérisation est terminée, cliquez sur le bouton positions sous l'onglet Dimensions et réticule lieu à chaque cotylédon à observer.
- Mettre en place la série z englobant l'épiderme cotylédon de tous Zen samples.In 2009: Cochez la case Z-Stack. Sélectionnez chaque position dans la liste Position, puis cliquez sur le bouton Déplacer vers. Concentrez-vous sur le plan supérieur de l'épiderme des cotylédons et cliquez sur le bouton Set abord sous Z-Stack. Focus sur la position la plus basse à laquelle épiderme est utilement visible et cliquez sur le bouton Set dernier. Cliquez sur le bouton situé à côté optimale, ce qui montre le meilleur z-épaisseur de coupe, à définir. Vérifiez chaque cotylédon à confirmer que ces paramètres englobent tous les échantillons, les paramètres z ne peut pas être réglé pour indivpositions idual en 2009 Zen.
- Mettre en place des séries chronologiques à la résolution souhaitée et la longueur. Intervalles de 15-30 minutes pendant trois jours sont efficaces pour la dynamique des protéines dans la division cellulaire épidermique. Cet intervalle peut être modifié selon les besoins. Dans le Zen 2009: Cliquez sur la case de séries chronologiques. En vertu de séries chronologiques, Cycles mis pour le nombre d'images de votre choix à l'aide du curseur ou en tapant dans le champ de texte. Définition de la fréquence à 30 et utilisez le menu déroulant pour sélectionner min.
- Commencez xyzt multi-position de balayage. Notez que le nombre de postes doit être limitée par les spécifications de numérisation, si le temps de cycle total est supérieur à l'intervalle souhaité, les points dans le temps ne sera pas correcte. Un maximum de six positions simultanées sont possibles lorsque l'imagerie GFP et RFP à 59 z tranches dans un intervalle de 30 min à l'aide de notre système. Dans le Zen 2009: Taille de l'image Changement de la résolution souhaitée, puis cliquez sur Démarrer expérience.
6. Montage vidéo
- A partir du fichier confocal données, effectuez une intensité maximale z-projection de chaque combinaison temps / position et l'exportation sous forme de fichiers image dans un format sans perte comme TIFF. Les noms de fichiers doivent être dans une série par poste (par exemple, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc, ne POLAR-GFP_0001_pos1) pour les logiciels pour les combiner en un film. Dans le Zen 2009: Copie Utilisation: sous-ensemble sous l'onglet Traitement de diviser positions dans des fichiers séparés, puis projection d'intensité maximale. Enfin, l'exportation au format TIFF (fichier Export, pleine fenêtre resolution image - série).
- Utilisez FIDJI 7,8 pour aligner les images successives en exécutant la macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Inscription: bUnwarpJ). Changer le mode d'enregistrement en Mono. Toutes les options avancés peuvent utiliser des valeurs par défaut. Pour les longues séquences laps de temps, téléchargez et installez la macro "Affine + Conformément Inscription élastique image 2D», qui s'appliquera bUnwarpJ à une série d'images automatiquement et ouvert ynos données à l'aide du fichier: Import: Séquence d'images de l'utiliser. Décochez MOPS sites d'extraction et de course.
- Utilisez FIDJI / ImageJ ou Quicktime Pro pour ouvrir la séquence d'images alignées et enregistrer au format vidéo de votre choix (AVI est un bon choix).
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Representative Results
Un ensemble de points dans le temps informatifs recueillies par cette méthode est illustré à la figure 3. Les membranes cellulaires sont étiquetés avec DP (h-rb) et la GFP est fusionnée à la protéine POLAR sous son promoteur natif (POLAR POLAR ::-GFP) 6 A l'échelle de temps de 30 minutes, nous voyons des divisions cellulaires, ainsi que les changements dans la localisation des protéines qui les ont précédés. Divisions cellulaires asymétriques sous la forme lignée des stomates en cellules souches comme précurseurs appelés stomates méristémoïdes, qui conservent la capacité de se diviser encore asymétriques, et leurs cellules sœurs, appelés stomates cellules de lignée sol (SLGCs). SLGCs ne pas assumer un destin précurseur stomatique; ils ont souvent transdifférencier dans les cellules de la chaussée, mais peut reprendre capacité de division asymétrique pour produire un autre meristemoid à distance de la première que la feuille se dilate. Tous ces destins se reflètent dans l'expression et la localisation de POLAR POLAR ::-GFP (Fig. 3, Vidéo 1).
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Figure 1. Schéma du développement des stomates. Cellules Protodermal entrer la lignée des stomates que les cellules mères meristemoid (MMC) dans une étape contrôlée par les facteurs de transcription de base hélice-boucle-hélice SPEECHLESS (SPCH), SCREAM (SCRM), et SCRM2. MMC diviser de manière asymétrique pour produire un meristemoid (M) et la cellule stomatique sol lignée (SLGC); cette étape peut se produire plusieurs fois et fournit un mécanisme par lequel les stomates sont espacées. Le passage de cellules à l'état de la meristemoid à la cellule mère garde (CMG) l'identité est dirigée spécifiquement par le bHLH MUTE ainsi que SCRM / 2. Une finale de division symétrique du GMC et sa différenciation en deux cellules de garde matures (GC) nécessite la FAMA bHLH avec SCRM / 2 10.ig1large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 2. Schéma de la dissection des semences et la procédure de montage. Les graines sont stérilisées et maintenues à 4 ° C, les téguments et les hypocotyles enlevées, et les cotylédons monté sous agar dans une chambre de coulissement pour l'imagerie sur un microscope inversé confocal.
Figure 3. Time-lapse imagerie montre POLAR POLAR :: GFP-localisation distale précédant la division cellulaire asymétrique. Série A: POLAR-GFP apparaît initialement réparti uniformément, puis environ deux heures avant asymétriedivisions triques (têtes de flèche) POLAR-GFP sépare pas de la place de la meristemoid naissante. Série B: Après la première division asymétrique (pointe de flèche), POLAR-GFP disparaît dans les deux cellules, ce qui implique une transition rapide pour garder la cellule mère (GMC) par l'Etat meristemoid. Le GMC (astérisque) divise symétriquement et se différencie pour former des cellules de garde des stomates, tandis que la cellule sœur retrouve POLAR-GFP expression, sans doute présager une division asymétrique tard.
Vidéo 1. Rationalisée, vidéo déposée de POLAR POLAR :: GFP-localisation lors de l'amplification et de l'espacement d'une cellule précurseur stomatique. Initialement, POLAR-GFP soit uniformément dans la cellule; par 39 h après la germination, il polarise fortement, juste avant la division (40.0h) placer un plus petit meristemoid à l'extrémité opposée de la cellule. La plus grande cellule à droite reprend également l'identité lignée stomatique et de 45 h POLAR-GFP localisation se déplace à côté du précurseur stomatique. La division à 47 h produit un meristemoid nouvelle (à droite) orientée à l'opposé de la meristemoid existant (à gauche) de la première. Le résultat final est de deux stomates séparés par une cellule. (Images manquantes de la vidéo n'ont pas été collectées et ne représentent pas des changements significatifs.) Cliquez ici pour voir le film .
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Discussion
Cette technique time-lapse confocale permet des études longitudinales sur l'expression des protéines marquées par fluorescence et la localisation dans des cellules individuelles de l'épiderme cotylédon Arabidopsis, qui dans le cas de la polaire et d'autres protéines changent dynamiquement est essentielle à une bonne compréhension de leur fonction. Auparavant, soutenue laps de temps d'imagerie a été utilisée pour examiner l'infection fongique racine d'Arabidopsis 11 et la croissance du méristème 5,12, mais en y ajoutant l'épiderme cotylédon étend la polyvalence de cette technique et permet son utilisation pour des protéines supplémentaires, en particulier d'aider le domaine en pleine expansion du développement des stomates .
Principale limitation de ce protocole est qu'il est actuellement limitée à cotylédons, qui contiennent les éléments nutritifs dont ils ont besoin pour le développement précoce. En outre, le développement des cotylédons n'est pas exactement identique à celui subi dans l'air parce que le médium gel limite les échanges gazeux. Balayage laser l'exposition et lumières de la salle sont suffisantes pour photomorphogenèse, induire l'expansion des cotylédons et de la maturation des chloroplastes, mais les stomates peuvent parfois se développent en paires adjacentes en raison de CO 2 faible concentration. Cette tendance peut être réduite en utilisant seulement une mince couche de support et de montage minimale de l'eau comme indiqué dans le présent protocole.
Sélection fluorophore est également important pour le succès de cette technique. Les deux GFP et RFP fonctionnent bien et permettent à double étiquetage pour visualiser la périphérie de la cellule ou d'évaluer des protéines co-localisation. Des filtres personnalisés réduire considérablement autofluorescence et permettre une détection sensible des étiquettes protéiques fluorescentes, même lorsque la chlorophylle est présente. Cependant, l'autofluorescence de la PCP, même filtrée dans les cotylédons en germination est suffisamment forte pour empêcher la visibilité de la quasi-totalité du signal avec le LSM700. Pour les appareils avec une capacité de déconvolution spectrale, un plus grand choix de fluorophores peut être faisable.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Amanda Rychel pour l'assistance à l'élaboration du protocole laps de temps et Lynn Pillitteri pour construire POLAR POLAR ::-eGFP. Nous sommes également reconnaissants à ABRC pour fournir le h-rb construire. Ce protocole a été élaboré grâce à un soutien de l'attribution du Japon PRESTO Science Technologie et de l'Agence. La recherche sur POLAR a également été soutenu par l'Université de Washington Banque Research Fund (RRF-4098) et la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP est un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), et KUT est un enquêteur HHMI-GBMF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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