Summary
Nós descrevemos um protocolo com lâminas de câmara e de mídia para imobilizar cotilédones de plantas para imagem confocal da epiderme durante vários dias de desenvolvimento, documentação diferenciação estomática. Proteínas fluoróforo com a tag pode ser monitorado de forma dinâmica por expressão e localização subcelular, aumentando a compreensão de seus possíveis papéis durante a divisão celular e diferenciação do tipo de célula.
Abstract
Imagiologia in vivo na dinâmica do comportamento celular ao longo de uma sequência de desenvolvimento pode ser uma técnica eficaz para a compreensão dos mecanismos da padronização do tecido. Durante o desenvolvimento do animal, a proliferação celular e os eventos chave padronização ocorrer muito rapidamente. Por exemplo, em Caenorhabditis elegans todas as divisões celulares necessários para o plano do corpo larval são concluídas dentro de seis horas após a fertilização, com sete ciclos mitóticos 1; as mitoses 16 ou mais de embriogênese Drosophila ocorrer em menos de 24 horas 2. Em contraste, as divisões celulares durante o desenvolvimento da planta é lenta, tipicamente da ordem de um dia 3,4,5. Isso impõe um desafio único e uma necessidade de longo prazo de imagem ao vivo para documentar comportamentos dinâmicos de divisão celular e diferenciação eventos durante a organogênese planta. Epiderme Arabidopsis é um sistema excelente modelo para sinalização de investigação, o destino de células e desenvolvimento em plantas. No cotilédone, este tecido é constituída por ar e as células resistentes à água do pavimento intercalados com estômatos uniformemente distribuída, válvulas que abrem e fecham para controlar as trocas gasosas e a perda de água. O espaçamento adequado dos estomas estes é crítico para a sua função, e o seu desenvolvimento segue uma sequência de divisão assimétrica e etapas de diferenciação de células da epiderme para produzir organizada (Fig. 1).
Este protocolo permite a observação de células e proteínas na epiderme ao longo de vários dias de desenvolvimento. Este intervalo de tempo permite a documentação precisa de células-tronco divisões e diferenciação das células epidérmicas, incluindo estômatos e células epidérmicas pavimento. As proteínas fluorescentes podem ser fundidos com proteínas de interesse para avaliar a sua dinâmica durante a divisão celular e processos de diferenciação. Esta técnica permite compreender a localização de uma nova proteína, POLAR 6, durante a fase de proliferação de células da linhagem estomática-in the Arabidopsis epiderme cotilédone, onde é expresso em células de eventos anteriores de divisão assimétricos e move-se para uma área característica do córtex célula ocorre pouco antes da divisão. As imagens podem ser registrados e vídeo simplificada facilmente produzida usando o software de domínio público para visualizar localização de proteínas dinâmica e tipos celulares como eles mudam com o tempo.
Protocol
1. Esterilização de sementes
- Preparar a solução de esterilização de sementes: lixívia 33%, 0,1% de Triton X-100.
- Coloque as sementes que transportam construção repórter fluorescente desejada (s) e genótipo (s) em 1,7 ml de tubo e aplicar 1 ml da solução de esterilização. Incubar em Nutator durante 15 min.
- Em um capuz estéril, utilizar uma pipeta para remover a solução de esterilização a partir do tubo, deixando atrás de sementes. Enxágüe com 1 ml de água estéril. Repita quatro vezes.
- Incubar a 4 ° C durante dois dias ou mais.
2. Preparação de slides Câmara Mídia
- Misturar 20 ml de solução a 0,5% de Bacto Agar (agarose não puro) em água, num balão de 200 ml, e de micro-ondas até se dissolver. Seja cauteloso ao ferver a solução.
- Arrefece-se a solução para cerca de 60 ° C.
- Colete 1 ml de solução de agar com um pipetador e lentamente para aplicar a tampa de vidro no interior da câmara de corrediça (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Sistema lamela Alemão). Solução which é muito quente ou muito rapidamente aplicado pode derreter cola ou vidro crack.
- Imediatamente adicionar um segundo ml de solução de agar. Ágar agora deve cobrir completamente o fundo da câmara de slides. Este meio mínimo é suficiente para suportar o desenvolvimento de um dos cotilédones da planta, que contém nutrientes armazenados, durante quatro a cinco dias, mantendo a humidade e permitindo a difusão do gás.
- Slides fresco em bancada com câmara coberta. Se frasco é coberto firmemente, a solução pode ser guardada e reaquecido para uso futuro.
3. Dissecção semente
- Retire o tubo de sementes estéreis a partir de 4 ° C de armazenagem.
- Colocar um tecido de papel sobre a plataforma de um microscópio de dissecação e humedecer com água. Ajustar o tecido para criar uma superfície lisa. O tecido é utilizado para estabilizar as sementes para dissecção.
- Pipetar 20-30 sementes a partir do tubo para o tecido, tendo o cuidado de os colocar no campo do escopo de dissecação da vista.
- Utilizando uma pinça cortantes (Roboz, # 5 ponta biologia), Remova cuidadosamente o casaco de semente de dentro de mudas. Tegumentos exteriores e interiores, tem de ser removido.
- Quando a imagem de cotilédone, é benéfico para remover o hipocótilo e da radícula. Cotilédones contêm nutrientes suficientes para desenvolver por vários dias sob este protocolo. Se intacto, o hipocótilo irá endireitar e alongar de forma dramática, movendo o cotilédone para fora do campo de visão do lapso de tempo. Usar um bisturi para cortar os cotilédones livres do hipocótilo.
- Segurar cotilédones dissecados imersos em água, em um microtubo ou similar.
- Repita 3,4-3,6 até que o número desejado de cotilédones é atingido. 15-20 dissecções de sucesso são recomendados antes da montagem.
4. Os cotilédones de montagem no slide Câmara
- Usando uma lamínula pequeno (18 mm 2), cortou os meios de ágar e levantar toda a camada da base até o slide câmara de vidro.
- Pipetar dissecados cotilédones com um mínimo de água de detertubo dentro da câmara de corrediça, por baixo da camada de agar levantada.
- Abaixe cuidadosamente o agar para os cotilédones. Se o excesso de água está presente, mergulhe-o longe com um lenço de papel, tomando cuidado para não perturbar os cotilédones. As amostras não devem mais se mover facilmente quando montagem está completa.
- Coloque a tampa no slide câmara e slides mudança para estágio do microscópio.
5. Time Lapse imagem
- Configurar microscópio confocal invertido para o fluoróforo imagem desejada (s). LSM700 parâmetros utilizados: para GFP, excitação a 488 nm e de recolha com um filtro passa banda de 440-530 nm; para RFP, excitação a 555 nm e de recolha com um filtro passa banda de 570-610 nm.
- Inspecione espécimes montados por danos. Programar os locais de intacta, devidamente montado cotilédones em software microscópio. No Zen 2009: foco em um cotilédone com 20x objetivo e mover objetivo de centro de slide câmara. Em Modo de Aquisição, mudar o zoom para 0,5 e tamanho </> Em que 48x48 pixels. Selecione Posições caixa e imagem de digitalização visão geral ... botão sob Posições, em seguida, aumentar o número de telha Horizontal e Vertical para 30-35. Quando a digitalização estiver concluída, clique no botão Posições sob a guia Dimensões e mira lugar em cada cotilédone para observar.
- Configure z série abrangendo a epiderme dos cotilédones de tudo Zen samples.In 2009: Clique na caixa Z-Stack. Selecione cada posição em Lista de posição e clique no botão Mover para. Concentre-se no plano mais alto da epiderme dos cotilédones e clique no botão Definir Primeiro sob Z-Stack. Concentre-se na posição mais baixa na qual epiderme é útil visível e clique no botão Definir passado. Clique no botão ao lado Optimal, que mostra melhor a espessura z-slice, para definir. Verifique cada cotilédone para confirmar que essas configurações abranger todas as amostras, os parâmetros z não pode ser definido por indivposições idual em 2009 zen.
- Configure série de tempo na resolução desejada e comprimento. Intervalos de 15-30 min, durante três dias são eficazes para a dinâmica das proteínas na divisão de células da epiderme. Este intervalo pode ser alterado conforme necessário. No Zen 2009: Clique na caixa de Séries Temporais. Sob série de tempo, definir Ciclos para o número de imagens desejadas usando o controle deslizante ou digitando no campo de texto. Definir Intervalo a 30 e use o menu suspenso para selecionar min.
- Comece xyzt verificação multi-posição. Note-se que o número de posições deverá ser limitada pelas especificações de verificação, se o tempo de verificação total é maior do que o intervalo desejado, os pontos de tempo não será correcta. Um máximo de seis posições simultâneas são possíveis quando imagens GFP e RFP em 59 z fatias em um intervalo de 30 min usando nosso sistema. No Zen 2009: Tamanho do Quadro de Mudança para a resolução desejada e clique em Iniciar Experimento.
6. Edição de Vídeo
- A partir do arquivo de dados confocal, faça uma intensidade máxima z projeção de cada combinação de tempo / posição e exportação como arquivos de imagem em um formato sem perdas como TIFF. Os nomes dos arquivos devem estar em uma série por posição (por exemplo, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc, não POLAR-GFP_0001_pos1) para o software para combiná-los em um filme. No Zen 2009: Copiar Uso: Subconjunto sob a guia Processamento de dividir posições em arquivos separados, em seguida, projeção de intensidade máxima. Finalmente, exportar como TIFF (Arquivo: Exportação, janela de imagem Resolução completa - série).
- Use FIJI 7,8 para alinhar imagens sucessivas executando a macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Inscrição: bUnwarpJ). Alterar o modo de registo para Mono. Todas as opções avançadas podem usar valores padrão. Para as seqüências longo lapso de tempo, baixar e instalar o macro "Affine + Registro de imagem consistente elástica 2D", que vai aplicar bUnwarpJ a uma série de imagens automaticamente, e y abertonossos dados usando arquivo: Importar: Seqüência de imagens para usá-lo. Desmarque MOPS extração de pontos de referência e de execução.
- Use FIJI / ImageJ ou QuickTime Pro para abrir a seqüência de imagens alinhadas e salvar no formato de vídeo desejado (AVI é uma boa escolha).
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Representative Results
Um conjunto de pontos de tempo recolhidos informativos com este método é apresentado na Figura 3. As membranas celulares são marcados com RFP (pm-rb) e GFP é fundido com a proteína POLAR sob seu promotor nativo (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Na escala de tempo de 30 min, vemos as divisões celulares, juntamente com as mudanças na localização de proteínas precedendo eles. Assimétricos divisões celulares na forma linhagem estomática em células-tronco como precursores estomatais chamados meristemóides, que retêm a capacidade de sofrer divisões mais assimétricos, e suas células irmãs, chamados de células de linhagem estomatais terra (SLGCs). SLGCs não assuma um destino precursor estomática; eles freqüentemente transdiferenciam em células do pavimento, mas pode retomar a capacidade de divisão assimétrica para produzir outro meristemoid afastada da primeira como a folha se expande. Todos estes destinos são refletidas na expressão e localização de POLAR POLAR ::-GFP (Fig. 3, Vídeo 1).
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Figura 1. Esquemática do desenvolvimento estomática. As células da linhagem protodérmicas entrar estomática como células-mãe meristemoid (MMC) em um passo controlado pelos factores básicos helix-loop-helix transcrição SPEECHLESS (SPCH) SCREAM, (SCRM), e SCRM2. MMCs dividir assimetricamente para produzir um meristemoid (M) e de células de linhagem chão estomática (SLGC); este passo pode ocorrer várias vezes, e fornece um mecanismo pelo qual os estômatos estão espaçadas. A transição de células estado-da meristemoid para a célula mãe guarda (GMC) de identidade é dirigida especificamente pelo bHLH MUTE bem como SCRM / 2. A divisão final simétrico do GMC e sua diferenciação em duas células-guarda maduras (GC) requer a FAMA bHLH com SCRM / 2 10.ig1large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 2. Diagrama de dissecção semente e processo de montagem. As sementes são esterilizadas e mantidas a 4 ° C, as camadas de sementes e hipocótilos removidos, e os cotilédones montado sob meios de agar em um slide câmara para imagens em um microscópio invertido confocal.
Figura 3. Lapso de tempo de imagem demonstra POLAR POLAR ::-GFP localização distal precede a divisão celular assimétrica. Series A: POLAR-GFP aparece inicialmente distribuída uniformemente, em seguida, cerca de duas horas antes de assimetriadivisões tricas (pontas de seta) POLAR-GFP segrega de distância do local do meristemoid incipiente. Série B: Após a divisão inicial assimétrica (ponta de seta), POLAR-GFP desaparece em ambas as células, o que implica uma rápida transição para guardar célula-mãe (GMC) do estado pelo meristemoid. A GMC (asterisco) divide simetricamente e diferencia para formar células guarda estomática, enquanto a célula irmã recupera POLAR-GFP expressão, presumivelmente pressagiando uma divisão posterior assimétrica.
Vídeo 1. Simplificada, vídeo registada da POLAR :: localização GFP-POLAR durante a amplificação e espaçamento de uma célula precursora estomática. Inicialmente, POLAR-GFP apareça uniformemente na célula; por 39 hr após a germinação, a polariza fortemente, pouco antes de uma divisão (40.0h) a colocação de um menor meristemoid na extremidade oposta da célula. Quanto maior a célula à direita também recupera a identidade linhagem estomática, e 45 horas de localização POLAR-GFP se move ao lado do precursor estomática. A divisão em 47 hr produz um novo meristemoid (direito) voltado para longe do meristemoid existente (esquerda) a partir da primeira. O resultado final é de dois estomas separados por uma célula. (Imagens em falta a partir do vídeo não foram coletadas e não representam mudanças significativas.) Clique aqui para ver filme .
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Discussion
Esta técnica de lapso de tempo confocal permite estudos longitudinais de expressão da proteína fluorescente etiquetado e localização em células individuais da epiderme cotilédone Arabidopsis, que, no caso de proteínas e de outros POLARES dinamicamente variáveis é fundamental para uma boa compreensão da sua função. Anteriormente, sustentado de tempo de imagem lapso foi utilizado para examinar a infecção fúngica da raiz de Arabidopsis 11 e meristema 5,12 crescimento, mas a adição da epiderme cotilédone expande a versatilidade desta técnica e permite a sua utilização para proteínas adicionais, particularmente auxiliando o campo de expansão do desenvolvimento estomática .
Principal limitação do protocolo é que ele está restrita a cotilédones, que contêm os nutrientes de que necessitam para o desenvolvimento precoce. Além disso, o desenvolvimento dos cotilédones não é exactamente idêntico ao sofrido no ar, porque o meio de gel restringe as trocas gasosas. Digitalização laexposição Ser e luzes da sala são adequados para fotomorfogênese, induzindo expansão dos cotilédones e maturação de cloroplastos, mas estômatos podem ocasionalmente desenvolver em pares adjacentes devido à baixa concentração de CO 2. Esta tendência pode ser reduzido pelo uso de apenas uma fina camada de água e meios de montagem mínimas, conforme indicado neste protocolo.
Fluoróforo seleção também é importante para o sucesso com esta técnica. Ambos GFP e RFP trabalho bem, e permitir dupla rotulagem para visualizar a periferia celular ou avaliar proteína co-localização. Os filtros personalizados reduzir autofluorescência e permitir a detecção sensível de tags de proteínas fluorescentes, mesmo quando a clorofila está presente. No entanto, autofluorescência PCP, mesmo filtrada em cotilédones germinação é forte o suficiente para impedir a visibilidade de quase todos usando o sinal LSM700. Para instrumentos com uma capacidade desmistura espectral, uma ampla seleção de fluoróforos pode ser viável.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Amanda Rychel de assistência no desenvolvimento do lapso de tempo de protocolo e Lynn Pillitteri para a construção de POLAR :: POLAR-eGFP. Agradecemos também a ABRC para fornecer a pm rb-construir. Este protocolo foi desenvolvido através de um suporte da adjudicação PRESTO do Japão Ciência, Tecnologia e Agência. Pesquisa sobre POLAR também foi apoiado pela Universidade de Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) e da National Science Foundation (MCB-0855659). KMP é um NSF graduação Bolseiro de Investigação (DGE-0718124), e KUT é um investigador HHMI-GBMF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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