Summary
Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.
Abstract
Gelişimsel bir sıra boyunca hücresel davranışı in vivo dinamiği Görüntüleme doku desenlendirme mekaniğini anlamak için güçlü bir teknik olabilir. Hayvan gelişimi sırasında, anahtar hücre çoğalması ve desenlendirme olaylar çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Örneğin, Caenorhabditis elegans larva vücut planı için gerekli tüm hücre bölünmeleri yedi mitotik çevrimleri 1, döllenmeden sonra altı saat içinde tamamlanır; Drosophila embriyo on altı veya daha fazla mitoz az 24 saat 2 görülür. Buna karşılık, bitkisel gelişimi sırasında hücre bölünmesi, genellikle günde bir 3,4,5 düzeni üzerinde, yavaştır. Bu eşsiz bir meydan okuma ve hücre bölünmesi ve bitki organogenez sırasında farklılaşma olayları dinamik davranışları belgelemek için uzun vadeli canlı görüntüleme için bir ihtiyaç yüklemektedir. Arabidopsis Epidermis araştıran sinyalizasyon, hücre kaderinin ve bitkilerin gelişim için mükemmel bir model sistemi. Kotiledon, bu doku oluşur hava ve eşit dağıtılmış stoma serpiştirilmiş suya dayanıklı kaplama hücreleri, vanalar açılır ve gaz değişimi ve su kaybı kontrol yakındır. Bu stoma Uygun aralık kendi işlevi için önemlidir ve onların gelişimi asimetrik bölünme ve organize epidermis (Şekil 1) üretmek için hücre farklılaşması bir dizi adımı izler.
Bu protokol, gelişme birkaç gün boyunca hücreleri ve epidermis içinde proteinlerin gözlem izin verir. Bu zaman çerçevesi kök hücre bölünmeleri ve stoma ve epidermal kaldırım hücreleri de dahil olmak üzere epidermal hücrelerin farklılaşma hassas belgelere sağlar. Floresan proteinleri hücre bölünmesini ve farklılaşmasını işlemleri sırasında dinamik değerlendirmek için ilgi çekici proteinler oluşturacak şekilde eklenebilir. Bu teknik, th stomatal-soy hücrelerinin proliferasyonu aşaması sırasında, bize yeni bir protein, POLAR 6 lokalizasyonu anlamak olanak tanırasimetrik bölünme olayları ve bölünmesi meydana kısa bir süre önce hücre korteksin karakteristik bir alana hamle önceki hücrelerde ifade edilir e Arabidopsis kotiledon epidermis. Görüntüleri kayıt ve akıcı görüntü kolaylıkla zamanla değişebilir gibi dinamik protein lokalizasyonu ve hücre tipleri görselleştirmek için kamuya açık yazılımı kullanılarak üretilebilir.
Protocol
1. Tohum Sterilizasyon
- % 33 ev tipi çamaşır suyu,% 0.1 Triton X-100: Tohum sterilizasyon çözeltisi hazırlayın.
- İstenen flüoresan raportör yapı (lar) ve genotip (ler) 1.7 ml tüp içinde ve sterilizasyon çözeltinin 1 mL'si uygulamak taşıma il tohumlar. 15 dakika nutator inkübe edin.
- Steril bir başlık olarak, geride tohum bırakarak, tüpten sterilizasyon çözüm kaldırmak için bir pipet kullanın. 1 ml steril su ile durulayın. Dört kez tekrarlayın.
- İki veya daha fazla gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
2. Oda Slide Ortam hazırlanması
- Çözünene kadar Bacto bir 200 ml şişeye, su içinde Agar (saf olmayan agaroz), ve mikrodalga% 0.5 çözelti 20 ml karıştırılır. Çözüm kaynar dikkatli olun.
- Yaklaşık 60 ° C ile çözelti soğutulur
- Bir pipet ile agar solüsyonu 1 ml toplayın ve yavaşça odasına slayt (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Almanca coverglass Sistemi) iç cam kapak için geçerlidir. Çözüm which çok sıcak ya da yapıştırıcı veya çatlak cam eritmek olabilir çok hızlı uygulanır.
- Hemen agar çözeltisi bir ikinci ml eklenir. Agar ortamı artık tamamen slayt bölmesinin alt kapsamalıdır. Bu minimal ortam nem korumak ve gaz difüzyon vererek dört ila beş gün için saklanan besin içeren bir bitki kotiledon, in gelişimini desteklemek için yeterlidir.
- Odası ile benchtop Cool slayt kaplıdır. Şişeyi sıkıca kapalı ise, çözümü kaydedilir ve gelecekteki kullanım için ısıtılmış olabilir.
3. Tohum Diseksiyon
- 4 ° C depolama steril tohum borusunu sökün.
- Diseksiyon mikroskop sahnede bir kağıt mendil koyun ve su ile nemlendirin. Pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için doku ayarlayın. Doku diseksiyon için tohum stabilize etmek için kullanılır.
- Tüpten dokuya Pipet 20-30 tohum, görüş diseksiyon kapsamı tarlasında yerleştirmek için dikkatli olmak.
- Keskin forseps (Roboz, # 5 biyoloji ucu) kullanma, Dikkatle fide içeriden çiğit çıkarın. Dış ve iç iki integuments kaldırılması gerekir.
- Zaman görüntüleme kotiledon, bu hipokotil ve radikula kaldırmak için faydalıdır. Kotiledonlar Bu protokol kapsamında birkaç gün geliştirmek için yeterli besinleri içerir. Sağlam olursa, hipokotil görünümünün zaman atlamalı alan kotiledon dışarı taşıyarak, dramatik düzeltin ve uzatacaktır. Hipokotil ücretsiz kotiledon dilim için bir neşter kullanın.
- Bir mikrotüp veya benzeri, suya disseke kotiledon tutun.
- Kotiledon istenen sayıda ulaşılana kadar 3.4-3.6 tekrarlayın. 15-20 başarılı diseksiyonlar montaj yapılması tavsiye edilir.
4. Odası Slayt Montaj Kotiledonlar
- Bir küçük (18 mm 2) kapak kayma, agar besiyerinde kesti ve odasına slayt cam tabanından tüm katmanın yukarı kaldırın kullanma.
- Pipet tutarak suyun minimum kotiledon dissekekaldırdı agar tabakasının altında odasına slayt içine tüp.
- Yavaşça kotiledon üzerine agar indirin. Fazla su varsa, kotiledon rahatsız etmemek için dikkatli olmak, bir doku ile uzak ıslatın. Montaj tamamlandığında numuneler artık kolayca hareket etmelidir.
- Odasına slayt ve mikroskop sahne için hareket slayt kapağı yerleştirin.
5. Time Lapse Görüntüleme
- Görüntü istenen fluorofor (ler) için ters konfokal mikroskop ayarlayın. Kullanılan LSM700 parametreleri: GFP, 440-530 nm'de filtre band pass ile 488 nm ve toplama uyarma; RFP, 570-610 nm'de filtre band pass ile 555 nm ve toplama uyarma için.
- Hasar monte örnekleri inceleyin. Sağlam bir yerleri programlayın, düzgün mikroskop yazılım içine kotiledon monte. Zen 2009 yılında: 20x objektif ile kotiledon odaklanın ve oda slayt merkezine amacı taşımak. Toplama Modu altında, 0.5 Zoom değiştirebilir ve Çerçeve Boyutu <48x48 piksel / em>. Pozisyonlar altında Pozisyonlar onay ve Tarama genel görüntü ... düğmesini seçin, sonra 30-35 Yatay ve Dikey kiremit sayısını artırmak. Tarama tamamlandığında, gözlemlemek için her kotiledon az Boyutlar sekmesinde yer ve crosshair'i altında Pozisyonlar düğmesini tıklatın.
- Tüm samples.In Zen 2009 kotiledon epidermisin kapsayan z serisi ayarlayın: Z-Stack onay kutusunu tıklatın. Görev Listesi altında her bir pozisyon seçin ve düğmesini Taşı tıklayın. Kotiledon epidermisin üst düzlemi odaklanın ve Z-Stack altında Set İlk düğmesini tıklatın. Epidermis yararlı görünür olduğu en düşük konuma Odak ve Set Son düğmesini tıklatın. Ayarlamak için en iyi z-kesit kalınlığı gösteren, Optimal yanındaki düğmesini tıklatın. Bu ayarları tüm örnekleri kapsayacak onaylamak için her kotiledon kontrol edin; z parametreleri indiv için ayarlanamazZen, 2009 yılında idual pozisyonları.
- İstediğiniz çözünürlüğü ve uzunluk zaman serileri ayarlayın. Üç gün için 15-30 dakika aralıklarla epidermal hücre bölünme protein dinamik için etkilidir. Bu aralık gerektiğinde değiştirilebilir. Zen 2009 yılında: Zaman Serisi onay kutusunu tıklatın. Zaman Serisi altında, metin alanına kaymak veya yazarak kullanarak istenen görüntü sayısı için döngüleri ayarlayın. 30 Aralık ayarlayın ve min seçmek için açılan menüyü kullanın.
- Xyzt çok pozisyonlu tarama başlayın. Konumların sayısını tarama özellikleri ile sınırlı olması gerektiğine dikkat ediniz; toplam tarama süresi, istenen aralığından daha büyük olduğu takdirde, zaman noktası doğru olmayacaktır. Görüntüleme GFP ve TTT 59 bir 30 dakikalık aralıklarla z-dilim sistemimiz kullanırken aynı anda altıya pozisyonların maksimum mümkündür. Zen 2009 yılında: Değişim Çerçeve Boyutu istenen çözünürlük ve Başlat Deney tıklatın.
6. Video Düzenleme
- Konfokal veri dosyası itibaren, maksimum yoğunluğu TIFF gibi kayıpsız bir format içinde görüntü dosyaları gibi her zaman / konum birleşimi ve ihracat z-projeksiyon yapmak. Dosya adları, bir film onları birleştirmek için yazılım için pozisyon başına bir dizi (örneğin, POLAR-GFP_0001_pos1, vb, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 değil) olmalıdır. Zen 2009 yılında: Kullanımı: Kopyala ardından ayrı dosyalar Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu içine pozisyonları bölmek İşleme sekmesi altında Altküme. (: - Serisi İhracat, Tam çözünürlüklü görüntü penceresinde Dosya) Nihayet, TIFF gibi ihracat.
- BUnwarpJ makro 9 (: Kayıt: bUnwarpJ Plugins) çalıştırarak ardışık görüntüleri hizalamak için FIJI 7,8 kullanın. Mono Kayıt Modu değiştirin. Tüm Gelişmiş Seçenekler varsayılan değerleri kullanabilirsiniz. Uzun zaman atlamalı dizileri için, indirmek ve kurmak makro "Afin + Tutarlı Elastik 2D Görüntü Kaydı," görüntülerin otomatik olarak bir dizi bUnwarpJ geçerli olacak ve açık yDosya kullanarak bizim veriler: İthalat: kullanmak için Görüntü Sırası. MOPS görülecek ekstraksiyon ve çalışma işaretini kaldırın.
- Hizalanmış görüntüler dizisini açın ve istediğiniz video formatı (AVI iyi bir seçimdir) kaydetmek FIJI / ImageJ veya Quicktime Pro kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem ile elde bilgilendirici zaman noktalarında bir dizi Şekil 3 'de gösterilmiştir. Hücre zarları RFP (pm-rb) ve GFP 30 dk zaman ölçeğinde (POLAR :: POLAR-GFP) onun yerli promotör altında POLAR protein 6 birleşmesini ile etiketlenir, biz protein yerelleştirme değişiklikleri ile birlikte hücre bölünmeleri bakın kendilerinden önceki. Asimetrik hücre stoma soyu şeklinde bölünmeler kök hücre benzeri daha asimetrik bölünme geçmesi yeteneği korumak meristemoids, ve onların kardeş hücreler denir stoma öncüleri, stoma soy toprak hücreleri (SLGCs) denir. SLGCs bir stoma habercisi kaderi kabul etmiyoruz, onlar sık kaldırım hücrelerine transdifferentiate, ama yaprak genişledikçe ilk uzak aralıklı başka meristemoid üretmek için asimetrik bölünme yeteneği devam edebilir. Bu kaderi Tüm POLAR ifade ve yerelleştirme :: POLAR-GFP (Şekil 3, Video 1) yansıtılır.
jove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 1. Stomatal gelişme şematik. Protodermal hücreleri temel bir helix-loop-helix transkripsiyon faktörleri SPEECHLESS (SPCH), ÇIĞLIK (SCRM) ve SCRM2 tarafından kontrol edilen bir adımda meristemoid anne hücreleri olarak stoma soy (MMC) girin. MMC'ler bir meristemoid (M) ve stomatal soy toprak hücre (SLGC) üretmek için asimetrik bölmek; bu aşamada birden fazla defa meydana gelir ve aralıklı olarak yerleştirilmiş olan gözeneklerden bir mekanizma sağlar olabilir. Koruma ana hücre (GMC) ile meristemoid bir hücre kimlik durum geçiş MUTE bHLH hem de SCRM / 2 tarafından spesifik olarak yönlendirilir. Iki olgun bekçi hücreleri içine GMC ve farklılaşma (GC) son bir simetrik bölünme SCRM / 2 10 ile bHLH FAMA gerektirir.ig1large.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Tohum diseksiyonu ve montaj prosedürü Diyagramı. Tohumlar 4 sterilize ve tutulur ° C, tohum kabukları ve hipokotil kaldırılır ve kotiledon ters bir konfokal mikroskop görüntüleme için odasına slayt agar besiyerinde altına monte.
Şekil 3. Time-lapse görüntüleme gösterir POLAR :: asimetrik hücre bölünmesi öncesindeki POLAR-GFP distal lokalizasyon. Seri A: POLAR-GFP başlangıçta yaklaşık iki saat asymme önce, sonra eşit olarak dağıtılır görünürPOLAR-GFP segregatlar uzaklıkta başlayan meristemoid bölgesinden mide tümen (ok başları). Seri B: İlk asimetrik bölünme (ok başı) takiben, POLAR-GFP meristemoid tarafından anne hücre (GMC) devlet korumak için hızlı bir geçiş ima, hem hücre içinde kaybolur. Kardeş hücrenin muhtemelen sonraki bir asimetrik bölünme presaging, POLAR-GFP kavuşur ederken GMC (yıldız), simetrik olarak böler ve stoma bekçi hücreleri oluşturmak için ayırır.
Video 1. Aerodinamik, tek bir stoma prekürsör hücre amplifikasyonu ve aralık sırasında POLAR :: POLAR-GFP localisation kayıtlı video. Başlangıçta, POLAR-GFP hücresinde düzgün görünür; 39 saat ile çimlenme sonrası, kuvvetle kutuplaşır, sadece bir bölümü daha önce (40.0h) hücrenin diğer ucunda küçük bir meristemoid yerleştirerek. Sağdaki büyük hücre de stoma soy kimliği kavuşur, ve 45 tarafından saat POLAR-GFP localisation stoma habercisi bitişik hamle. 47 saatte bölümü ilk varolan meristemoid (solda) uzak odaklı yeni meristemoid (sağda). Sonuçta, bir hücre tarafından ayrılmış olan iki stoma. (Video eksik Görüntüleri tahsil edilemeyen ve önemli değişiklikler temsil etmemektedir.) filmi görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu hızlandırılmış konfokal teknik fluoresan etiketli protein ekspresyonu Kutup ve başka dinamik olarak değişen bir protein halinde kendi işlevini uygun bir anlaşılması için önemli olan Arabidopsis kotiledon epidermis, bireysel hücrelerin içinde lokalizasyon uzunlamasına çalışmalar izin verir. Önceden, sürekli zaman atlamalı görüntüleme Arabidopsis kök mantar enfeksiyonu 11 ve meristem büyüme 5,12 incelemek için kullanılan, ancak kotiledon epidermisin ekleyerek bu tekniğin çok yönlülük genişletiyor ve ek proteinlerin kullanımı sağlar, özellikle stoma kalkınma genişletilmesi alanında yardımcı olmuştur .
Protokolün ana sınırlama şu anda onlar erken gelişme için gerekli besin öğelerini içeren kotiledon, sınırlı olmasıdır. Ayrıca, kotiledon gelişimi jeli orta gaz değişimi kısıtlar nedeniyle havada geçirmiş olduğu için tam olarak aynı değildir. Tarama laser pozlama ve oda ışıkları kotiledon genişleme ve kloroplast olgunlaşması inducing fotomorfojenez için yeterli, ancak stoma bazen düşük CO 2 konsantrasyonu nedeniyle bitişik çiftlerinin gelişebilir. Bu eğilim, bu protokolde belirtildiği şekilde yalnızca bir medya ince tabaka ve minimal montaj su kullanılarak azaltılabilir.
Fluorofor seçimi bu tekniğin başarı için de önemlidir. GFP ve TTT ikisi de iş ve çift hücre periferinde görselleştirmek veya protein ko-lokalizasyonunu değerlendirmek için etiketleme sağlar. Özel filtreler büyük ölçüde otofloresans azaltmak ve klorofil mevcut olsa bile floresan protein etiketler hassas algılama sağlar. Ancak, çimlenme kotiledon bile filtrelenmiş CFP otofloresans LSM700 kullanarak hemen hemen tüm sinyal görünürlüğünü engelleyecek kadar güçlü. Bir spektral Karışmama yeteneği olan aletler için floroforlar daha geniş bir seçim uygun olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz POLAR :: POLAR-eGFP oluşturmak için zaman atlamalı protokolü ve Lynn Pillitteri geliştirmede yardım için Amanda Rychel ederim. Biz de am-rb inşa sağlamak için ABRC minnettarız. Bu protokol, Japonya Bilim Teknoloji ve Kurumu'ndan PRESTO ödülü bir destek ile geliştirilmiştir. POLAR Araştırma ayrıca, Washington Royalty Araştırma Fonu (RRF-4098) ve Ulusal Bilim Vakfı (MCB-0855659) Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. KMP bir NSF Lisansüstü Araştırma Görevlisi (DGE-0718124) ve KUT bir HHMI-GBMF dedektif.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
