Summary
Um método para administrar medicamentos por via intranasal aos ratinhos acordado para o objectivo de atingir o cérebro é descrito. Este método permite doses repetidas durante longos períodos, utilizando a administração intranasal de droga sem anestesia, e nariz ao cérebro de entrega com a exposição sistémica mínima.
Abstract
A administração intranasal é um método de administração de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (SNC). É não-invasiva e permite que as moléculas grandes que não atravessam o acesso barreira sangue-cérebro para o SNC. Drogas são diretamente direcionados para o SNC com a administração intranasal, reduzindo a exposição sistêmica e, portanto, indesejáveis efeitos colaterais sistêmicos 1. Entrega do nariz para o SNC ocorre dentro de minutos ao longo de ambas as vias olfativas e trigeminais neurais através de uma via extracelular e não necessita de fármaco para se ligar a qualquer receptor ou o transporte axonal 2. A administração intranasal é um método amplamente divulgado e está sendo usado em testes clínicos em humanos 3.
A administração intranasal de drogas em modelos animais permite a avaliação inicial de distribuição farmacocinética e eficácia. Com ratos, é possível a administração de drogas para animais acordados (não-anestesiados) numa base regular usando uma especializaçãozou aderência intranasal. Entrega acordado é benéfico, pois permite que a longo prazo a administração crónica sem anestesia, leva menos tempo do que com a anestesia, e pode ser aprendido e feito por muitas pessoas para que as equipes de técnicos números podem grande dose de camundongos em períodos curtos. A eficácia de terapêuticas administradas por via intranasal, desta forma a ratinhos tem sido demonstrada em vários estudos, incluindo insulina em modelos de ratos diabéticos 4-6 e deferoxamina em modelos de ratinho de Alzheimer 7,8.
O aperto intranasal para ratos pode ser aprendido, mas não é fácil e requer prática, habilidade e um aperto preciso de efetivamente entregar drogas para o cérebro e evitar a drenagem para o pulmão e o estômago. Os ratinhos são restringidos à mão usando um scruff modificado na mão não-dominante com o gargalo realizada paralela ao chão, enquanto medicamento é fornecida com uma pipeta utilizando a mão dominante. Ele normalmente leva 3-4 semanas de aclimatação antes de lidar com ratospode ser realizada com este aperto sem uma resposta ao estresse. Nós preparamos este vídeo JoVE para fazer esta técnica administração intranasal mais acessível.
Protocol
1. Aclimatação a manipulação para administração intranasal de Ratos Awake
Introdução
Mice devem ser aclimatados a manipulação por um período de 2-4 semanas antes do início da administração intranasal. Aclimatação a manipulação é importante, pois ajuda a garantir uma posição correta do corpo para a eficácia máxima de entrega de drogas acordado intranasal. Além disso, os ratos que não tenham sido adequadamente acostumados a esse processo pode ter uma reacção grave ansiedade após a administração. Mice deve passar de cerca de 2-3 dias em cada uma das nove passos antes de avançar para o passo seguinte, dependendo de conforto do animal para o manuseamento. O nível de tensão do rato deverá ser utilizado como uma medida do progresso. Isso significa controlar os movimentos do mouse, a quantidade / freqüência de defecação, micção, tremendo, e morder. Se um mouse tem uma resposta de estresse elevado, permanecer nessa etapa antes de avançar para o próximo até que a resposta é reduzido. Uma amostra de aclimatação schedule pode ser visto na Tabela 1. Aclimatação dos ratinhos devem progredir através dos seguintes de uma vez por dia etapas. Executar estes passos mais do que uma vez por dia, em uma tentativa de acelerar a adaptação, não é recomendado.
- Colocar o rato na palma da mão durante um período de dois a três minutos, não mais do que um pé acima da parte superior da gaiola, os animais frequentemente saltar durante este passo de introdução. Se o rato tenta rastejar para fora da mão e até um braço, basta levantar o mouse pela base da cauda e colocá-lo de volta na mão.
- Posicione o mouse na palma da mão por três minutos e pet o animal delicadamente. Pet o mouse direcional da cabeça à cauda, enquanto permite que o animal se movimentar livremente.
- Colocar o rato na palma da mão durante três minutos enquanto massageia atrás das orelhas (levemente beliscar juntos a pele na parte de trás do pescoço, utilizando o polegar e o dedo indicador).
- Segure / lipé o mouse pela nuca de seu pescoço por 30 segundos, deixando o resto do mouse no topo de gaiola por 30 segundos antes de repetir o porão novamente.
- Segure o mouse usando a alça intranasal, que é descrito na seção 2, mas não inverter o animal (completar até o passo 2.4). Segure o animal como este por um período de 30 segundos e solte volta para o topo da gaiola. Repita uma segunda vez, após um período de descanso de um minuto.
- Segure o mouse com o aperto intranasal como descrito na seção 2, incluindo o animal invertendo assim o seu lado ventral é voltado para cima em direção ao teto. Certifique-se de que o pescoço do animal é paralelo ao chão. Mantenha essa posição por 30 segundos. Repita esta uma segunda vez, após um período de descanso de um minuto. Alguns ratos irá resistir a aderência intranasal mais do que os outros, especialmente quando usado pela primeira vez, com inversão no passo na aclimatação. Se o rato se livra das garras, coloque o mouse de volta no topo de gaiola e re-aperto. Repita o re-aperto, se necessário, Mas monitorar o nível de estresse do mouse e devolvê-lo para a jaula, se necessário. Outro factor que pode desempenhar um papel na perda da aderência, neste ponto do processo de aclimatação é inexperiência dos tratadores de animais com a técnica de entrega intranasal.
- Segure o mouse com o aperto intranasal, inverter, momentaneamente colocar uma pipeta com uma ponta de vazio em cada narina, e mantenha a posição por 30 segundos animais. Repita este depois de um período de descanso de um minuto.
- Segure o mouse com o aperto intranasal, invertê-lo, e por via intranasal administrar 6 ul de solução salina no nare esquerda e direita, como descrito na seção 3 (até a etapa 3.7).
- Segurar o rato com o aperto intranasal, invertê-lo, e intranasal administrar 6 ul de solução salina no nare esquerda e para a direita duas vezes colocando o animal de volta no topo de gaiola no meio, como descrito na secção 3.
2. O Punho intranasal para imobilizar Ratos Awake
- Coloque o rato on superior da gaiola.
- Com o polegar eo dedo indicador de sua mão dominante, segure o mouse pela cauda. Usando o seu meio, anel, e os dedos mindinho, levemente fixar a porção inferior do corpo para o topo da gaiola (Figura 1A). Vamos pegar o mouse sobre as barras que você levemente esticar o mouse para fora e melhor pegar a nuca.
- Usando o polegar eo dedo médio da sua mão não-dominante, aperte o mouse firmemente na nuca (excesso de pele) por trás do pescoço e ombros. Puxe a pele frouxa para fazer uma tenda de pele entre as omoplatas (Figura 1B). Tire a pele tanto quanto possível, mas tenha cuidado para não puxar o músculo como isso irá causar desconforto para o mouse. Tenha cuidado para não aplicar muita pressão para caixa torácica do animal ou da coluna vertebral. A pressão excessiva ou puxar da pele pode conduzir à inibição da respiração, em alguns casos.
- Rapidamente coloque o dedo indicador de sua mão não-dominante na cabeça do rato comoperto do nariz quanto possível e puxe a pele (Figura 1C, 1D). Ao mesmo tempo, deslize o polegar e os dedos médios em direção à cabeça para a posição ideal. Idealmente, o rato não deve ser capaz de mover a sua cabeça na vertical ou na horizontal.
- Apesar de manter o controle sobre a nuca, vire o mouse sobre as costas. Trás do rato deve estar na palma da sua mão. Segure firmemente a cauda do rato (perto da base) contra a palma da mão com os últimos dois dedos (anel e mindinho) para estabilizar o mouse, ou você pode envolver seus dedos pela parte inferior do corpo (Figura 1E, 1F).
- Neste ponto, certifique-se de que o pescoço do rato e do queixo são planos e paralelos ao chão. O queixo deve ser próximo de um ângulo de 180 graus, com o gargalo, tanto quanto possível, para ajudar com a administração intranasal. Pequenas alterações na inclinação, pode fazer com que o medicamento para acabar no sítio errado. Verifique se o mouse é capaz de respirar por assistir o abdômen. O sho do mouseuld não ser capaz de se mover, mas deve ser confortável e não em qualquer dor. Se você ver o pescoço do rato e do queixo fazendo um "V", então você precisa re-aperto.
3. Entrega intranasal de Drogas para Ratos Awake
Introdução
Usando o aperto intranasal, cada rato é restringida por duas vezes e mantido com o seu pescoço paralelo ao chão enquanto um volume de 20-30 uL de líquido é administrado. Este volume é seguro e eficaz para os pequenos-grandes ratos, nós normalmente usam 24 ul, e que é descrito neste protocolo. O método acordado intranasal podem ser utilizados em ratinhos de todas as idades, por exemplo, em ratos recém-nascidos para a pesquisa de desenvolvimento neuroscience. Em ratos recém-nascidos, um menor volume total (8 uL) e o tamanho das gotas (1 ul) deve ser utilizado para acomodar o menor volume da cavidade nasal. Droga é normalmente entregue a dois ratos de cada vez, alternando os períodos de repouso para permitir a utilização mais eficaz do tempo e manter ocronograma de n. Set-up vai ser um pouco diferente dependendo se você estiver dosagem ratos alojados em grupo ou ratos alojados individualmente. Com os ratos alojados individualmente, é útil para colocar todos os seus materiais entre as gaiolas para evitar que ratos de cruzar para o topo outra gaiola. Com o grupo de ratos alojados dose, desde que somente gaiola. É importante que cada rato numa gaiola alojados em grupo recebe o mesmo tratamento intranasal, como o potencial de contaminação cruzada de dois tratamentos diferentes existe devido à expulsão de drogas para o ar ou com o contacto com a pele. É altamente recomendável que uma folha de dosagem ser impresso com antecedência, para lembrar os técnicos de trabalhos de tratamento, para registrar todas as notas de gotas perdidas, a nota geral de saúde de cada animal, etc
Passos
- Configure jaulas onde eles deveriam estar para a dosagem, e montou uma estação de dosagem (Figura 2).
- Retire do mouse de gaiola e manter em cima da gaiola durante a dosagem.
- Pegue o mouse usando o aperto intranasal descrito na seção 2.
- Usando sua mão dominante, carregar o pipetador com 6 ul de droga ou veículo. Colocar a ponta da pipeta a cheio perto narina esquerda do rato, geralmente a um ângulo de 45 graus (Figura 1G, 1H). Se você tiver uma solução viscosa que você pode precisar de aumentar o seu ângulo de 90 graus, porque a droga pode correr até o lado da ponta da pipeta em vez de fazer uma gota. Se muito viscoso, limpando a ponta da pipeta com um lenço antes de expelir líquido pode ajudar. Lentamente ejectar a droga para formar uma pequena gota com cerca de metade do volume (3 ul).
- A gotícula deve ser colocado suficientemente perto narina do rato de modo que o rato pode inalar a gota. Imediatamente após o rato inala esta pequena gota, ejectar o resto do medicamento na ponta da pipeta de modo a formar uma outra gotícula pequeno para o rato a inalar através da narina mesmo cerca de 2-3 segundos depois. Não deixe de ver a boca. Se há is qualquer líquido na boca, a queda não torná-lo totalmente no nariz e isso deve ser observado.
- Segure o mouse nesta posição por 15 segundos. É altamente recomendável que um temporizador ser usado para padronizar esta espera 15 seg.
- Repita os passos de 3,3-3,6 para a narina direita. Se as gotas são bufou fora, que a queda deve ser substituído e anotados.
- Posicione o mouse de volta ao topo de sua gaiola por 2 min. Repita o processo inteiro a partir de 2 min. após a entrega da primeira queda. Isto dá o rato quatro gotas de 6 ul de cada, totalizando 24 jul de solução. Uma programação de dosagem de amostra para um ou dois ratos de uma só vez pode ser visto na Tabela 2.
- Depois de o rato recebeu todas as gotas, devolva o mouse para sua gaiola.
4. Técnicas de Manuseio de animais gerais para Aclimatação e administração intranasal de droga para Ratos Awake
Após cada sessão de aclimatação ou administração intranasal, os murganhos devem darnd tratar, tal como uma Cheerio ou semente de girassol descascada, como reforço positivo. Guloseimas são dadas como recompensa e para distraí-los de coçar o nariz, que pode causar ferimentos a si mesmos. Ao trabalhar com ratos alojados em grupo, trata suficientes devem ser descartados para cada rato. Antes de regressar às suas gaiolas animais não deixe de restaurar ninhos para os seus estados originais, a fim de reduzir o stress. No doseamento de animais alojados em grupo, as luvas devem ser mudadas entre a dosagem de gaiolas de modo a não transferir aroma de colónia para colónia gaiola gaiola, uma vez que irá tornar-se agressivo para o outro.
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Representative Results
Existem várias formas de determinar a eficácia de entrega de drogas. O primeiro é para administrar por via intranasal uma tinta, tais como tinta ou India azul de metileno e de visualizar o corante após eutanásia do animal dentro do epitélio olfactivo e depois o cérebro é retirado, entrar no SNC através da placa cribiforme. A segunda é a de medir a droga administrada quer através de uma etiqueta de rádio-marcado ou através de ELISA de detecção da molécula não etiquetada. Um bom exemplo de distribuição de droga no sistema nervoso central depois da administração a ratos despertos podem ser encontrados em Hanson et ai. 2012 7. Esperamos que o bolbo olfactivo e do nervo trigeminal para conter uma concentração elevada do fármaco administrado. Aos 30 minutos após a administração intranasal de 3,65 mmol deferoxamina, as concentrações no nervo trigêmeo e nervo olfativo foram 29 mM e 13 uM, respectivamente. As concentrações de droga será evidente em todas as regiões do cérebro (neste exemplo, um range de 0,6 mM para 4,1 mM foi medida) com maiores concentrações nas zonas que beneficiam de entrada dos nervos olfativos e trigêmeo. Por exemplo, as regiões rostrais do córtex que contêm concentrações mais elevadas do que o caudal do córtex e pons irá conter concentrações mais elevadas do que o mesencéfalo ou medula. Na medula espinal de um gradiente de concentração decrescente de cervical a coluna lombar é geralmente observada (neste exemplo, um gradiente de 1,5 uM a 2,0 uM). A administração intranasal também resulta em elevadas concentrações de fármaco que atingem as meninges e gânglios linfáticos cervicais. A terceira maneira de demonstrar a eficácia de entrega é para medir uma resposta comportamental ou bioquímica à droga administrada. Por exemplo, o tratamento com a deferoxamina intranasal de murganhos transgénicos de Alzheimer resultou na melhoria do desempenho de uma tarefa de memória espacial 7 e fosforilação da cinase de glicogénio sintase 3 beta 9.
| Dia | Ação | |
| 1 | M | Mantenha por 2-3 min ~ |
| 2 | Tu | Mantenha por 2-3 min ~ |
| 3 | W | Segure e pet ~ 2-3 min |
| 4 | Th | Segure e pet ~ 2-3 min |
| 5 | F | Levemente pitada ou nuca |
| 6 | M | Levemente pitada ou nuca |
| 7 | Tu | Scruff e elevador |
| 8 | W | Scruff e elevador |
| 9 | Th | Punho intranasal |
| 10 | F | Punho intranasal |
| 11 | M </ Td> | Intranasal Grip (IN) e Inverter |
| 12 | Tu | Intranasal Grip (IN) e Inverter |
| 13 | W | EM Grip, Invert, coloque ponteira perto nariz |
| 14 | Th | EM Grip, Invert, coloque ponteira perto nariz |
| 15 | F | EM Grip, Invert, entregar uma rodada de soro fisiológico para cada nare |
| 16 | M | EM Grip, Invert, entregar uma rodada de soro fisiológico para cada nare |
| 17 | Tu | EM Grip, Invert, entregar duas rodadas salina para cada nare |
| 18 | W | EM Grip, Invert, entregar duas rodadas salina para cada nare |
Tabela 1. Horário de exemplo para aclimatação ao manuseio para administração intranasal de Ratos acordado.
* A pipeta é carregado uma vez com 6 ul, mas administrado ao rato como 2 x 3 gotas ul.
Tabela 2. Cronograma de amostra para dosagem Um ou dois ratos.
Figura 1. Fotos de diferentes estágios e ângulos de segurando um mouse para entrega intranasal acordado de drogas. 1A) Segure o mouse para baixo firmemente no topo da gaiola com a mão dominante deixando os ombros expostos para segurar a pele. 1B) Use o polegar eo dedo médioda mão não-dominante para agarrar e puxar a pele para trás apenas as omoplatas. 1C) Use o dedo indicador para puxar a pele para trás de entre os olhos para o polegar eo dedo médio (vista frontal). 1D) O mesmo que 1C (lado vista). 1E) Segure o mouse de cabeça para baixo, usando o dedo anelar e / ou mindinho para fixar a base da cauda para a palma da mão. O pescoço do rato deve ser horizontal. 1F) E mesmo que, do outro lado. 1G) Administrar droga com uma pipeta de 20 ul e gel ponta da pipeta de carga. 1H) O mesmo que 1G, close-up.
Figura 2. Uma foto de uma estação de dosagem completa para dois ratos alojados individualmente. Incluem-se as duas gaiolas do rato com uma distância suficiente entre para manter os ratos em separado, uma pipetator com pontas, um recipiente para pontas usadas, um temporizador, folha de dosagem, um tratamento de pós-dosagem (como sementes de girassol ou cheerios), toalhetes sanitários, um pipetador P20 (ou P10), e que a droga a ser entregue.
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Discussion
Este método mostra como os ratos podem ser administradas doses regulares de droga intranasal para atingir o cérebro sem o uso de anestesia. Droga intranasal podem ser entregues para grandes grupos de ratinhos durante longos períodos de tempo com um mínimo de esforço. Um grupo único de até 20 ratinhos por via intranasal podem ser tratados por uma única pessoa, em menos de uma hora. Uma ampla variedade de moléculas, desde pequenas quelantes de ferro para os factores de crescimento para as células estaminais mesenquimais, têm sido demonstrados para rapidamente atingir o sistema nervoso central e que têm demonstrado eficácia em modelos de roedores. Mecanismos propostos de entrega direta do nariz ao cérebro incluem transporte extracelular ao longo dos nervos olfativos e trigêmeo e fluxo de massa dentro dos espaços perivasculares 1,10. A administração intranasal para o SNC é uma técnica particularmente útil porque não só é mais rápido, mas tem como alvo o sistema nervoso central a redução da exposição sistémica. Por exemplo, a administração intranasal da deferoxamina a ratos resultou em 3-19 vezes maior concentrations em regiões do cérebro com concentrações 28 vezes inferiores no sangue 11. Em outro exemplo, a insulina administrada por via intranasal melhora a memória em pacientes com Alzheimer no prazo de 15 min, sem alterar os níveis plasmáticos de insulina ou de glucose 12. Uma vantagem adicional é o não-invasividade das técnicas de entrega intranasal.
Existem várias limitações a este método. Em primeiro lugar, a entrega da droga é limitada a cerca de 20-30 ul de uma única administração, de modo a solubilidade do agente terapêutico irá desempenhar um papel importante na determinação dos limites de dose. Além disso, a formulação do fármaco é importante como factores como o pH e a salinidade pode afectar a entrega. Grandes desvios condições naturais, como pH e salinidade extrema, pode danificar o epitélio respiratório e olfatório de ratos. 13,14 Além disso, administração intranasal de camundongos não anestesiados pode ser difícil de dominar, e pode levar várias semanas de treinamento para intranasais "dosadores "para ser capaz de minimize "quarto cabeça-wiggle" e obter uma dosagem intranasal ideal de drogas. Com a técnica de dosagem incorrecta, a droga pode escorrer para o pulmão ou o estômago, o que pode introduzir variabilidade em droga atinja o cérebro. Sinais de que isso tenha ocorrido são dificuldades respiratórias ou visualização de líquido na boca após a administração. Se possível, é aconselhável limitar novas intranasais "dosadores" para entregar soro fisiológico / veículo para controlar os grupos por várias semanas ou meses antes de serem aprovados para dose droga por instrutores especializados. Finalmente, este método é limitado acordado intranasal a ratinhos, tal como ratos acordados e animais maiores não são tão facilmente agarrada e pode ser excessivamente estressado quando mantida de cabeça para baixo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao HealthPartners Animal Care Institucional e Comitê de Uso do Hospital Regiões.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
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