Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Summary

Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Abstract

Embriyonun hücrelerinin tüm takip soyundan inşa Kader haritalar, dokuların embriyonun her hücre soyundan olduğunu ortaya. Kader haritaları bir organın öncüleri belirlenmesi için ve alt hücrelerinin, normal olarak embriyo bu organ doldurmak hangi gelişim yol ortaya çıkması için çok faydalı olmasına rağmen, bir öncü hücre tüm gelişim potansiyelinin veya göstermektedir mekanizmaları tespit olmayan hangi onun kaderi belirlenir. Hücre kaderinin bağlılığı test etmek için, tek bir deneysel manipülasyon sonrasında ifade olanlarla sağlam embriyonun (kaderi harita) in soyundan bir hücrenin normal repertuarı karşılaştırır. Hücrenin kaderini çevreleyen hücresel ortamı ne olursa olsun (kararlı) sabittir, ya da komşuları tarafından sağlanan dış faktörler tarafından etkilenir? Xenopus embriyosunun kapsamlı kaderi haritaları kullanarak, biz nasıl belirleneceği açıklanmaktadır, izole ve kültür tek klivaj dönemi öncüllerinin blasto denirMeres. Bu yaklaşım bir bu erken hücreler onların komşu hücreleri ile etkileşim gerektiren, sağlam embriyonun normal ortamda elde kaderi kararlıyız, veya sinyaller diğer türlerine maruz kalırsa alternatif kaderi ifade etkilemiş olup olmadığını değerlendirmenizi sağlar.

Introduction

Xenopus laevis embriyoların yumurta mikrocerrahi yaklaşımları izin verecek kadar büyük olduğundan embriyonik hücreler kendilerine özgü kaderi elde hangi mekanizma tanımlamak için yaygın faydalanılmıştır. Her bir hücre, bir iç enerji deposu sağlayan sarısı trombosit açısından zengin hücre içi kaynağı ihtiva eder çünkü Ek olarak, kültür ortamı besin takviyesi için gerek kalmadan dıştan gelişir. ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} - kaderin hücre belirlenir hangi mekanizma ile çalışılması için önemli bir varlık (32-hücre aşamaları den 2) bölünme aşama blastomerlerin kader haritaları kapsamlı bir kümesidir. Bu haritalar, tek bir tanımlanabilir blastomer içine saptanabilir molekülü microinjecting ve dokuların etiketli soyu tarafından doldurulur hangi sonraki gelişimi izlenerek inşa edilmiştir. Embriyoların kardinal eksenleri güvenilir birçok Embry tespit edilebilir, çünkü tutarlı kaderi haritalar mümkündüros. Bitkisel yarımkürede değil iken Öncelikle, tüm yabani tip embriyolar hayvan yarımkürede, pigmentli olduğunu. İkincisi, döllenme de sperm girişini geleceğe ventral tarafta doğru hayvan yarımkürede pigmentasyon bir kasılma neden olur; birçok embriyo bir pigmentasyon farklılığı dolayısıyla dorsal ve ventral taraf arasında ayırımcılık kullanılabilir. Üçüncüsü, ilk bölünme karık böylece orta sagital en embriyolarında düzlem ve embriyonun sağ ve sol taraf tanımlamak için kullanılabilir yaklaşır. Kaderi haritaları da doğal embriyo büyük bir nüfus üzerinde her blastomer tanımlanabilir yapmak düzenli desenler yumurtaları sık çatlatma döllenmiş gerçeğine dayanmaktadır. Içinde tarif ve seçim yöntemleri kullanarak, pigmentasyon ve yarılma desen ile ilgili olarak yumurta kavramalar arasında değişkenlik olsa da, burada belirtilen akibetlerini hücrelerin yaklaşık% 90 doğruluk ile tespit edilmesini sağlar.

Hücre kaderi caydırmak olabilirçeşitli mekanizmalarla embriyogenez sırasında mayınlı. Böyle ayirt kalıtsal sitoplazmik mRNA veya protein gibi içsel faktörler, erken desenlendirme çeşitli yönleri katkıda bulunur. Örneğin, belli mRNA'ların anne hücreleri, mikrop hattı katkı endoderm olmak, ya da vücut dorsal eksen ⁽⁷ te gözden geçirilmiştir) katkı olduğu. Embriyonik bir sinyalizasyon merkezine daha uzak komşu hücreler veya yerel olarak sağlanan dış faktörler, spesifik doku tipleri ve desenlendirme hemen her organ sistemini indükleyen sorumludur. Sinyalizasyon merkezleri örnekleri nöral ektoderm ve desenler mezoderm indükler gastrula içinde organizatör / düğüm ve aktivite kutuplaştırıcı bölgesini içeren ekstremite tomurcuğu modellerini ön-arka eksen. Kader haritalar farklı organların öncüleri belirlemek ve normal embriyo onların torunları tarafından alınan gelişimsel yolu açığa karşın, intrinsik ayırt edemezve bu hücreler üzerinde dışsal etkiler. Onlar da soyundan embriyonun karmaşık sinyal ortamında farklılaştırmak bir hücre, tam gelişim potansiyelini açığa vurmam. Kültür ardından embriyodan hücre alınması ya da 2), yeni bir embriyo konuma) 1 hücre transplantasyonu: İki deneysel yaklaşımlar, hücrenin kaderini intrensek faktörler tarafından belirlenir veya sonradan dış faktörden etkilenen olup olmadığını test edebilirsiniz eksojen sinyallerin yokluğunda.

Hücreler elle ayrılması için yeterince büyük olduğundan hem deneysel yaklaşımlar Xenopus uygulanabilir olmuştur. Örneğin, çok sayıda çalışmalar ^{(7 yorumlanan 8, 9)} kader değişiklikleri test etmek için ana embriyolarda romanı yerlere embriyolar (hücre-hücre etkileşimleri değiştirmek için) veya nakledilen hücrelerin tek hücre sildiniz. Buna ek olarak, embriyonun farklı bölgelerinde hücreleri az sayıda eksplante yılının ikinci yaklaşımı iXenopus embriyo hücrelerinin hücre içi bir besin deposu, yumurta sarısı trombosit ile doldurulmaktadır çünkü dış faktörler yokluğunda indüktif doku etkileşimlerinin aydınlatmak için nto kültür mümkündür. Bu nedenle, kültür ortamının veya besin takviyesi büyüme faktörü olmadan belirli bir tuz ortam içinde bir kaç gün kültive edilebilir. Biz dorsal hayvan blastomer maternal kalıtım mRNA'ların ^{10, 11} bağlı sinir ve dorsal mezodermal dokular üretmek için özerk bir yeteneği var, ve diğerleri 32-hücreli blastomer bu mezoderm özellikleri içsel ve dışsal bilgiler ¹² hem dayanmaktadır gösterdi göstermek için bu yaklaşımı kullanmış . Eksplant olarak kültür hücrelerinin bir avantajı da orta eksplante hücre ^{12, 13, 14} kaderi etkileyebilecek olan hücre-hücre iletişim yolu belirlemek için tanımlanmış sinyal faktörleri ile takviye edilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, bir tane blastomerli pr enjekteendojen mRNA'ların çevirisi önlemek için aşırı ekspres bir gen veya anti-sense oligonükleotidlerle için mRNA ile kültür IOR. Bunlar, kazanç ve kayıp fonksiyon-analizler molekülleri özerk ifade kaderi için gerekli olan belirleyebilirsiniz. Eksplant kaderini analiz etmek için, spesifik hücre tipleri kimlik standart gen ifadesi (örneğin, in situ hibridizasyon, RT-PCR) ve immünohistokimyasal analizleri ile gerçekleştirilebilir. Bu protokol bir embriyonik hücre spesifik dokularda gelişir nasıl düzenleyen içsel ve dışsal mekanizmalar arasındaki ayrım basit ama güçlü bir yol sağlar.

Protocol

1. Aletler, Kültür, Medya ve Yemekleri hazırlanması

1. Alümina aşındırıcı film kullanarak dört forseps Sharpen. Ucu boyutunu izlemek için bir diseksiyon mikroskobu altında yapın. Forseps Bir çift bir back-up durumda bir ipucu işlem sırasında hasarlı olarak hizmet vermektedir. Dört forseps otoklav ve steril bir kap içinde saklayın.
2. Ve filtre sterilize; 500 ml 0,1 X ve 1.0X kültür ortamı her ⁽¹⁵ tarifler ya Marc Modifiye Zil [MMR] veya Modifiye Barth'ın Salin [MBS]) olun. Biz rutin MBS (; 1 mM KCl, 0.7 _mM CaCl2, 1 mM _MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO ₃ 1X = 88 mM NaCI) kullanın. Ay boyunca 14-18 ° C'de depolayın.
3. Kültür ortamı (bir vidalı kapak cam şişede 100 ml 1X besiyerine 2 g elektroforez dereceli agaroz)% 2'lik agaroz çözüm olun. Agaroz çözmek için otoklav. Bu ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanır ve sonraki gerektiğinde agaroz sıvılaştırmak için mikro dalgada edilebilir.
4. Agaroz sıvı iken, bir steril 24 oyuklu kültür plakanın her alt üzerine yaklaşık 0.5 ml dökün. Bu plastik yapışmasını eksplantlar engeller.
5. Agaroz sıvı iken, 02:58 60 mm Petri kapları alt üzerine yaklaşık 2-3 ml dökün ve girdap yavaşça alt kapalı olduğundan emin olun. Bu diseksiyon yemekleri olarak hizmet verecek ve onların membranlar kaldırıldıktan sonra agaroz plastik yapışmasını embriyolar önler.
6. Agaroz soğutuldu ve sertleştikten sonra, alev 6 "Pasteur pipet ucu bir top haline erir ve hafifçe kültür plakasının her bir kuyu içinde agaroz bir yüzey üzerine temas edene dek. Bu sığ bir oyuk oluşturur içine eksplant alınacaktır.
7. 1X steril besiyeri ile kültür plakanın her doldurun.
8. Agaroz soğutulur ve sertleşmiş olduğunda, blastomer ayrılmasını kolaylaştırmak için seyreltilmiş kültür ortamı (0,1 X 0,1 X MMR veya MBS) ile diseksiyon çanak doldurun.

   2. Embriyolar Seçimi

   1. Döllenmiş yumurta elde edilir ve standart protokoller ^15'e göre jöle kat çıkarın. 100 mm Petri kabındaki 0.5x kültür ortamına aktarabilirsiniz.
   2. Embriyoların 2-hücreli aşamaya ulaşmak zaman, ilk bölünme karık ayrı bir çanak içine hayvan yarımkürede hafifçe pigmentli alanı (Şekil 1) bisects o hangi sıralayabilirsiniz. Bu eksplantlar için donör olacaktır. Eksplantlar sahnelemeye kardeş denetimleri olarak hizmet prosedür boyunca donör embriyolar yanında ayrı bir çanak içinde kalan 2 hücreli embriyolar tutun.

   3. Eksplant Hazırlanması

   1. Bir diseksiyon çanak 5-10 embriyolar yerleştirin, ancak bir kerede yalnızca tek bir embriyo üzerinde çalışmak.
   2. Şeffaf zar vitellin görülebilir, böylece ilk embriyo yerleştirin; o embriyonun hayvan kutup yüzeyi üzerinde bir açıklık (boşluk perivitelline) ile ayrılır. Bilenmiş bir kuvvet kullanmaKişinin subdominant taraftan (biri sağ elini ise sol) ps, perivitelline alanın üstünde vitellin membran kavramak. Öte yandan bir bilenmiş forseps kullanarak, ilk forseps ucu yakın membran tutup, yavaşça uzakta membran soyma ters yönde çekin. Hedef hücre zarı çıkarılması sırasında hasar görmesini şekilde kesilerek edilecek olan hücre belli bir mesafede ilk kavrama edin. Bir embriyo dümdüz olacak, çünkü membran kaldırıldı söyleyebilirim.
   3. Subdominant el forseps ile bir komşu hücre tut ve disseke edilecek hücrenin doğrudan temas etmeyecek şekilde bir "kol" olarak bu hücre kullanın. Diğer yandan da forseps ile hafifçe istenen blastomerli uzak kalan komşu hücreler çekin. Aynı kaderi paylaşıyoruz midline hücreleri, hedef varsa, onlar bir çift olarak birlikte çıkartılabilir. Son olarak, "sap" hücreyi teşrih.
   4. Steril olan blastomer (veya blastomer çifti), Pick up, Cam Pasteur pipeti, hava kabarcıkları ve aşırı emme kaçınarak. Pipet hücrenin zarar verebilir keskin kenarları kaldırmak için yangın cilalanmış olabilir, ama rutin olarak bunu yapmayın. Eksplant kültürünü çanak bir çukurda kültür ortamı yüzeyinin altında Pasteur pipet ucu yerleştirin, yavaşça blastomerli çıkarmak. Bu yerçekimi tarafından sığ bir depresyon içine girmelidir. Birden fazla embriyo aynı blastomerli tek bir eksplant olarak kombine edilebilir.
   5. Diseksiyon çanak, tek-tek kalan embriyolar ile bu işlemi tekrarlayın. 10 embriyolar hakkında sonra, diseksiyon çanak hücresel enkaz dolu olacak. Bu durumda, yeni bir diseksiyon çanak değiştirin.
   6. Tüm diseksiyonlar yapıldıktan sonra eksplantlar sığ çöküntü olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yavaşça% 70 etanol ile kurutuldu ve hava içinde sterilize edilmiş bir saç döngü ile depresyon içine itilebilir.
   7. Son diseksiyonu yaklaşık bir saat sonra, enkaz kaldırma surrousteril, cam Pasteur pipeti ile iyileşti eksplantlar nding.
   8. 14-20, Kültür eksplant plaka ° C kardeş, kontrol embriyoları içeren Petri kabı yanında. Kardeş embriyoların blastomer eksplant gelişme aşamasında gösterecektir.

   4. Analiz için Hasat eksplantlar

   1. Kardeşler istenilen gelişim aşaması ulaştığınızda eksplantlar Hasat. Bazı hücreler parçalanır bile bu eksplantlar oldukça iyi hayatta. Kültür bulutlu bir kitle de var ise, bu nedenle, sağlıklı bir eksplant içinde gömülü olup olmadığını belirlemek için bir saç döngüsü veya forseps ile keşfedebilirsiniz.
   2. Bir cam Pasteur pipeti ile kültür çözeltisi küçük bir hacimde eksplantlar Pick up ve hafifçe yapılacak test için uygun bir sabitleştirici veya lizis tamponu içine atmak.

Representative Results

Doğru bir hücre gelişme potansiyelinin değerlendirmek için bu tahlil yeteneği kaderi haritalar ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} göre dışarı doğru blastomerli kesme dayanır. Bu nedenle, daha sonra, Şekil 2'de gösterildiği gibi, normal bölünme desen ile uyumlu Şekil 1 'de gösterildiği gibi, 2 hücreli aşamada doğru pigmentasyon deseni ile embriyolar seçmek çok önemlidir. Kimse onlar gerekli bölünme aşamasına ulaşıncaya kadar kriteri embriyolar gözlemler ve düzensiz dilinimleri gösteren embriyolar dışarı ayıran ise, doğruluğu büyük ölçüde artırıldı. Şekil 2 de gösterildiği gibi, normal dilinimleri genellikle sadece embriyo bir tarafında meydana gelir. Donör hücre "normal" yan kaynaklanıyorsa bu embriyolar vericisi olarak da kullanılabilir. Eğer incelemek niyetinde düzenli bölünme desenleri birçok embriyo olarak yaklaşık beş kat hücre bölünmesi ilerledikçe, tür olarak daha az embriyo bulunur çünkü. Doğal fertilized yumurta in vitro döllenmiş yumurta içinde daha düzenli yarık sahip olma eğilimindedir. Dilinim desenleri yumurtaları tek bir kavrama içinde büyük farklılıklar olmasına rağmen, en az bir 10-20% bir manipülasyon bu tür için yararlı olmasını bekleyebilirsiniz.

Blastomerlerin tek başına ya da küçük gruplar halinde kültüre edilebilir. Blastomer ilk (Şekil 3A) disseke ve iyi kültürü (Şekil 3B, C) ​​transfer edilir, onlar yumuşak ve kırılgandır. Bizim tecrübelerimize göre, hayvan ve ekvatoryal blastomer bitkisel blastomer (Şekil 3C) daha incelemek daha kolay ve kültürü vardır. Küçük oldukları Belki, çünkü onlar aktarmak kolaydır. Onlar da forseps ile çentikli zaman daha hızlı iyileşecek gibi gözükmüyor. Bitkisel hücreleri genellikle parçalanmış zaman onları daha "geçirgen" hale, daha yavaş ve dolayısıyla sitokinez tamamlamak kardeş hücreler sitoplazmik köprüler korumak gibi görünüyor, ve onların hücre zarı hasarına daha kırılgan ve daha kolay.Kültür içinde yaklaşık 1-2 saat sonra, eksplante blastomerli (s) yaklaşık 4 kez bölünmüş ve hasarlı komşu hücreler (Şekil 3D) kalan kalıntıların en dökülür olacaktır. 20 saat sonra, hücreler, küçük sağlam bilyalar (Şekil 3E) oluştururlar. Bazı enkaz gömülü olsa da, çoğu zaman sağlıklı bir kitle (Şekil 3E, sol) bulunabilir.

Eksplantlar küçük olmasına rağmen, bunlar daha sonra bir gen ekspresyonu izlemesini sağlar in situ hibridizasyon gibi daha sık kullanılan hayvan kap eksplantlar bölgesi için işleme hayatta. Şekil 4A gösterilen deneyde, iki dorsal blastomer (D1.1) veya iki ventral blastomer (V1.1) 16-hücreli aşamada diseke edildi ve 14 yaşında 1X MBS kültürlü ° C kardeş embriyoların erken nöral plakayı aşamalarında ulaşıncaya kadar (ST12-13; kesme sonra yaklaşık 20-22 saat). Her numune zigotik nöral plak geni (sox2 ifadesi için test edildi </ Em>) in situ hibridizasyon ile (mavi reaksiyon ürünü). Bu testte nöral plakayı öncüleri olan dorsal hayvan blastomer, çoğunluğu embriyonun diğer bölgelerden ilave sinyal olmadan, yani özerk sox2 ifade edebilirim olduğunu gösteriyor. Sox2 ifade yok bu eksplantlar yanlış diseksiyonu sırasında tespit edilmiş olabilir. Buna karşılık, ventral epidermis, açık sox2 öncüleri olan ventral hayvan blastomerlerin, hiçbiri. Böylece, ventral hayvan blastomer yok ise dorsal hayvan blastomer, nöral doku oluşturmak için içsel bir yeteneğe sahip olduğu sonucuna varıldı. Unutmayın D1.1 eksplantlar bazıları da, dorsal mezoderm oluşumu göstergesi bir morfoloji eIongated var; bunlar blastomer de sağlam embriyonun ³ Notokordun oluşturmak için kaderde olup, eksplant kültür ekspres bir Notokordun işareti protein ^10. Blastomer intrinsik kaderi altere olabilir önceki mRNA'ların mikroenjeksiyon (kazanç fonksiyon-) veya anti-sense morfolino oligonükleotidler (; kaybı fonksiyon-MOs) tarafından d. Şekil 4B, bir anneden ifade sinir geni, foxD5 ^{16, 17,} endojen düzeylerini değiştiren etkisi test edilir. FoxD5 endojen düzeyi V1.1 (alt sıra) 8 hücreli habercisi blastomer içine foxD5 mRNA enjekte ederek artırırken, V1.1 eksplantlar çoğunluğu (st 12-13 kültüre) sox2 dile getirdi. Tersine, FoxD5 endojen düzeyi D1.1 (üst sıra) 8 hücreli habercisi blastomer içine MOs enjeksiyonu ile azaltılabilir zaman, D1.1 sadece birkaç eksplantlar (st 12-13 kültüre) sox2 (karşılaştırmak ifade Şekil 4A üst satır). Bu deneyler foxD5 arasında maternal ifade eden sinirsel bir kaderi elde etmek için dorsal blastomer içsel yeteneği bir rol oynadığını göstermektedir.

ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1. Doğal döllenmiş yumurta 2 hücreli embriyolar Pigmentasyon desenler. İlk bölünme karık bir ok ile gösterilir. A) embriyonun hayvan yarımkürenin hafifçe pigmente bölgede bir hücre (solda) çoğunlukla bulunduğu için, daha sonraki aşamalarda blastomer tanımlamak için kullanılmaması gerektiğini bir embriyo bir örnek. İlk bölünme karık embriyonun orta sagital düzlem öngörür yana, bu embriyonun hafifçe pigmentli bölgede dorsal tespit olmayacaktır. B) embriyoların iki örnek olduğunu eksplant kültürleri tasnif edilmelidir. Her ikisinde de, hayvan yarıküre (*) arasında hafif renkli bölge birinci bölünme karık örtülmüş edilir. Soldaki ilk embriyo hücre döngüsünün başında, ve hafif renkli bölge, hücre yüzeyinde yaklaşık% 25 olarak görülebilir. Sağdaki embriyonun ilk hücrenin döngüsünün sonuna yaklaştığını ve pigment ve taşındıntrally böylece iki hücre dorsal yarısının daha hafiftir. Sonuç olarak, daha sonraki aşamalarda hafifçe pigmentli hayvan hücreleri dorsal (d) tahmin edecektir ve koyu pigmentli hayvan hücreleri (v) ventral tahmin edecektir.

Şekil 2. Doğal döllenmiş yumurtalardan bölünme aşamasında embriyo örnekleri. Tüm embriyolar üst dorsal okuyucu, bakan hayvan kutup odaklı. A) 4-hücreli embriyo. Dilinim sığ oluklar böylece soldaki embriyo sadece ikinci hücre döngüsü girmiştir. Bölünme derin ve hücrelerin daha yuvarlak görünmesini oluklar yüzden sağda embriyo neredeyse ikinci hücre döngüsünü tamamladı. Siyah oklar ilk bölünme karık gelin ve kırmızı oklar ikinci bölünme karık işaret. B) 8 hücreli embriyolar. Soldaki embriyonun erken üçüncü hücre döngüsü olduğunu ve sağdaki embriyo yakınÜçüncü hücre döngüsünün sonu. C) 16-hücreli embriyo. C 'kaçınılması gereken düzensiz yarılmış bir örnektir. C "ön yüzünde düzenli yarılmış bir örnek, ancak sırt tarafında düzensiz. C'' 'sırt tarafında daha düzenli yarılmış bir örnek, ancak ön yüzünde. C'''' bir örnektir orta hatta normal yarık arasında, ancak yanal. D) 32-hücreli embriyo. D "ön yüzünde düzenli yarılmış bir örnek, ancak sırt tarafında düzensiz. D'' sırt üzerinde düzenli yarılmış bir örnektir yan, ancak ventral tarafta. D'' 'sağ tarafta düzenli dilinimleri bir örnektir, ama sol tarafta daha düzensiz bölünmelere. E) 64 hücreli embriyo. Bu aşamaların şematik için, bakınız (on-line bulunabilir Nieuwkoop ve Faber evreleme serisi, http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).

Şekil 3. Doğal döllenmiş yumurtalardan 16-hücreli embriyo gelen Eksplantlarından. Kısa diseksiyon sonrası A) ventral hayvan blastomer. Ok "sap" hücre kalıntıları gösterir. B) Bir ventral hayvan blastomer kez bölünmüş bir kültürün de aktarılır. Kısa bir süre sonra diseksiyon C) A ventral bitkisel blastomer. Hayvan blastomer ile karşılaştırıldığında, bu büyük ve manipüle etmek daha zordur. D) İki ventral hayvan blastomer eksplantlar, diseksiyon sonrası 2 saat, dört kez bölünmüş var. Sol eksplant blastomerli orijinal pigmentli, dış yüzeyinden görülmektedir; doğru eksplant blastomerli orijinal, unpigmented iç yüzeyinden görüntülenmektedir. E) İki ventral hayvan blastomer eksplantlar 24 saat süreyle kültüre. Sağ eksplant herhangi detritus ücretsiz iken sol eksplant hücresel enkaz (oklar) bir yatakta oturuyor. Tüm görüntüler 50X Magnificat altındadıriyon.

Şekil 4. Doğal döllenmiş yumurta diseke 16-hücreli blastomer türetilen eksplantlar gen ifadesinin situ hibridizasyon analizi. A. Soldaki 16 hücreli embriyo sonuçlar için eksplante edildi dorsal blastomer çifti (D1.1) göstermektedir üst satır ve alt satırında sonuçları için eksplante edilmiştir ventral blastomer çifti (V1.1). Uninjected embriyolardan Dissected blastomerli çiftleri kültür kuyularının içinde 0,1 X MBS yerleştirilmiş ve yaklaşık 20 saat süreyle 14 ° C'de inkübe edildi. Onlar sabitleştirici bir tüpte toplanır ve bir zigotik nöral gen, sox2 ifadesi için in situ hibridizasyon tarafından işlenir. 8-hücreli dönem embriyoların B. blastomer bilateral ya enjekte edildi edildiventral blastomerlerin endojen ekspresyonu artırmak için dorsal blastomerlerin, ya da foxD5 mRNA ile endojen ifade azaltmak için foxD5 MOS, ile. Enjekte edilen embriyolar 16 hücreli evre (20-30 dakika sonra) ulaştığı zaman, blastomer çiftleri A gibi in situ hibridizasyon tarafından disseke kültüre ve analiz edildi. Ekspres sox2 anlamlı foxD5 MOs (Bir üst satıra karşılaştırın) enjekte edildi D1.1 eksplantlar azalmış olduğu eksplant sayısı. Ekspres sox2 anlamlı foxD5 mRNA (A alt satır karşılaştırmak) enjekte edildi V1.1 eksplantlar arttığı eksplant sayısı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Bireysel blastomer başarılı yetiştiricilik için en kritik adımlar şunlardır: 1) doğru ilgi blastomer belirlemek; gerekli manuel geliştirilmesi ve 4), steril, sağlıklı kültürü koruyarak 2), 3) hücre döngüsünün doğru kısmında diseksiyon hücreleri Diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek ve iyi kültürünü aktarmak becerisi.

Belirli blastomer işlemek için, kardinal eksenler tespit edebilmek için gereklidir. Xenopus embriyolarda, sırt tarafında üç yöntem ile belirlenebilir:, (2) in vitro boşaltma döllenmiş yumurta ve bir taraftan ^{18, 19} işaretleme, (1) bir boya hayati ^{18, 19} ile sperm giriş noktası işaretleme ya da (3) birinci bölünme karık hayvan yarımküre ^{20, 21} içinde hafif renkli bölge ikiye böler olan 2-hücre aşaması sırasında embriyolar seçilmesi. Biz doğru doğal fertiliz gelen blastomer tanımlayan üçüncü yöntemini kullanabilirsinized 16-hücreli durumlarda ^{20, 21} yaklaşık% 90'ında embriyo. Döllenme anda, hayvan yarımkürede pigmentasyon dorsal hayvan bölgenin embriyoların çoğunluğu (Şekil 1) daha az pigmente olmasına neden olan ventral tarafta sperm giriş noktasına doğru kasılmaya başlar. Kavramalar genelinde ve hatta Xenopus yumurta kavramalar içinde bu hafifçe pigmentli bölgenin ölçüde önemli farklılıklar vardır. Birinci bölünme karık eşit olarak iki yavru hücreleri arasındaki bu açık alan ikiye böler, daha sonra daha açık bir alan sırt tarafında bir göstergesi olarak kullanılabilir, ve birinci bölünme karık orta sagital gösterir ki. İlk bölünme karık bir karanlık hücre ve bir ışık hücreye kızları ayıran ise daha sonraki aşamalarda pigmentasyon doğru dorsal tarafına tespit olmaz çünkü, eksplant için bunu kullanmıyorum. Önceki çalışmalar, embriyolar, bu tür bir ilk bölünme karık t için bir işaretleyici den az olduğu görüldühafifçe pigmentli bölgede ise o mid-sagital düzlemde artık sırt tarafında ^{20, 21} gösterilir. Birinci ve ikinci bitkisel kutupta oluklar zaman embriyolar aynı zamanda hücre bölünme 4-(Şekil 2B, sol embriyo) 'nin ilk bölümünde seçilebilir yine de ayırt edici olabilir; birinci tam karık olması ve ikinci karık değil Henüz tamamlayın. Bununla birlikte, bir embriyolar (Şekil 2B'de doğru embriyo) seçmek üzere 4-hücreli evre sonuna kadar bekler ise, birinci ve ikinci yarılma artık ayırt edilebilen çizilerde ve yaklaşık olarak hafifçe pigmentli hücrelere sırt de görülebilir ^{embriyolar, 20, 21} ve 70%. Bu çok daha az hassas belirli blastomer hedefleme verecek. Bu, ilk olarak bölünme karık hafif renkli bölge ikiye böler olan embriyoların yüzde kavramalar arasında büyük bir farklılık olduğunu belirtmek gerekir. Bizim tecrübelerimize göre onlar 80 <bir debriyaj yumurtaların% 50> açıklayabilirizBurada bir kavrama olarak yumurtaların%. Ne olursa olsun, hemen her zaman bir eksplant denemeyi desteklemek için bu ölçütü karşılayacak sağlıklı yumurtası içinde yeterli yumurta vardır.

Önerilen iki kültür ortamı (MMR, MBS) neredeyse birbirinin yerine, farklı laboratuvarları tercihleri ​​çok tarihsel vardır. MMR bir yıl veya daha uzun bir 10X çözüm olarak saklanabilir. Bu bikarbonat ile tamponlanmış olmasıdır MBS kısa bir raf ömrüne sahiptir. Embriyo ve eksplantlar koruyucu jöle ve vitellin zarı olmadan bakteriyel enfeksiyon yenik düşer Çünkü, forseps ve kültür ortamı steril olmalıdır. Eksplantlar iyi hayatta yoksa, antibiyotik kültür ortamı (örneğin,% 0.1 gentamisin) ilave edilebilir. Gentamisin ve böylelikle kısa depolama ömrü var ve içeren Çözümleri onlar kullanılacak gün taze yapılmalıdır. Hücresel enkaz korumasız eksplantlar zarar verecektir proteazlar içeren ve bakteriyel büyümeyi destekler. Bu nedenle, bu remo olmalıdıreksplantlar iyileşmek için bir şans vardı sonra kültür kuyulardan ved.

Blastomerlerin diseksiyonlar hücre-hücre adezyon gücünü azaltmak için seyreltilmiş kültür vasatı (0,1 X MBS ya da 0,1 X KKK) içinde gerçekleştirilir. Xenopus bölünme aşamalar sırasında, hücre yapışma çoğunlukla calcium-/magnesium-dependent kaderinler gerçekleştirilir. Bu nedenle, enzimatik ayrışma kullanmak gerekli değildir, kader tayin olaylarda önemli olabilir yüzey proteinleri kaldırır çünkü aslında bu kaçınılmalıdır. Yumurta farklı serilerden embriyonik hücreler farklı güçleri ile bağlı olduğundan, diseksiyon orta seyreltme ad hoc olarak ayarlanması gerekebilir. Hücreleri onları yırtmadan teşrih için çok yapışık ise, 0,1 X dan aşamalı diseksiyon orta konsantrasyonunu düşürmektedir. Hücreler vitellin zar çıkarıldığında çökmeye ve çok sızdıran ise tersine, dissectio konsantrasyonunu arttırmakkademeli n orta. Hücre kültürü kuyuları aktarmak için çok kırılgan hale Ancak, calcium-/magnesium-free ortam kullanmayın. Hücre döngüsü sırasında bir teşrih gerçekleştirdiğinde blastomerlerin başarılı bir şekilde ayrılması da bağlıdır. Şekil 2 'de gösterildiği üzere, ilk olarak hücre döngüsü bölünme oluklar sığ ve blastomerlerin düzleştirilir. Daha sonra döngüsünde dilinim oluklar derin ve hücreler daha yuvarlanır. Erken hücre döngüsü, kırık varsa sitoplazmik sızıntıya neden olur sitoplazmik köprüler vardır. Bu yüzden, hücreler daha kolay bir şekilde hücre döngüsünün sonunda disseke edilir. Her aşamasında 4 hücreli embriyo 8 hücreli embriyo ve bitkisel hücrelerin sitoplazmik köprüler uzun sürüyorsa, çünkü incelemek zordur. Bir makul bir örneklem büyüklüğü kurtarmak daha diseksiyonları gerçekleştirmek için bir ihtiyaç, yani bu eksplantlar için yüksek bir ölüm oranı tahmin edebilirsiniz. Bir disse başlamak için sonraki bölünme karık başlangıcına kadar bekleyebilirsitoplazmik köprüler kapalı olmasını sağlamak için bu hücreler şeklinde gösterilmektedir. Tek blastomer 8 alınan ederken - ve 16-hücreli embriyo bizim deneyim, kültür de hayatta yaşlı blastomer az iyi tek hücre şeklinde geridedir. Biz bunun nedenini bilmiyorum rağmen, eski blastomer eksplant hayatta tek bir kültürü de ^{10, 13, 14,} farklı embriyolar ve kültür onlardan aynı blastomer arasında (2-6) birkaç diseksiyon tarafından geliştirilebilir.

Bu prosedür, uygulama ve bazı el becerisi gerektirir. Dilinimleri arasındaki zaman sıcaklığa bağlı olduğundan, bölünme yavaşlatmak ve daha fazla zaman diseksiyonları gerçekleştirmesine izin vermek için 14-16 ° C'de embriyo saklamak için uygundur. Ancak, embriyo 14 ° C'den düşük sıcaklıklarda tolere etmeyeceğini Bu prosedürde ilk zorluk vitellin membran kaldırıyor. Bunun ilk adımı hakim kadar blastomer diseksiyonu geçmek için iyi değildir. Diseksiyon zamanblastomer dışarı, "sap" hücre sızıntısı ve çökmeye muhtemeldir. Kez tüm diğer hücrelere istenilen hücreden soyulur, çünkü bu bir endişe değil, "sap" hücre forseps ile kaldırılabilir. Blastomerli (Şekil 3B) da kültür transfer olduğunda sap hücre kalıntıları gibi diğer artıkları genellikle uzağa düşer. Blastomer plastik heyecanla sopa, bu yüzden onlara aktarmak için yalnızca cam pipetler kullanın. Bu pipet içinde kesme kuvvetlerinden parçalanır, çünkü hücre üzerinde minimal emme basıncı kullanın. Ayrıca, pipet içinde hava kabarcıkları önlemek ve bir hava-su ara temas halinde hücreleri patlar, çünkü eksplant atılır zaman pipet ucu altında kültür ortamı yüzeyinde olduğundan emin olun.

Protokolü Burada yetiştiricilik için eksplantlar ve basit tuz medya için bağışçı olarak ayarlanmamış embriyolar kullanır nitelendirdi. Bunlar bir ifade için eksplant içsel yeteneğini test etmek için izinÖzellikle kaderi ess. Bu yöntem, deneysel olarak iki şekilde genişletilebilir. İlk olarak, kültür ortamı, bu moleküllerin eksplant alternatif kaderi ifade neden olup olmadığını test etmek için sinyal / büyüme faktörleri ile takviye edilebilir. İkincisi, donör embriyoların gen ekspresyonu önceki blastomer diseksiyon özgü öncülerine mRNA'ların (kazanç fonksiyon-) veya anti-sense morfolino oligonükleotidler (kayıp fonksiyon-) ya da enjekte edilerek değiştirilebilir. Bu 1-hücreli aşamada, ya da öncesinde diseksiyonu 1-2 hücre bölünmeleri bir daha hedefli bir şekilde yapılabilir. Bu yaklaşımlar ile, bir belirli bir dışsal gen verilen alternatif bir kader elde etmek için bir blastomerli neden olan ya da belirli bir endojen gen (örn., Şekil 4B) otonom kader ifade etmek blastomerli için gerekli olup olmadığını olup olmadığını test edebilir. Onlar diğer hücrelerin karıştırıcı etkisini ortadan kaldırmak ve ce sinyalizasyon çünkü bu güçlü deneysel yaklaşımlar bulunmaktadırnters sağlam embriyonun mevcut.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use