Summary

Порядок Decellularization свиного сердца, ретроградная коронарная перфузия

Published: December 06, 2012
doi:

Summary

Метод для быстрого и полного удаления клеточных компонентов из сердца свиньи нетронутым через ретроградной перфузии описано. Этот метод дает конкретного участка сердечной внеклеточного матрикса леса, который имеет потенциал для использования в различных клинических применений.

Abstract

Перфузии на основе целого decellularization орган недавно получил интерес в области тканевой инженерии в качестве средства для создания конкретных участков леса внеклеточной матрицы, в то время как в значительной степени сохранение родного архитектуры на эшафот. На сегодняшний день, данный подход был использован в различных системах органов, включая сердце, легкие, печень и 1-5. Предыдущие методы decellularization для тканей, не легко доступны сосудистой сети, сделали ставку на длительном воздействии ткани для решения моющих средств, кислот, или ферментативного лечения в качестве средства для удаления клеточных и ядерных компонентов из окружающей внеклеточной среды 6-8. Однако эффективность этих методов навесной на способность решения проникать в ткани с помощью диффузии. В отличие от перфузии органов через естественные сосудистой системы эффективно уменьшить расстояние диффузии и способствовали перевозки decellularizatiна веществ в тканях и клеточных компонентов из ткани. Здесь мы опишем метод, чтобы полностью decellularize нетронутыми сердца свиньи через коронарные ретроградной перфузии. Протокол дали полностью decellularized сердечной внеклеточного матрикса (С-ECM) эшафот с трехмерной структурой сердце нетронутой. Наш метод использовался ряд ферментов, моющих средств, и кислоты в сочетании с гипертонической и гипотонической полоскания, чтобы помочь в лизис и удаление клеток. Протокол, используемый раствор трипсина чтобы отделить клетки от матрицы следует Triton X-100 и натрий решения дезоксихолата, чтобы помочь в удалении клеточного материала. Описанный протокол также использует перфузии скоростью более 2 л / мин в течение длительных периодов времени. Высокая скорость потока, в сочетании с решением изменения позволили транспортных агентов в тканях без загрязнения клеточных обломков и обеспечить эффективное полоскание тканей. Описанный способ удалить все ядерные материалы от Нативе свиного сердечной ткани, создавая сайт-специфической сердечной ECM эшафот, которые могут быть использованы для различных применений.

Protocol

1. Подготовка ткани и настройки эксперимента Урожай свиного орган сразу же после эвтаназии от объекта бойне или научно-исследовательских и смыть избыток крови. Обрежьте сердце лишний жир и ткани, сохраняя предсердия и аорты без изменений. Обрежьте жир для отделения легочной арте?…

Representative Results

Эффект decellularization по всем сердцем свиньи, естественно, варьируется из-за различий в размерах, давления и судно договоренности. Таким образом, точный состав производного внеклеточной матрицы леса не будет таким же, от сердца к сердцу. Завершения описанных протокола даст сердца, которая п?…

Discussion

Данное исследование описано методология последовательной и эффективной decellularization из свиного сердца. Протокол был модификацией ранее опубликованного отчета 1, и включить больше воздействием потока и повышения давления, в котором содержится более воспроизводимые результаты. Пол…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы выразить признательность Броган гостей, Мишель Уивер и Кристен Липперт. Финансирование для этого исследования был предоставлен грант NIH R03EB009237, а также обучение грантов NIH T32EB001026-06 от Национального Института биомедицинской визуализации и биоинженерии и T32HL076124-05.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
Trypsin Gibco 15090
EDTA Fisher BP120-500
NaN3 Sigma S2002-500G
Triton X-100 Sigma X100-1L
10X PBS Fisher BP399-20
Sodium Deoxycholate Sigma D6750-500G
Peracetic Acid Pfaltz and Bauer P05020 35% CAS# 79-21-0
Ethanol Pharmco 111000200
Masterflex Pump Drive Cole Parmer SI-07524-50
Masterflex Tubing Cole Parmer 96400-18 Size 18
Barbed Reducer Cole Parmer EW-30612-20
4L Beaker Fisher Scientific 02-540T

References

  1. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
  2. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
  3. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  4. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
  5. Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
  6. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
  7. Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
  8. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
  9. Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
  10. Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model–generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
  11. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
  12. Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
  13. Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
  14. Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).

Play Video

Cite This Article
Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion. J. Vis. Exp. (70), e50059, doi:10.3791/50059 (2012).

View Video