Summary
的方法来分析半胱氨酸残基的巯基的溶剂可及
Abstract
病毒特性和物理化学和物理特性的模仿和开发持有世界上一些最紧迫的挑战提供解决方案的承诺。前所未有的范围和种类，加上有趣的特性的病毒可能给病毒为基础的技术的应用带来无穷的机遇。病毒有标注自组装成离散形状和大小，对称的特异性，多价，并稳定的特性在宽范围的温度和pH条件下的颗粒。毫不奇怪的是，这样一个显着的性能范围，病毒被建议使用的生物材料，疫苗，14，15，电子化学材料，工具和分子电子容器4，5，10，11，16，18，12。
为了利用纳米技术的病毒，他们必须修改其自然的形式注入新的功能。这一具有挑战性的公关ocess可以通过几种机制，包括遗传修饰的病毒基因组和化学外国或期望的分子附着到病毒颗粒的反应性基团8执行。修改病毒的能力主要取决于病毒的理化性质和物理性质。此外，在遗传或理化修改需要被执行，而不会不利地影响该病毒的天然结构和病毒的功能。 玉米rayado菲诺的病毒 （MRFV）外壳蛋白的自组装生产稳定和空的病毒样颗粒是稳定的蛋白质-蛋白质在大肠杆菌中的相互作用，这可用于在病毒为基础的技术的应用程序8。在烟草植物中产生的VLPs检查作为支架的多种肽可以通过共价键显示13。这里，我们描述的步骤1）确定的溶剂可在病毒衣壳的半胱氨酸可用于修饰的BIOCONJUGATE肽的阳离子，和2）的变形的衣壳。通过使用天然的或突变体插入的氨基酸残基和标准耦合技术，有各种各样的材料被植物如， 雀麦花叶病毒 3， 康乃馨斑驳病毒 12， 豇豆褪绿斑驳病毒 6， 烟草花叶病毒的表面上显示病毒 17， 芜菁黄花叶病毒 ，和MRFV 13。
Protocol
1。从烟草植物的病毒接种，病毒颗粒的纯化
- 生产马铃薯X病毒 （PVX）载体质粒携带的上限从T7 RNA的转录：MRFV野生型（WT）和半胱氨酸突变外壳蛋白基因（CP）12，使用Ambion公司的的T7-mMessage mMachine。
- 对于每个T7转录反应，接种两个完全展开的叶片，N.本生烟用10μl反应孵育10天的植物在温室中，在湿度60％，16小时的光（25,000-30,000勒克斯），在25℃，在20℃下8小时黑暗
- 收割机吨本生叶病毒感染后10天接种点数（dpi），衡量植物组织（50克），置于冰上。
- 均质在掺混机中在存在下，100毫升的冷冻溶液的0.5M的Na-柠檬酸盐缓冲液，pH值5.5（用2毫升缓冲液每克植物组织）中的植物材料。
- 过滤匀浆通过3层cheeseclOTH和以27,000 xg离心30分钟，通过离心澄清。将上清液转移到一个冷冻量筒，测量体积，然后将其转移到冷冻无菌烧杯。弃沉淀。
- 处理该上清液，加入10％聚乙二醇8000（PEG 8000），在4℃下搅拌15分钟，并孵育45分钟，在4℃沉淀的病毒样颗粒（VLPs）-PEG矩阵。
- 离心样品在4℃下以27,000 xg离心20分钟，除去上清液。
- 加入8毫升的0.05M的Na-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.5，含有2％的Triton X-100处理该沉淀。涡流离心管以及释放颗粒。颗粒和缓冲器传输冷藏的无菌烧杯中。冲洗管，立即用2毫升的相同的缓冲液中，并添加至烧杯中。搅拌的悬浮液在4℃，直到颗粒被溶解（通常为1小时）。
- 澄清，通过离心分离，以27,000 xg离心5分钟，弃沉淀，和process通过离心的上清液在140,000 xg离心2小时，在4℃下
- 将沉淀重悬于1毫升0.05M的钠 - 柠檬酸盐缓冲液，pH值为5.5，并在0.05M的Na-柠檬酸盐缓冲液，pH值5.5的10-40％的蔗糖梯度的悬浮液放置在顶部。
- 3小时梯度离心140000 XG在4°C。
- 照亮一盏灯的离心管的顶部，并从该管的顶部收集的光散射的上部频带在4厘米，稀释的0.05M的Na-柠檬酸盐缓冲液，pH值5.5，和离心机在140,000 xg离心3小时，在4 °C。
- 将沉淀重悬于0.5ml的无菌水和存储在4℃达6个月。
- 执行Bradford蛋白测定，定量的病毒样颗粒浓度。的产率是在1和3之间的VLPs微克/克植物组织。
2。荧光素-5 - 马来酰亚胺标记反应的VLPs
- 准备1mM溶液的荧光素-5 - 马来酰亚胺（427.37克/摩尔）在50mM钠phosphatë缓冲液，pH7.0，1mM EDTA中。混合使用的旋涡，，验证完全溶解。光用铝箔保护管。
- 添加到在步骤1中，混合的VLPs产生荧光素-5 - 马来酰亚胺。巯基的摩尔量，使用了25倍摩尔过量的荧光素-5 - 马来酰亚胺。一般来说，使用的浓度为1μg/μl和荧光素-5 - 马来酰亚胺的溶液的60微升30微升的VLPs产生可接受的结果。
- 在4℃下孵育2小时，在室温或过夜反应
- 终止该反应通过添加二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为50mM。
- 移除未反应的荧光素使用脱盐离心柱（赛默飞世尔科技公司，罗克福德IL），并在室温下以1,500×g离心2分钟离心。
- 对于SDS-PAGE分析，添加到每个反应的10μl的10微升的2×Laemmli样品缓冲液的SDS-PAGE。标记蛋白在4℃下避光保存长达一个月或在单次使用的等分试样在-20℃下，长达3个月。
3。标记反应和生物素掺入测定
- 使用脱盐离心柱（赛默飞世尔科技公司，罗克福德IL）进行缓冲液交换，从水向磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH值为7.0，在步骤1中产生的病毒样颗粒。
- 准备的马来酰亚胺-PEG2-生物素的20mM原液，通过加入190μl的PBS在No-称量马来酰亚胺-PEG2-生物素和混合通过移液向上和向下。
- 马来酰亚胺-PEG2-生物素到的VLPs和组合。使用10倍摩尔过量的试剂的VLPs解决方案≤2毫克/毫升。
- 温育在室温下反应4小时。
- 除去非反应的马来酰亚胺-PEG2-生物素使用脱盐离心柱（赛默飞世尔科技公司，罗克福德IL），并在室温下以1,500×g离心2分钟离心。
- 确定摩尔每摩尔生物素的使用，皮尔斯生物素定量试剂盒（Thermo Scientific的）和FO的VLPsllowing制造商的说明。
4。交联的半胱氨酸2 - 的VLPs和F肽
- 在下面的步骤中使用的VLPs导致可用的半胱氨酸残基进行交联，在步骤2（半胱氨酸2 - 的VLPs）。准备一个新的交联的原液（28.63毫摩尔）在680微升二甲亚砜中溶解10mg的NHS-PEG4-马来酰亚胺交联剂。
- 溶解（F）的一个17个氨基酸长的的肽（LLPNMOKDKEACAKAPL）在50μl的共轭缓冲液（1×PBS，pH值7.2，1mM EDTA）中的浓度为0.1mM。
- 将4微升交联剂添加到50微升的溶解的肽（蛋白质-NH 2）在1mM的最终浓度（这是10倍摩尔过量的肽溶液的0.1 mM的）。
- 在4℃下孵育2小时的反应
- 使用脱盐柱（赛默飞世尔科技公司，罗克福德IL）与缀合缓冲液（1×PBS，pH值7.2，1mM EDTA）中，通过离心平衡在1,500 xg离心纯化的交联的肽在室温下的1分钟。
- 设置结合的VLPs（蛋白质-SH）和交联的肽（蛋白质-NH 2）的摩尔比确定的硫醇的数量和活化胺参与的反应和VLPs和肽之间的分子量的差异的反应混合物。
- 在4℃下孵育反应混合物在室温下搅拌2小时
- Western blot分析，混合产生的共轭产品1:1 Laemmli缓冲液，煮沸10分钟，并进行SDS-PAGE上一个预制10-20％Tris-甘氨酸凝胶（Invitrogen公司），电泳到硝酸纤维素膜（Invitrogen公司）。阻止膜，用1×PBS，pH值为7.2，含有0.05％Tween-20的PBS（PBS-吐温）和5％脱脂奶粉和探头，然后由相应的磷酸酶标记的二次抗体的肽特异性抗体。
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Representative Results
瞬时表达的突变体MRFV的外壳蛋白（CP）基因N.在PVX基于矢量产生的VLPs benthamiana植物是图1中描述。的改性MRFV外壳蛋白基因，通过PCR扩增，然后放置在PVX基于的矢量，pP2C2S 2，（D. Baulcombe，塞恩斯伯里实验室，英格兰诺里奇礼物）的重复的亚基因组的CP启动子的转录控制下。体外 RNA转录产生的RNA转录物，然后用于接种N. benthamiana植物。在受感染的植物（ 图2A）MRFV-CP的亚基形成病毒样颗粒（ 图2B），而容易地纯化。随后，病毒样颗粒是交叉链接到的肽。
的MRFV外壳蛋白的反应性氨基酸的一个例子如图3所示。可用于选择每个氨基酸的附加部分的，如果它是表面暴露。该CHEMIC人的技术包括传统的生物分子的策略，例如，赖氨酸，烷基化的半胱氨酸的sulfhydrilic组的氨基酰化，和羧酸残基的激活和添加了胺的耦合。此外，酪氨酸和色氨酸的芳族基团，可以是通过重氮化反应和烷基化反应的生物分子的有吸引力的目标。
硫醇的特定试剂的VLPs的Cys残基的溶剂可接触在图4中示出。纯化的野生型病毒样颗粒（泳道4）和半胱氨酸的VLPs突变体携带的位置的半胱氨酸残基107-111（泳道1）和192-194（泳道3）的CP基因12是不反应的，在非变性条件下与硫醇-特异性试剂（不存在荧光）。荧光素-5 - 马来酰亚胺的Cys的VLPs突变体携带的半胱氨酸残基，在位置125-129（泳道2）的CP基因仅赋予橙色荧光。结果表明，在泳道2中的病毒样颗粒有一个几何阿伦gement导致溶剂暴露的游离硫醇基的半胱氨酸残基，而在泳道1和3的样品中的半胱氨酸残基可能参与二硫键在折叠的外壳蛋白。
标记与马来酰亚胺-PEG2-生物素的反应，然后用生物素化检测代表的另一示例的Cys残基的溶剂可接触的分析。由于生物素是一个相对较小的分子，它可以是共轭的多个副本的VLPs上，其中每一个可以结合的抗生物素蛋白，如在图5中所示的一个分子。水平的生物素化，84.74摩尔生物素每摩尔蛋白13，表示连接到的VLPs的生物素分子的数目，因此，可以显示的外部表面上的配位体的数目。由于几个的VLPs上的硫醇基团的可用性，肽可以通过交联反应与NHS-PEG4-马来酰亚胺连接。这种试剂是他人Tero-双官能交联剂，其中包含如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的酯和马来酰亚胺基团的反应性端部，使胺和含巯基的分子的共价偶联。正如在图6A所示，NHS酯与伯胺形成酰胺键的反应，而马来酰亚胺反应，形成稳定的硫醚键的巯基。交联反应产生的VLPs-肽复合物的免疫反应的特异性抗体在Western印迹中，如在图6B中所示的。
图1，在植物中，随后的VLPs纯化和随后的交联的肽的生产的VLPs示意图。jpg“的目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图2。症状产生的T7成绩单接种N. benthamiana植物（A）和所产生的病毒样颗粒（B）的透射电子显微镜观察。
图3，一种蛋白质结构预测的野生型（wt）的-MRFV-CP表示反应半胱氨酸氨基酸（由箭头表示）。
图4 SDS-PAGE分析纯化的病毒颗粒结合到fluorosCEIN-5-马来酰亚胺（A），简单的蓝色安全的染色方法染色的蛋白质。（B）摄影在紫外光照射下荧光素5 -马来酰亚胺检测。 M：预染的范围广泛的蛋白质标记物（Bio-Rad公司，大力士，加利福尼亚州），1：纯化的半胱氨酸1 - 病毒样颗粒，2：纯化的半胱氨酸2 - 病毒样颗粒，3：纯化的半胱氨酸3 - 的VLPs，4：纯化的（重量）的VLPs。 （半胱氨酸1病毒样颗粒，半胱氨酸2类病毒颗粒，和Cys 3类病毒颗粒的CYS-MRFV病毒样颗粒突变的13）。
图5。AT = 3丝带模型表示的巯基的反应性化学为（A）的生物素标记和（B）荧光素-5 -马来酰亚胺标签等距的VLPs。
图6示意图示出的蛋白质的交联半胱氨酸2 -的VLPs和F肽（A）和Western blot之间（B）的Cys的VLPs-F与特异性抗体探测到F肽。 M：预染广泛的蛋白标记（Bio-Rad公司，大力士，CA），1：CYS-生产的VLPs-F的第4步点击这里查看大图 。
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Discussion
这里介绍的方法，使一个非常敏感的和快速的分析本植物生产的VLPs的表面上，以及对其他蛋白复合物的反应性半胱氨酸。马来酰亚胺是硫醇的特定的试剂，与自由的含巯基的分子反应以形成稳定的硫醚键。此方法绘制的马来酰亚胺与巯基反应，不参与与其它氨基酸的相互作用的特异性。保的天然结构的VLPs在整个过程中是非常重要的。在描述的应用程序中，反应是在非变性条件下进行，并在pH为7至保持的天然结构的VLPs。在中性pH值，马来酰亚胺与游离巯基的最佳反应。这允许与荧光素或生物素标记的VLPs访问修饰成半胱氨酸。
温和的pH值（6.5-7.5）和缓冲液条件中采用的交联反应。上的官能团的数目的VLPs确定交联剂和VLPs之间的适当的比例。那里有许多官能团的情况下，可以使用低级交联剂蛋白质之比。相反，较高的交联剂用更少的可用的官能团，采用蛋白质比例。
一个数组，包括空间的手臂，可裂，化学成分，尺寸，和溶解度的因素，最终确定使用的交联剂的选择。此外，选择的交联剂使用也是参与共轭的两种蛋白质的大小（在此情况下的VLPs和肽）的函数。蛋白质的肽或蛋白质的蛋白质的交联是理想的杂二官能性交联剂。它们允许更容易控制的两个步骤的反应，最大限度地减少了不希望的自共轭和聚合时，会发生使用均聚物双官能团的NHS-酯试剂。 NHS酯反应，在第一步骤中，无线网络个伯胺，氨基键的形成。在第二步骤中，马来酰亚胺与巯基形成硫酯键反应。
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Disclosures
提到在出版的商业产品的商品名称是专为提供特定信息的目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
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