Summary
Procédé pour analyser l'accessibilité au solvant du groupe thiol de résidus cystéine de
Abstract
Imitant et l'exploitation de propriétés du virus et les caractéristiques physico-chimiques et physiques promet d'apporter des solutions à certains des défis les plus urgents de la planète. La multitude et les types de virus associés à leurs propriétés intrigantes potentiellement donner des possibilités infinies pour les applications dans les technologies à base de virus. Les virus ont la capacité de s'auto-assembler en particules de forme discrète et la taille, la spécificité de symétrie, la polyvalence, et des propriétés stables dans une large gamme de conditions de température et de pH. Sans surprise, avec une gamme remarquable de propriétés, les virus sont proposés pour être utilisés dans les biomatériaux 9, 14, 15 vaccins, du matériel électronique, des outils et des produits chimiques, l'électronique moléculaire conteneurs 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Afin d'utiliser les virus dans les nanotechnologies, elles doivent être modifiées de leurs formes naturelles pour donner de nouvelles fonctions. Ce défi processus peut être réalisée par plusieurs mécanismes comprenant la modification génétique du génome viral et la fixation chimique des molécules étrangères ou souhaitée pour les groupes réactifs des particules virales 8. La possibilité de modifier un virus dépend essentiellement des propriétés physico-chimiques et physiques du virus. En outre, les modifications génétiques ou physico-chimique doivent être effectuées sans affecter la structure du virus indigène et le fonctionnement du virus. Protéines de maïs rayado fino virus manteau (MRFV) s'auto-assembler dans Escherichia coli produisant des VLP stables et vides qui sont stabilisées par protéine-protéine interactions et qui peut être utilisé dans les applications des technologies à base de virus 8. VLP produites dans des plants de tabac ont été examinés comme un échafaudage sur lequel une variété de peptides peuvent être affichés de manière covalente 13. Ici, nous décrivons les étapes 1) à déterminer lequel des cystéines accessibles au solvant dans une capside du virus sont disponibles pour les modification, et 2) Bioconjugate peptides modifiés pour les capsides. En utilisant indigènes ou par mutation-inséré résidus d'acides aminés et des standards des technologies de couplage, une grande variété de matériaux ont été affichées sur la surface des virus de plantes tels que le virus de la mosaïque de Brome 3, virus de la panachure Carnation 12, niébé virus de la marbrure chlorotique 6, la mosaïque du tabac virus 17, virus de la mosaïque jaune navet 1, et MRFV 13.
Protocol
1. Inoculation et purification de virus VLP de plantes de Nicotiana benthamiana
- Produire plafonnées T7-ARN transcrits à partir de pommes de terre du virus X (PVX) à base de plasmides vecteurs transportant MRFV de type sauvage (wt) et protéine d'enveloppe Cys-muté (CP) des gènes 12, en utilisant Ambion de T7-mMessage mMachine Kit.
- Pour chaque réaction transcription T7, inoculer deux feuilles complètement développées de N. benthamiana avec 10 pi de réactions et incuber les plantes pendant 10 jours en serre à 60% d'humidité pendant 16 heures avec de la lumière (25.000-30.000 lux) à 25 ° C et 8 h obscurité à 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana infectées par le virus laisse 10 jours après l'inoculation (dpi), peser le tissu végétal (50 grammes) et le placer sur la glace.
- Homogénéiser la matière végétale dans un malaxeur en présence de 100 ml d'une solution glacée de 0,5 M Na-citrate, pH 5,5 (utilisation 2 ml de tampon par gramme de tissu végétal).
- Filtrez homogénat par 3 couches de cheeseclOTH et de clarifier par centrifugation à 27.000 xg pendant 30 min. Transférer le surnageant dans une éprouvette graduée froide, mesurer le volume, puis transvaser dans un bécher stérile réfrigéré. Jeter le culot.
- Traiter le surnageant par addition de polyéthylène glycol 10% 8.000 (PEG 8.000), sous agitation pendant 15 min à 4 ° C, et incuber pendant encore 45 min à 4 ° C pour précipiter les particules de type virus (VLP)-PEG matrice.
- Centrifuger l'échantillon à 27.000 xg pendant 20 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Traiter la pastille en ajoutant 8 ml de 0,05 M citrate de Na-tampon, 5,5 contenant 2% de Triton X-100 pH. Swirl tubes à centrifuger le bien de libérer le culot. Transférer le culot et le tampon dans un bécher stérile réfrigéré. Rincer immédiatement les tubes de 2 ml du même tampon et ajouter dans le bécher. Agiter la suspension à 4 ° C jusqu'à ce que les granules sont dissous (en général 1 heure).
- Clarifier par centrifugation pendant 5 min à 27.000 xg, jeter le culot, et processus le surnageant par centrifugation à 140.000 xg pendant 2 heures à 4 ° C.
- Remettre en suspension le culot dans 1 ml 0,05 M Na-citrate, pH 5,5, et de placer la suspension sur un gradient de saccharose 10-40% réalisés dans 0,05 M de Na-citrate, pH 5,5.
- Centrifuger le gradient pendant 3 heures à 140.000 xg à 4 ° C.
- Rayonner une lumière sur le dessus du tube de centrifugation et recueillir la bande de diffusion de lumière supérieure à 4 cm de la partie supérieure du tube, diluer avec 0,05 M Na-citrate, pH 5,5, et centrifuger pendant 3 heures à 140.000 xg à 4 ° C.
- Reprendre le culot dans 0,5 ml d'eau stérile et conserver à 4 ° C pendant un maximum de six mois.
- Quantifier la concentration VLP en effectuant un dosage de protéine de Bradford. Le rendement de VLP est comprise entre 1 et 3 mg / g de tissu végétal.
2. Fluorescéine-5-maléimide-étiquetage Réactions des VLP
- Préparer une solution de 1 mM de fluorescéine-5-maléimide (427,37 g / mol) dans 50 mM de sodium phosphate tampon, pH 7,0; 1 mM EDTA. Mélanger à l'aide du vortex et vérifier dissolution complète. Protéger le tube de la lumière en utilisant du papier d'aluminium.
- Ajouter fluorescéine-5-maléimide à VLP produites à l'étape 1 et mélanger. Utiliser un excès 25-fois molaire de fluorescéine-5-maléimide de la quantité molaire de groupes sulfhydryle. En règle générale, l'utilisation de VLP 30 pi à la concentration de 1 pg / pl et 60 ul de la solution de fluorescéine-5-maléimide produit des résultats acceptables.
- Incuber la réaction pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Mettre fin à la réaction par addition de dithiothreitol (DTT) à une concentration finale de 50 mM.
- Retirer n'ayant pas réagi fluorescéine en utilisant une colonne spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) et centrifugation pendant 2 min à 1500 xg à température ambiante.
- Pour analyse SDS-PAGE, ajouter 10 ul de 2 x SDS-PAGE tampon échantillon de Laemmli à 10 pl de chaque réaction. Rangez la protéine marquée abri de la lumière à 4 ° C pendant un mois ouà usage unique aliquots à -20 ° C jusqu'à 3 mois.
3. Réaction de marquage et de détermination de constitution biotine
- Utilisez les colonnes de spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) pour effectuer un échange de tampon de l'eau de tampon phosphate salin (PBS), pH 7,0 des VLP produites à l'étape 1.
- Préparer une solution mère à 20 mM de maléimide PEG2-biotine en ajoutant ul 190 de PBS Non-Weigh-maléimide PEG2-biotine et mélanger par pipetage de haut en bas.
- Ajouter maléimide PEG2-biotine pour les VLP et mélanger. Utiliser un excès 10-fois molaire de réactif de solutions VLP ≤ 2 mg / ml.
- Incuber la réaction à température ambiante pendant 4 h.
- Retirer n'ayant pas réagi maléimide PEG2-biotine en utilisant une colonne spin dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) et centrifugation pendant 2 min à 1500 xg à température ambiante.
- Déterminer le nombre de moles de biotine par mole de VLP en utilisant la biotine Pierce Quantification Kit (Thermo Scientific) et following instructions du fabricant.
4. La réticulation de Cys 2-VLP et F Peptide
- VLP qui conduit à des résidus de cystéine disponibles pour la réticulation de l'étape 2 (Cys 2-VLP) sont utilisés dans l'étape suivante. Préparer une solution mère fraîche de réticulation (28,63 mM) en dissolvant 10 mg de NHS-PEG4-maléimide de réticulation en 680 ul de diméthylsulfoxyde.
- Dissoudre un 17 (F)-amino peptide acide long (LLPNMOKDKEACAKAPL) dans 50 ul de tampon de conjugaison (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) à une concentration de 0,1 mM.
- Ajouter 4 pl de réticulation à 50 ul du peptide dissous (protéine-NH2) à 1 mM concentration finale (qui est un excès de 10 fois molaire de 0,1 mM de solution de peptide).
- Incuber la réaction pendant 2 heures à 4 ° C.
- Purifier réticulé peptide en utilisant une colonne de dessalage (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) équilibrée avec du tampon de conjugaison (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) par centrifugation à 1500 xgpendant 1 min à température ambiante.
- Créer un mélange réactionnel combinant VLP (-protéine SH) et réticulé peptidiques (protéine-NH2) dans un rapport molaire déterminée par le nombre de thiols et amines activées intervenant dans la réaction et la différence de poids moléculaire entre VLP et peptidiques.
- Incuber le mélange réactionnel à température ambiante pendant 2 heures à 4 ° C.
- Pour l'analyse par Western blot, mélanger le produit conjugué résultant 1:1 avec du tampon Laemmli, faire bouillir pendant 10 minutes, et de procéder à SDS-PAGE sur un casting de pré-10-20% Tris-Glycine gel (Invitrogen), suivie par un électrotransfert sur une membrane de nitrocellulose (Invitrogen). Bloquer les membranes avec 1 x PBS, pH 7,2 contenant 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) et 5% de poudre de lait écrémé et de la sonde avec le peptide anticorps spécifiques suivies par la phosphatase approprié anticorps secondaire marqué.
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Representative Results
L'expression transitoire de mutants MRFV manteau de protéines (CP) des gènes dans N. benthamiana dans un vecteur PVX VLP à base produisant est décrit dans la figure 1. Le gène modifié MRFV protéine d'enveloppe est amplifié par PCR puis placé sous le contrôle transcriptionnel du promoteur subgénomique CP dupliqué dans un vecteur PVX-base, pP2C2S 2, (un cadeau de D. Baulcombe, Laboratoires Sainsbury, Norwich, Angleterre). En vitro transcription de l'ARN produit de transcription d'ARN qui sont ensuite utilisées pour inoculer N. benthamiana. Dans les plantes infectées (figure 2A) MRFV-CP sous-unités forment VLP (figure 2B) qui sont facilement purifiés. Par la suite, les particules de type viral sont réticulées à des peptides.
Un exemple de réactifs acides aminés de la protéine d'enveloppe MRFV est représenté sur la figure 3. Chaque acide aminé sélectionné peut être utilisé pour fixer des fragments si elle est exposée surface. Le chemictechniques comprennent al stratégies bioconjugaison traditionnels tels que, l'acylation du groupe amino de la lysine, l'alkylation du groupe sulfhydrilic de la cystéine, et l'activation des radicaux d'acides carboxyliques avec des amines et de couplage supplémentaires. En outre, les groupes aromatiques de la tyrosine et le tryptophane peut être des cibles intéressantes pour bioconjugaison par diazotation et d'alkylation.
L'accessibilité au solvant des résidus Cys de VLP à thiol réactifs spécifiques est illustrée à la figure 4. Purifiée poids-VLP (piste 4) et Cys-VLP mutants portant des résidus cystéine en position 107 à 111 (voie 1) et 192-194 (piste 3) du gène CP 12 ne sont pas réactifs dans des conditions natives avec un thiol réactif spécifique (absence de fluorescence). Fluorescéine-5-maléimide donne fluorescence orange uniquement pour les mutants Cys-VLP transportant des résidus cystéine en position 125-129 du gène CP (ligne 2). Le résultat montre que les VLP en voie 2 ont un arran géométriquegement des résidus cystéines entraîne exposés au solvant groupes thiol libres, tandis que les résidus de cystéine dans les échantillons dans les voies 1 et 3 sont peut-être impliqués dans des ponts disulfure dans le repliement de la protéine d'enveloppe.
Réactions d'étiquetage avec maléimide PEG2-biotine suivie par un test de biotinylation représentent un autre exemple de l'analyse de l'accessibilité au solvant de résidus Cys. Car la biotine est une molécule relativement faible, il peut être conjugué en plusieurs exemplaires sur les particules de type viral, dont chacun peut se lier une molécule d'avidine comme le montre la Figure 5. Le niveau de biotinylation, 84,74 moles de biotine par mole de protéine 13, indique le nombre de molécules de biotine fixées aux VLP et par conséquent le nombre de ligands qui peuvent être affichées sur la surface extérieure. En raison de la disponibilité de plusieurs groupements thiols sur les particules de type viral, les peptides peuvent être fixés par des réactions de réticulation avec NHS-PEG4-maléimide. Ce réactif est un, il tero-réticulant bifonctionnel qui contient des extrémités réactives, telles que le N-hydroxysuccinimide (NHS) ester et des groupes maléimide, permettant la conjugaison covalente de molécules d'amine et contenant des groupes sulfhydryle. Comme le montre la figure 6A, l'ester de NHS réagit avec des amines primaires formant des liaisons amide, tandis que maléimide réagit avec les groupes sulfhydryle formant des liaisons thioéther stables. Réticulation réactions produisent des VLP-peptide qui sont immunoréactif avec les anticorps spécifiques à Western blot comme le montre la figure 6B.
Figure 1. Schéma de principe de la production de particules de type viral dans les plantes, suivie d'une purification des VLP et réticulation subséquente des peptides.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Symptômes Figure 2. Produites par transcription T7 inoculation sur N. benthamiana (A) et microscopie électronique à transmission des VLP produites (B).
Figure 3. Une prédiction de la structure des protéines de type sauvage (wt)-MRFV-CP montrant des acides aminés cystéine réactifs (indiqués par des flèches).
Figure 4. Analyse SDS-PAGE des VLP purifiées conjugués à radioscopieCEIN-5-maléimide. (A) Il suffit de bleuissement de sécurité a été utilisé pour colorer les protéines. (B) fluorescéine-5-maléimide de détection par la photographie sous éclairage UV. M: marqueur précolorés large gamme de protéines (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: 1-Cys purifié VLP, 2: purifiée Cys 2-VLP, 3: Cys purifié 3-VLP, 4: VLP purifiées en poids. (Cys 1-VLP, Cys 2-VLP, et Cys 3-VLP sont Cys-MRFV-VLP mutants 13).
Figure 5. AT = 3 modèle de ruban VLP isométrique montrant la chimie sulfhydryle réactif pour (A) marquage à la biotine et (B) fluorescéine-5-maléimide étiquetage.
Figure 6. Schéma protéine de réticulation entre Cys 2-VLP et F peptide (A) et Western blot (B) des particules de type viral-Cys-F sondés avec des anticorps spécifiques à F peptide. M: marqueur précolorés large gamme de protéines (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-VLP-F produite à l'étape 4 Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
La méthode présentée ici permet une analyse très sensible et rapide de cystéines réactives présentes sur la surface de particules de type viral de plantes produites ainsi que tous les autres complexes protéiques. Maléimides sont thiol-spécifique des réactifs, qui réagissent avec sulfhydryle libres des molécules contenant de former des liaisons thioéther stable. Cette méthode s'appuie sur la spécificité des maléimides à réagir avec des groupes sulfhydryle pas impliqués dans les interactions avec d'autres acides aminés. Préserver la structure native des VLP est très important à travers l'ensemble du processus. Dans l'application décrite, les réactions sont effectuées dans des conditions natives et à un pH de 7 pour maintenir la structure native des VLP. A pH neutre, les maléimides ont une réactivité optimale avec les groupes sulfhydryle libres. Ce qui permet le marquage des particules de type viral avec la biotine ou la fluorescéine ou l'autre de la cystéine accessible à des modifications.
PH doux (6,5-7,5) et les conditions de tampon sont également utilisés dans la réticulationréactions. Le nombre de groupes fonctionnels sur les particules de type viral détermine le rapport approprié entre l'agent de réticulation et des VLP. Basse réticulation des ratios protéines peut être utilisée dans les cas où il existe de nombreux groupes fonctionnels. Inversement, plus un agent de réticulation à taux de protéine est employé avec moins de groupes fonctionnels disponibles.
Un ensemble de facteurs, y compris le bras espace, clivage, la composition chimique, de la dimension et de la solubilité en fin de compte déterminer la sélection des agents de réticulation utilisés. En outre, le choix de l'agent de réticulation utilisé est également fonction de la taille des deux protéines (dans ce cas VLP et peptidiques) impliqués dans la conjugaison. Hétéro-bifonctionnels agents de réticulation sont idéales pour la protéine-peptide ou protéine-protéine de réticulation. Ils permettent un contrôle plus serré en deux étapes qui minimisent les réactions indésirables auto-conjugaison et de polymérisation qui se produit lorsque l'homo-bifonctionnels NHS-esters réactifs sont utilisés. Dans la première étape, l'ester de NHS réagit wie amines primaires formant des liaisons aminés. Dans la seconde étape, le maléimide réagit avec les groupes sulfhydryle formant des liaisons thioester.
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Disclosures
La mention de noms commerciaux des produits commerciaux de la publication est uniquement dans le but de fournir des informations précises et n'implique pas de recommandation ou une approbation par le Département américain de l'Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
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