Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על Published: February 14, 2013 doi: 10.3791/50084
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Plant Sciences Institute, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Molecular Plant Pathology Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין של

Abstract

חיקוי וניצול מאפייני נגיף ומאפייני physicochemical ופיסיים טומן בחובו הבטחה לספק פתרונות לכמה מהאתגרים הקשים ביותר בעולם. המגוון והסוגים של וירוסים יחד עם המאפיינים המסקרנים הצרופים פוטנציאלי לתת אינספור הזדמנויות ליישומים בטכנולוגיות וירוס מבוססים. וירוסים יש את היכולת עצמית להרכיב לתוך חלקיקים בעלי צורה דיסקרטית וגודל, סגולי של סימטריה, polyvalence, ומאפיינים יציבים תחת מגוון רחב של תנאי טמפרטורה וחומציות. שלא במפתיע, עם מגוון עשיר כל כך של תכונות, וירוסים מוצעים לשימוש בחומרים ביולוגיים 9, חיסונים 14, 15, חומרים אלקטרוניים, כלים כימיים, ו11 מיכלים מולקולריים אלקטרוניים 4, 5, 10, 16, 18, ​​12.

על מנת לנצל וירוסים בננוטכנולוגיה, הם חייבים להיות שונים מהצורות הטבעיות שלהם כדי להקנות פונקציות חדשות. זה יחסי ציבור מאתגריםocess יכול להתבצע באמצעות מספר מנגנונים כולל הנדסה גנטית של הגנום הנגיפי וכימיות הצמדת מולקולות זרות או רצויות לקבוצות תגובתי חלקיקי וירוס 8. היכולת לשנות וירוס בעיקר תלויה במאפייני physiochemical ופיסיים של הנגיף. בנוסף, שינויים הגנטיים או physiochemical צריכות להתבצע מבלי להשפיע על המבנה ותפקוד יליד וירוס וירוס לרעה. (MRFV) חלבוני מעייל rayado תירס Fino וירוס עצמי להרכיב בחיידקי Escherichia ייצור VLPs היציב וריק שהם התייצבו על ידי בין חלבונים אינטראקציות ושניתן להשתמש ביישומים מבוססי טכנולוגיות וירוס 8. VLPs מיוצר בצמחי טבק נבדק כפיגום עליו מגוון של פפטידים ניתן להציג 13 קוולנטית. כאן, אנו מתארים את השלבים ל1) תקבעו מי מcysteines ממס הנגיש בcapsid וירוס זמין לmodifiקטיון, ו2) Bioconjugate פפטידים לcapsids השונה. באמצעות שאריות דובר או mutationally הוכנסו-חומצת אמינו וטכנולוגיות צימוד סטנדרטיות, במגוון רחב של חומרים שמוצגים על פני השטח של וירוסי צמחים כגון, וירוס Brome פסיפס 3, וירוס mottle ציפורנים 12, Cowpea chlorotic mottle 6 וירוס, פסיפס טבק וירוס 17, וירוס לפת צהוב פסיפס 1, וMRFV 13.

Protocol

1. הרכבת חיסון נגיף וטיהור VLPs מצמחי Nicotiana benthamiana

  1. לייצר תעתיקי תרי T7-RNA מתפו"א וירוס X (PVX)-מבוססי פלסמידים וקטור שנשאו MRFV חלבון Cys מוטצית מעייל (CP) גנים 12, באמצעותו של Ambion T7-mMessage mMachine הקיט פראי מסוג (wt) ו.
  2. לכל תגובת תמליל T7, לחסן שני עלים התרחבו באופן מלא של נ benthamiana עם 10 תגובות μl ולדגור על הצמחים במשך 10 ימים בחממה, בתנאי לחות 60% עבור 16 שעות עם אור (25,000-30,000 לוקס) בשעת 25 ° C ו 8 שעתי חשכה בשעת 20 ° C.
  3. עלי Harves t נ benthamiana נגועים בנגיף 10 ימים אחרי החיסון (dpi), לשקול את רקמות הצמח (50 גרם) ומניח על קרח.
  4. הומוגני חומר צמחי במערבל בנוכחות של 100 מ"ל של פתרון מצונן של חיץ 0.5 מ 'Na-ציטראט, 5.5 pH (שימוש 2 מ"ל של חיץ לגרם של רקמות צמח).
  5. סנן homogenate באמצעות 3 שכבות של cheesecloth ולהבהיר ידי צנטריפוגה ב27000 XG למשך 30 דקות. העברת supernatant לגליל סיים מצונן, למדוד את עוצמת קול, ולאחר מכן להעביר למבחנה סטרילית מצוננת. השלך את הגלולה.
  6. לעבד את supernatant על ידי הוספת 10% פוליאתילן גליקול 8000 (PEG 8000), מערבבים במשך 15 דקות ב 4 ° C, ודגירה במשך 45 דקות נוספות ב 4 ° C כדי להאיץ את חלקיקי נגיף הדמויים (VLPs)-PEG מטריקס.
  7. צנטריפוגה במדגם 27000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
  8. לעבד את הגלולה על ידי הוספת 8 מ"ל של חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH מכיל 2% Triton X-100. מערבולת צינורות צנטריפוגות גם כדי לשחרר את הכדור. להעביר את הכדור והחיץ למבחנה סטרילית מצוננת. יש לשטוף את הצינורות באופן מיידי עם 2 מ"ל של אותו המאגר ולהוסיף לכוס. מערבב את ההשעיה ב 4 מעלות צלזיוס עד שהכדורים מתמוססים (בדרך כלל שעות 1).
  9. הבהר ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב27000 XG, להשליך את הגלולה, ו-process supernatant ידי צנטריפוגה ב140.000 XG ל2 שעות ב 4 ° C.
  10. Resuspend גלול ב 1 מיליליטר חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH ולמקם את ההשעיה על גבי 10-40% שיפוע סוכרוז עשה במאגר 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH.
  11. צנטריפוגה השיפוע עבור 3 שעות ב140.000 XG ב 4 ° C.
  12. לשפוך אור על החלק העליון של צינור צנטריפוגה ולאסוף רצועה העליונה פיזור אור ב4 סנטימטרים מהחלק העליון של הצינור, לדלל עם חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH, וצנטריפוגה ל3 שעות ב140.000 XG ב 4 ° C.
  13. Resuspend גלול ב 0.5 מ"ל של מים וחנות סטרילית ב 4 ° C, למשך שישה חודשים.
  14. לכמת את ריכוז VLPs על ידי ביצוע בדיקת חלבון ברדפורד. התשואה של VLPs היא בין 1 ל 3 מיקרוגרם / גרם של רקמות צמח.

2. תגובות fluorescein-5-maleimide-תיוג של VLPs

  1. הכן את הפתרון של 1 mM fluorescein-5-maleimide (427.37 גרם / שומה) בphosphat נתרן 50 מ"מימדואר חיץ, pH 7.0, 1 mM EDTA. מערבב בעזרת המערבולת ולוודא מסה מלאה. הגן על הצינור מן האור עם רדיד אלומיניום.
  2. הוסף fluorescein-5-maleimide לVLPs מיוצר בשלב 1 ולערבב. השתמש עודף טוחנת 25-קיפול של fluorescein-5-maleimide לכמות טוחנת של sulfhydryls. בדרך כלל, באמצעות 30 μl של VLPs בריכוז של מיקרוגרם 1 / μl ו60 μl של פתרון fluorescein-5-maleimide מייצר תוצאות מתקבלות על דעת.
  3. דגירת התגובה ל2 שעות בטמפרטורת חדר או לילה ב 4 ° C.
  4. לסיים את התגובה על ידי הוספת dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 50 מ"מ.
  5. הסר הלא הגיב fluorescein באמצעות עמודת desalting ספין (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1500 XG בטמפרטורת חדר.
  6. לניתוח SDS-PAGE, להוסיף 10 μl מתוך 2 חיץ מדגם x-SDS PAGE Laemmli עד 10 μl של כל תגובה. אחסן את החלבון המסומן מוגנים מפני אור ב 4 ° C עד חודש אחד אובaliquots שימוש היחיד ב -20 ° C עד 3 חודשים.

3. תיוג תגובה וקביעת התאגדות ביוטין

  1. השתמש בעמודות ספין desalting (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) לבצע החלפת חיץ ממים מלוחים פוספט שנאגר-(PBS), 7.0 pH של VLPs מיוצר בשלב 1.
  2. הכן את פתרון מנייה 20 מ"מ של maleimide-PEG2-ביוטין ידי הוספת μl 190 של PBS ב-No-לשקול maleimide-PEG2-ביוטין ולערבב ידי pipetting למעלה ולמטה.
  3. הוסף maleimide-PEG2-ביוטין לVLPs והמערבב. השתמש עודף טוחנת 10-קיפול של ריאגנט לפתרוני VLPs ≤ 2 מ"ג / מ"ל.
  4. דגירת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 4 שעות.
  5. הסר הלא הגיב maleimide-PEG2-ביוטין באמצעות עמודת desalting ספין (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1500 XG בטמפרטורת חדר.
  6. קבע את השומות של ביוטין לשומות של VLPs באמצעות פירס ביוטין quantitation הקיט (Thermo Scientific) וחצllowing הוראות יצרן.

4. Cross-linking של 2-VLPs Cys וF פפטיד

  1. VLPs אשר הביאה שאריות ציסטאין זמינות לצלב-linking בשלב 2 (2-Cys VLPs) משמש בשלב הבא. הכן את פתרון צלב-linking מלאה טרי (28.63 מ"מ) על ידי המסת 10 מ"ג של מקשר צלב NHS-PEG4-maleimide בשנת 680 μl של sulfoxide דימתיל.
  2. להמס 17 (F)-אמינו פפטיד ארוך החומצה (LLPNMOKDKEACAKAPL) ב 50 μl של חיץ צימוד (1 x PBS, 7.2 pH; 1 המ"מ EDTA) בריכוז של 0.1 מ"מ.
  3. הוסף 4 μl צולב מקשר עד 50 μl של פפטיד המומס (חלבון NH2) בריכוז סופי mM 1 (אשר הם עודף טוחנת 10-לקפל ל0.1 מ"מ של פתרון פפטיד).
  4. דגירת התגובה ל2 שעות ב 4 ° C.
  5. לטהר פפטיד הצולב באמצעות עמודת desalting (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) מתאזנת עם חיץ צימוד (1 x PBS, 7.2 pH; 1 המ"מ EDTA) על ידי צנטריפוגה XG ב 1500ל1 דקות בטמפרטורת חדר.
  6. הגדר את תערובת תגובת שילוב VLPs (חלבון-SH) ופפטיד הצולב (חלבון NH2) ביחס טוחן נקבע על ידי מספר thiols ו אמין הופעל מעורב בתגובה וההבדל במשקל מולקולרי בין VLPs ופפטידים.
  7. דגירת תגובת התערובת בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות ב 4 ° C.
  8. לניתוח כתם מערבי, לערבב את מוצר מצומד 01:01 התקבלו בLaemmli חיץ, להרתיח במשך 10 דקות, ולהמשיך בSDS-PAGE בגבס מראש 10-20% טריס-גליצין ג'ל (Invitrogen), ואחריו על electroblotting קרום ניטרוצלולוזה (Invitrogen). חסום את הקרומים עם 1 x PBS, 7.2 pH המכיל 0.05% Tween-20 (PBS-Tween) ו5% אבקת חלב דל שומן ובדיקה עם נוגדני פפטיד ספציפיים ואחריו הנוגדן המשני המתאים phosphatase כותרתו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביטוי זמני של גני חלבוני מוטצית MRFV מעייל (CP) בנ צמחי benthamiana בVLPs ייצור הווקטור PVX מבוסס מתוארים באיור 1. גן חלבון מעייל MRFV modified מוגבר באמצעות PCR ולאחר מכן תחת שליטת התעתיק של אמרגן CP subgenomic המשוכפל בוקטור PVX מבוסס, pP2C2S 2, (מתנה של ד Baulcombe, מעבדות סיינסבורי, נוריץ', אנגליה). ב תעתיק הרנ"א מבחנה מייצר תעתיקי רנ"א אז המשמשים לחסן נ צמחי benthamiana. בצמחים הנגועים (איור 2 א) יחידות משנת MRFV-CP יוצרות VLPs (האיור 2B) אשר מטוהרים בקלות. לאחר מכן, הם VLPs צולב לפפטידים.

דוגמה של חומצות אמינו של החלבון תגובתי מעייל MRFV מוצגת באיור 3. כל חומצת האמין שנבחרה יכולה לשמש כדי לצרף moieties אם הוא נחשף פני שטח. Chemicטכניקות al כוללות אסטרטגיות bioconjugation מסורתיות כגון, acylation של קבוצת אמינו של ליזין, אלקילציה של קבוצת sulfhydrilic של ציסטאין, והפעלה של שאריות חומצת carboxylic וצימוד עם אמינים הוסיפו. בנוסף, הקבוצות ארומטיות של טירוזין וטריפטופן יכולות להיות מטרות אטרקטיביות עבור bioconjugation דרך diazotization ואלקילציה.

נגישות הממס של שאריות Cys של VLPs לריאגנטים thiol ספציפיים מודגמת באיור 4. מטוהר wt-VLPs (נתיב 4) ומוטנטים Cys-VLPs נשאו שאריות ציסטאין בעמדת 107-111 (1 נתיב) ו192-194 (3 מסלולים) של גן CP 12 הם unreactive בתנאים מקומיים עם ריאגנט thiol ספציפי (היעדרות של קרינה). Fluorescein-5-maleimide מקנה זרחני כתום רק לשאריות Cys-VLPs המוטציה שנשאה ציסטאין בעמדת 125-129 של גן CP (מסלול 2). התוצאה מראה כי VLPs במסלול של 2 יש Arran גיאומטריgement של שאריות cysteines כתוצאה מקבוצות thiol חופשיות ממס חשופות, ואילו את שאריות ציסטאין בדגימות בנתיבי 1 ו 3 מעורבות אולי בגשרי disulphide בקיפול של חלבון המעייל.

תגובות סימון בmaleimide-PEG2-ביוטין אחרי assay biotinylation מייצגים דוגמה נוספת לניתוח של נגישות ממס של שאריות Cys. בגלל ביוטין הוא מולקולה קטנה יחסית, זה יכול להיות מצומדת בכמה עותקים על VLPs, כל אחד מהם יכולים להיקשר מולקולה אחת של avidin כפי שמוצג באיור 5. רמת biotinylation, 84.74 שומה של ביוטין לשומה של חלבון 13, מציינת את מספר מולקולות ביוטין המצורפות לVLPs וכתוצאה מכך במספר הליגנדים שניתן להציג על פני השטח החיצוני. בגלל הזמינות של מספר קבוצות thiol על VLPs, פפטידים יכולים להיות מחוברים על ידי cross-linking תגובות עם NHS-PEG4-maleimide. מגיב זה הוא שהוא טרו-bifunctional צולב מקשר המכיל קצוות תגובתי כגון N-hydroxysuccinimide אסתר (NHS) וקבוצות maleimide, המאפשר הטיה של קוולנטי אמינות וsulfhydryl המכיל מולקולות. כפי שניתן לראות באיור 6 א, אסתר NHS מגיב עם אמינים ראשוניים יצירת קשרים אמידים, ואילו maleimide מגיב עם קבוצות sulfhydryl להרכיב אג"ח thioether יציב. תגובות צלב מקשרים-לייצר מתחמי VLPs-פפטיד שimmunoreactive עם נוגדנים הספציפיים בכתם מערבי כפי שמוצג באיור 6 ב.

איור 1
איור 1. תרשים סכמטי של ייצור VLPs בצמחים, ואחריו ולאחר טיהור VLPs צלב-linking של פפטידים."Target =" _blank jpg "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. תסמינים המיוצרים על ידי T7 תמלילי החיסון בנ צמחי benthamiana () מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של VLPs יוצר (B) ו.

איור 3
איור 3. חיזוי מבנה חלבון של פרא מהסוג (wt)-MRFV-CP מראה חומצות אמינו ציסטאין מגיבות (מסומן בחיצים).

איור 4
איור 4. ניתוח SDS-PAGE של מטוהר VLPs מצומדות לfluorosCEIN-5-maleimide. () כתם בטוח פשוט כחול שמש לכתם חלבונים. (ב) זיהוי fluorescein-5-maleimide ידי צילום תחת תאורת UV. M: סמן Prestained הרחב טווח חלבון (Bio-Rad, הרקולס, CA), 1: 1-מטוהר Cys VLPs, 2: 2-מטוהר VLPs Cys, 3: 3-המטוהר VLPs Cys, 4: VLPs המטוהר WT. (1-Cys VLPs, 2-VLPs Cys ו3-VLPs Cys הם מוטנטים Cys-MRFV-VLPs 13).

איור 5
איור 5. AT = מודל סרט 3 מתוך VLPs איזומטרי המראה את הכימיה תגובתי sulfhydryl ל() תיוג וביוטין (ב ') תיוג fluorescein-5-maleimide.

איור 6 איור 6. תרשים הממחיש חלבון cross-linking בין 2-VLPs Cys וF פפטיד () והכתם מערבי (ב ') של Cys-VLPs-F חקר עם נוגדנים ספציפיים לF פפטיד. M: סמן Prestained רחב טווח חלבון (Bio-Rad, הרקולס, CA), 1:.-F-Cys VLPs מיוצר בשלב 4 לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה שהוצגה כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של cysteines הווה על פני השטח של VLPs בצמחים המיוצרים כמו גם במערכות חלבון אחרות תגובתי. Maleimides הם ריאגנטים thiol ספציפיים, אשר מגיבים עם מולקולות חופשיות sulfhydryl המכילים ליצור קשרי thioether יציבים. שיטה זו נשענת על הספציפיות של maleimides להגיב עם קבוצות sulfhydryl אינה מעורבת באינטראקציות עם חומצות אמינו אחרות. שימור המבנה המקורי של VLPs חשוב מאוד בכל התהליך. ביישום המתואר, התגובות מבוצעות בתנאים מקומיים וב pH 7 כדי לשמור על המבנה המקורי של VLPs. ב-pH הניטראלי, maleimides יש תגובתיות אופטימלית עם קבוצות sulfhydryl בחינם. זה מאפשר תיוג של VLPs עם או fluorescein או ביוטין לציסטאין הנגיש לשינויים.

חומציות קלה (6.5-7.5) ותנאי חיץ הם מועסקים גם בקישור צולבתגובות. מספר הקבוצות פונקציונליות על VLPs מקובע את היחס הראוי בין צולב מקשר וVLPs. חוצי מקשר תחתון ליחסי חלבון יכול לשמש במקרים בם יש הרבה קבוצות פונקציונליות. לעומת זאת, חוצי מקשר גבוה יותר ליחס חלבון הוא מועסק בקבוצות פונקציונליות זמינות פחות.

מערך של גורמים, כולל זרוע חלל, cleavability, הרכבו כימי, ממד, וסופו של דבר לקבוע את מסיסות מבחר-linkers הצולב בשימוש. בנוסף, הבחירה של חוצי המקשר משמש גם פונקציה של הגודל של שני החלבונים (במקרה זה VLPs ופפטיד) המעורבים בנטייה. cross-linkers הטרו bifunctional הם אידיאלי לחלבון או הפפטיד בין חלבוני צלב-linking. הם מאפשרים לתגובות מבוקרות יותר שני שלבים הממזערים את פילמור-נטייה עצמית ולא רצוי שמתרחש כאשר ריאגנטים הומו-bifunctional NHS-אסתר משמשים. בשלב הראשון, NHS אסתר מגיבה wiאמינים ראשוניים ה להרכיב אג"ח אמינו. בשלב השני, maleimide מגיב עם קבוצות sulfhydryl להרכיב אג"ח thioester.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אזכור של השמות המסחריים של מוצרים מסחריים בפרסום הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מרמז המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thinwall, Ultra-Clear Tubes Beckman 344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Life Tecnologies AM1344M
Fluorescein-5-Maleimide Thermo Scientific Life Technologies 46130 F150 46130 is out of order substitute with F150
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format Thermo Scientific 21901
SM(PEG)n Crosslinkers Thermo Scientific 22107
10-20 % Tris-Glycine gel Invitrogen EC61352
Laemmli Buffer Bio-Rad 1610737
Tris Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC2675
Tris Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001
Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG Kirkegaard and Perry Laboratories 0751516
NBT/BCIP Phosphatase Substrate Kirkegaard and Perry Laboratories 508107

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
  2. Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
  3. Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
  4. Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
  5. Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
  6. Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
  7. Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
  8. Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
  9. Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
  10. Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
  11. Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
  12. Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
  13. Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
  14. Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
  15. Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
  16. Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).

Tags

וירולוגיה גיליון 72 ביולוגית צמח זיהום ביולוגיה מולקולרית ביוכימיה חלבונים כימיקלים ותרופות שיטות אנליטיות אבחון וטיפול וציוד טכנולוגיה תעשייה חקלאות כימיה וחומרים חלקיקי וירוסים דמויים (VLPs) VLP chemistries sulfhydryl-תגובתי תיוג תצוגת cross-linking multivalent וירוסי תירס rayado Fino פסיפס נגיף וירוס nanoparticle אספקת סמים פפטידים, מודל מפעל
ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis … More

Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (72), e50084, doi:10.3791/50084 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter