Summary
의 시스테인 잔류의 thiol 그룹의 용매 접근성을 분석하는 방법
Abstract
바이러스 속성과 물리 및 물리적 특성을 모방하고 활용하는 것은 세계에서 가장 급박 한 문제 중 일부에 대한 해결책을 제공 할 약속을 보유하고 있습니다. 깎아 지른듯한 범위와 자신의 흥미 특성과 결합 바이러스의 종류는 잠재적으로 바이러스 기반 기술의 응용 프로그램 끊임없는 기회를 제공합니다. 바이러스는 온도와 pH의 조건의 다양한 미만의 이산 모양과 크기, 대칭의 특이성, polyvalence, 안정적인 특성을 가진 입자로 자기 조립 할 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 당연히, 속성의 이러한 놀라운 범위, 바이러스는 biomaterials 9, 백신 14, 15, 전자 재료, 화학 도구 및 분자 전자 컨테이너 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12에 사용하기 위해 제안합니다.
나노 기술에 바이러스를 이용하기 위해, 그들은 새로운 기능을 가르친다하기 위해 자연적인 형태에서 수정해야합니다. 이 도전 홍보ocess는 유전 바이러스 게놈의 수정 및 화학적으로 바이러스 입자 반응 그룹 8 외국인 또는 원하는 분자를 부착 등 여러 가지 메커니즘을 통해 수행 할 수 있습니다. 바이러스를 수정하는 기능은 주로 바이러스의 physiochemical과 물리적 특성에 따라 달라집니다. 또한, 유전자 또는 physiochemical 수정에 나쁜 바이러스 기본 구조 및 바이러스 기능에 영향을주지 않고 수행해야합니다. 옥수수 rayado fino 바이러스 (MRFV) 코트 단백질은 단백질 단백질에 의해 안정화 아르 안정적이고 빈 VLPs을 생산 대장균에 자기 조립 상호 작용하고는 바이러스 기반 기술 응용 프로그램 8에서 사용할 수 있습니다. 담배 공장에서 생산 VLPs는 펩티드의 다양한 종류의 covalently 13 표시 할 수있는 발판으로 조사되었다. 여기, 우리는 바이러스 capsid에있는 용매의 접근이 cysteines 어떤이 modifi 사용할 수 있습니다 결정) 1 단계를 설명양이온, 그리고 2) 수정 capsids에 펩티드를 bioconjugate. 네이티브 또는 mutationally - 삽입 아미노산 잔류 물 및 표준 커플 링 기술을 사용하여 재료의 다양한 종류 등 Brome 모자이크 바이러스 3, 카네이션의 반점 바이러스 12 Cowpea chlorotic 반점 바이러스 6, 담배 모자이크와 같은 식물 바이러스의 표면에 표시되어 바이러스 17, 순무 대가리 노란색 모자이크 바이러스 1, MRFV 13.
Protocol
1. Nicotiana benthamiana 식물에서 바이러스 접종과 VLPs 정화
- 감자 바이러스 X (PVX) 기반 들고 벡터 plasmids의 상한선 T7-RNA 기록을 생산 MRFV 야생 타입 (중량) 및 Cys-변이 코트 단백질 (CP) 유전자 12 Ambion의 T7-mMessage mMachine 키트를 사용합니다.
- 각 T7의 성적 반응의 경우, N.의 두 완전히 확장 잎의 예방 10 μl 반응과 25에서 빛 (25,000-30,000 룩스) 16 시간 60 %의 습도에서 온실에서 10 일 동안 식물을 길러 benthamiana 20 ° C과 어두운 8 시간 ° C.
- Harves t N. benthamiana 바이러스에 감염된 잎 10 일 후 접종 (DPI)는 얼음에 식물 조직 (50g)와 장소를 무게.
- 0.5 M 오세영 - 구연산 버퍼, pH를 5.5 (사용이 식물 조직 g 당 버퍼의 ML)의 차가운 솔루션의 100 ML의 존재에 믹서기에서 식물 자료를 균질화.
- cheesecl 3 층을 통해 homogenate를 필터링oth 30 분에 27,000 XG에서 원심 분리하여 명확히. 차가운 졸업 실린더로 표면에 뜨는을 전송, 볼륨을 측정하고 차가운 멸균 비이커에 전송할 수 있습니다. 펠렛을 폐기하십시오.
- 4 ° C에서 15 분 동안 저어, 10 % 폴리에틸렌 글리콜 8 천 (PEG 8,000)를 추가하여 표면에 뜨는을 처리, 4에서 추가 45 분에 품다 ° C 바이러스 같은 입자 (VLPs) PEG 행렬을 침전 할 수 있습니다.
- 4 ° C에서 20 분에 27,000 XG에서 샘플을 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 제거합니다.
- 0.05 M 오세영 - 구연산 버퍼, 5.5 2 % 포함 튼 X-100 산도 8 ML을 추가하여 펠렛을 처리합니다. 소용돌이 원심 분리기 튜브는 잘 펠릿을 해제합니다. 차가운 멸균 비커에 펠렛과 버퍼를 전송합니다. 같은 버퍼 2 ML 즉시 튜브를 씻어 비커에 추가 할 수 있습니다. 펠릿은 (일반적으로 1 시간) 용해 아르 ° C까지 4에 정지 저어.
- 27,000 XG에서 5 분 동안 원심 분리하여 명확히, 펠렛을 버리고, 및 P4의 2 시간에 140,000 XG에서 원심 분리하여 rocess는 표면에 뜨는 ° C.
- 한 ML 0.05 M 오세영 - 구연산 버퍼, 산도 5.5에서 펠렛을 Resuspend하고 0.05 M 오세영 - 구연산 버퍼, 산도 5.5에서 만든 10-40%의 자당 기울기 위의 정지를 놓습니다.
- 4에 140,000 XG에 3 시간의 기울기를 원심 분리기 ° C.
- 원심 분리기 튜브의 상단을 통해 빛을 밝히고 튜브의 상단에서 4cm의 광 산란 상단 밴드를 수집, 4에서 140,000 XG에서 3 시간에 0.05 M 오세영 - 구연산 버퍼, 산도 5.5 및 원심 분리기로 희석 ° C.
- 최대 6 개월까지에 대해 4 ° C에서 멸균 물과 매장의 0.5 ML에서 펠렛을 Resuspend.
- 브래드 포드 단백질 분석을 수행하여 VLPs 농도를 Quantitate. VLPs의 수율은 식물 조직의 1 ~ 3 μg / g입니다.
2. VLPs의 Fluorescein-5-maleimide-라벨 반응
- 50 MM 나트륨 phosphat에 fluorescein-5-maleimide (427.37 g / 사마귀)의 1 ㎜ 솔루션을 준비전자 버퍼, 산도 7.0, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 소용돌이를 사용하여 혼합하고 완전한 해산을 확인합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 관을 보호합니다.
- 단계 1과 믹스에서 생산 VLPs에 fluorescein-5-maleimide을 추가합니다. sulfhydryls의 몰 금액에 대한 fluorescein-5-maleimide의 25 배를 초과 몰을 사용합니다. 일반적으로, 1 μg / μl과 fluorescein-5-maleimide 솔루션 60 μl의 농도에 VLPs의 30 μl를 사용하여 허용 결과를 생산하고 있습니다.
- 4 ° C.에서 상온이나 야간 2 시간의 반응을 품다
- 50 mm의 최종 농도에 dithiothreitol (DTT)를 추가하여 반응을 종료 할 수 있습니다.
- 제거되지 않은 반응 상온에서 1,500 XG에서 2 분을위한 탈염 스핀 컬럼 (열 과학 Inc의, 록 포드 IL)과 원심 분리를 사용하여 fluorescein.
- SDS-PAGE 분석은 각 반응의 10 μl로 2 X SDS-PAGE Laemmli 샘플 버퍼 10 μl를 추가합니다. 포기 개월에 대해 4 ° C에서 빛으로부터 보호 표시된 단백질을 저장최대 3 개월까지 -20 ° C에서 단일 사용 aliquots 인치
3. 비오틴의 설립의 반응과 결정에 라벨 지정
- 물에서 인산염 버퍼 생리 (PBS) 1 단계에서 생산 VLPs의 산도 7.0에 버퍼 교환을 수행하는 탈염 스핀 열을 (열 과학 주식회사, 록 포드 IL)을 사용합니다.
- 아래로 pipetting과에 의해 maleimide-PEG2 - 비오틴과 혼합 없음 - 체중에 PBS의 190 μl를 추가하여 maleimide-PEG2 - 비오틴의 20 MM 주식 솔루션을 준비합니다.
- VLPs 및 혼합에 maleimide-PEG2 - 비오틴을 추가합니다. VLPs 솔루션을 시약의 10 배 어금니 초과를 사용 ≤ 2 밀리그램 / ML.
- 4 시간 동안 실온에서 반응을 품다.
- 제거되지 않은 반응 상온에서 1,500 XG에서 2 분을위한 탈염 스핀 컬럼 (열 과학 Inc의, 록 포드 IL)과 원심 분리를 사용하여 maleimide-PEG2 - 비오틴합니다.
- 피어스 비오틴 Quantitation 키트 (열 과학)과 구경을 사용하여 VLPs의 첩자 당 비오틴의 첩자를 결정제조업체의 지시 사항을 llowing.
4. Cys 2 VLPs와 F 펩타이드의 상호 연결
- 2 단계 (Cys 2 VLPs)에 교차 연결에 사용할 수 시스테인 잔류 물이 발생 VLPs는 다음 단계에 사용됩니다. 디메틸 sulfoxide의 680 μl에 NHS-PEG4-maleimide의 가교제의 10 밀리그램을 용해하여 신선한 간 연결 재고 솔루션 (28.63 MM)를 준비합니다.
- 17 (F)를 분해 - 아미노 활용 버퍼 50 μl (1 개 PBS, pH를 7.2, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 산 긴 펩타이드 (LLPNMOKDKEACAKAPL) 0.1 mm의 농도에.
- 1 ㎜ 최종 농도 (이는 펩타이드 솔루션의 0.1 MM의 10 배를 초과 몰입니다)에 용해 된 펩타이드 (단백질 NH2)의 50 μl에 가교제 4 μl를 추가합니다.
- 4 ° C.에서 2 시간의 반응을 품다
- 1500 XG에서 원심 분리하여, 활용 버퍼 (1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 개 PBS, pH를 7.2)와 equilibrated 탈염 열 (열 과학 주식회사, 록 포드 IL)를 사용하여 교차 연결된 펩타이드를 정화상온에서 1 분에.
- VLPs (단백질 SH) 및 반응과 VLPs과 펩타이드 사이의 분자량의 차이에 참여 thiols와 활성 아민의 수에 의해 결정 몰 비율로 교차 연결된 펩티드 (단백질 NH2)를 결합 반응 믹스를 설정합니다.
- 4 ° C.에서 2 시간 동안 실온에서 반응 혼합물을 품다
- 서양 얼룩 분석을 위해, Laemmli 버퍼, 10 분에 종기가있는 결과로 복합 제품 1:1 혼합 10~20% 트리스 - 글리신 젤 (Invitrogen) 미리 캐스트에 SDS-PAGE를 수행에 electroblotting 다음 니트로 셀룰로스 막 (Invitrogen). 1 개 PBS, pH를 7.2이 0.05 % 십대 초반 - 20 (PBS-십대 초반)와 적절한 인산 가수 분해 효소 - 라벨 차 항체에 이어 펩타이드 특정 항체와 5% 탈지 분유와 프로브를 포함하는으로 세포막을 차단합니다.
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Representative Results
N.의 돌연변이 MRFV 코트 단백질 (CP) 유전자의 일시적 표현 PVX 기반의 벡터 생산 VLPs의 benthamiana 공장은 그림 1에 설명되어 있습니다. 수정 MRFV 코트 단백질 유전자는 PVX 기반 벡터, pP2C2S 2, (D. Baulcombe, 세 인스 베리 연구소, 노리치, 영국의 선물)에서 중복 subgenomic의 CP 프로모터의 전사 제어 PCR에 의해 증폭 한 후 배치됩니다.에서가 체외 RNA 전사는 N.을 예방하는 데 사용되는 RNA 기록을 생산 benthamiana 식물. 감염된 식물에서 (그림 2A) MRFV-CP의 subunits 쉽게 정화 아르 VLPs (그림 2B)을 형성하고 있습니다. 그 후, VLPs은 펩티드로 상호 연결되어 있습니다.
MRFV 코트 단백질의 반응 아미노산의 예는 그림 3에 표시됩니다. 선택한 각 아미노산은 그 표면에 노출 된 경우 moieties를 첨부 할 수 있습니다. chemic알 기술은 라이신, 시스테인의 sulfhydrilic 그룹의 알킬화의 아미노산 그룹의 acylation, 그리고 카르 복실 산 잔류의 활성화 등 및 추가 아민과 커플 링 전통 bioconjugation 전략이 포함되어 있습니다. 또한, 티로신과 트립토판의 방향족 그룹 디아 조화 및 알킬화를 통해 bioconjugation에 대한 매력적인 대상이 될 수 있습니다.
thiol 특정 시약에 VLPs의 Cys 잔류의 용매 접근성은 그림 4에 도시된다. 정화 중량 - VLPs (레인 4) 및 위치에 시스테인 잔류 물을 들고 Cys-VLPs 돌연변이 CP 유전자 12 107-111 (레인 1)과 192-194 (레인 3) thiol 특정 시약 (부재와 기본 조건에서 unreactive 아르 형광). Fluorescein-5-maleimide는 CP 유전자 (차선 2)의 위치 125-129에 Cys-VLPs 돌연변이 들고 시스테인 잔류 물에 오렌지 형광을 부여. 그 결과 차선 2 VLPs는 기하학적 arran이 있는지 보여줍니다레인 1과 3의 샘플에있는 시스테인 잔류 물은 아마도 코트 단백질의 접힘에 disulphide 다리에 참여하는 반면 cysteines 잔류의 gement은 용매 노출 무료 thiol 그룹의 결과.
maleimide-PEG2-비오틴과 라벨 반응 Cys 잔류 용매의 접근성 분석의 또 다른 예를 나타냅니다 biotinylation 분석이 나타납니다. 비오틴은 상대적으로 작은 분자이기 때문에 그림 5와 같이 아비딘 중 하나 분자를 바인딩 할 수 있습니다 각각의, VLPs에 여러 복사본에 복합 될 수 있습니다. biotinylation의 수준은, 단백질 13 사마귀 당 비오틴의 84.74 사마귀는 VLPs에 부착 된 비오틴 분자의 수를 나타냅니다 결과적으로 외부 표면에 표시 할 수 리간드의 수. 때문에 VLPs에 여러 thiol 그룹의 가용성을, 펩티드는 NHS-PEG4-maleimide와 가교 반응에 의해 첨부 할 수 있습니다. 이 시약은 사람이다 아민 및 설프 하이 드릴 함유 분자의 공유 결합 결합을 허용, 이러한 N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테르와 maleimide 그룹으로 반응 종료를 포함 테로-bifunctional 가교제. 그림 6A와 같이 maleimide이 안정 thioether 채권을 형성 설프 하이 드릴 그룹과 반응하는 반면, NHS 에스테르는 아미드 결합을 형성 차 아민과 반응. 교차 연결 반응은 그림 6B에 도시 된 바와 같이 서양 얼룩에 특정 항체와 immunoreactive 아르 VLPs - 펩타이드 복합체를 생산하고 있습니다.
그림 1. VLPs 정화 및 펩티드의 가교 다음 다음 식물에 VLPs의 생산의 개략도.JPG "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
N.에 T7 성적 접종에 의해 생성 그림 2. 증상 benthamiana 공장 (A)와 생산 VLPs (B)의 전송 전자 현미경.
그림 3. 반응 시스테인 아미노산을 (화살표로 표시)으로 표시 야생 형 (중량) MRFV-CP의 단백질 구조 예측.
fluoros에 복합 VLPs을 정화의 그림 4. SDS-PAGE 분석cein-5-maleimide. (A) 단순히 푸른 안전 얼룩은 단백질을 얼룩하는 데 사용되었습니다. UV 조명 아래에서 (B) Fluorescein-5-maleimide 검색 사진으로. M : Prestained 다양한 단백질 마커 (생체 RAD, 헤라클레스, CA), 1 : Cys 1 VLPs, 2 정화 : Cys 2 VLPs, 3 정화 : 정화 중량 VLPs : Cys 3 VLPs, 4 정화. (Cys 1 VLPs, Cys 2 VLPs 및 Cys 3 VLPs 13 Cys-MRFV - VLPs 돌연변이 있습니다.)
그림 5. (A) 비오틴 라벨 및 (B) fluorescein-5-maleimide 라벨에 대한 설프 하이 드릴 반응성 화학을 보여 isometric VLPs의 = 3 리본 모델 AT.
그림 6. 다이어그램 도시 단백질 상호 연결 Cys 2 VLPs와 F 펩타이드 (A)과 서양 얼룩 사이에 (B) Cys-VLPs-F의 F 펩타이드에 특정 항체를 탐지.에게 M : Prestained 다양한 단백질 마커 (생체 RAD, 헤라클레스, CA), 1. 4 단계에서 생산 Cys-VLPs-F는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
여기에 제시된 방법은 공장 제작 VLPs의 표면에뿐만 아니라 다른 단백질 단지에 존재 반응 cysteines 매우 민감하고 빠른 분석이 가능합니다. Maleimides 안정적인 thioether 채권을 형성하기 위해 무료로 설프 하이 드릴 함유 분자와 반응하여 thiol 특정 시약입니다. 이 방법은 다른 아미노산과 상호 작용에 관여하지 설프 하이 드릴 그룹과 반응 할 수있는 maleimides의 특이성에 그립니다. VLPs의 기본 구조를 유지하는 것은 전체 과정을 매우 중요합니다. 설명 응용 프로그램에서 반응이 VLPs의 기본 구조를 유지하기 위해 네이티브 조건과 산도 7시 수행됩니다. 중성 산도에서 maleimides은 무료 설프 하이 드릴 그룹과 최적의 반응성을 갖추고 있습니다. 이 수정에 액세스 시스테인에 fluorescein 또는 비오틴 둘을 VLPs의 라벨 수 있습니다.
가벼운 산도 (6.5-7.5)와 버퍼 조건은 또한 상호 연결에 고용반응. VLPs에서 기능 그룹의 수는 가교제와 VLPs 사이의 적절한 비율을 결정합니다. 단백질 비율로 낮은 크로스 링커는 많은 기능 그룹이 있습니다 경우에 사용할 수 있습니다. 반대로, 단백질 비율이 높은 크로스 링커는 적은 사용 가능한 기능 그룹으로 사용된다.
공간 팔, cleavability, 화학 조성, 치수 및 용해도 등의 요소의 배열 궁극적으로 사용되는 크로스 linkers의 선택을 결정합니다. 또한, 사용하는 크로스 링커의 선택도 활용에 관련된 두 단백질의 크기 (이 경우 VLPs 및 펩타이드의)의 기능입니다. 이종 bifunctional 교차 linkers는 단백질 펩타이드 또는 단백질 단백질 상호 연결에 이상적입니다. 그들은 게이 bifunctional NHS-에스테르 시약을 사용하는 경우 발생하는 자체 활용 원치 않는 및 중합을 최소화 더 많은 제어 두 단계 반응을 할 수 있습니다. 첫 번째 단계에서, NHS 에스테르는 Wi을 반응아미노산 유대 관계를 형성 일 차 아민. 두 번째 단계에서, maleimide는 thioester 채권을 형성 설프 하이 드릴 그룹과 반응.
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Disclosures
간행물의 상용 제품의 상표 이름의 언급은 특정 정보를 제공 할 목적으로 만 있으며, 농업의 미국 부에 의해 추천이나 승인을 의미하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
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