Summary
Un método para analizar la accesibilidad al disolvente del grupo tiol de residuos de cisteína de
Abstract
Imitando y explotar las propiedades del virus y las características físico-químicas y físicas es una promesa de aportar soluciones a algunos de los desafíos más apremiantes del mundo. La enorme gama y los tipos de virus, junto con sus propiedades intrigantes potencialmente dar un sinfín de oportunidades para las aplicaciones en las tecnologías basadas en el virus. Los virus tienen la capacidad de auto-ensamblarse en partículas con forma discreta y tamaño, la especificidad de la simetría, la polivalencia, y propiedades estables bajo un amplio rango de condiciones de temperatura y pH. No es sorprendente que, con una gama tan notable de las propiedades, los virus se proponen para uso en biomateriales 9, las vacunas 14, 15, materiales electrónicos, herramientas, químicos y electrónicos molecular contenedores 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
A fin de utilizar los virus en la nanotecnología, deben ser modificados a partir de sus formas naturales para impartir nuevas funciones. Este desafiante proceso se puede realizar a través de varios mecanismos incluyendo la modificación genética del genoma viral y químicamente unir moléculas extrañas o deseada a los grupos reactivos de partículas de virus 8. La capacidad de modificar un virus depende principalmente de las propiedades físico-químicas y físicas del virus. Además, las modificaciones genéticas o físico-químico necesario llevar a cabo sin afectar negativamente a la estructura del virus nativo y la función virus. Rayado fino del maíz de virus (MRFV) proteínas de la capa auto-ensamblan en Escherichia coli productoras de VLPs estables y vacío que están estabilizadas por proteína-proteína y las interacciones que se pueden utilizar en aplicaciones basados en virus tecnologías 8. VLPs producidas en plantas de tabaco se examinaron como un andamio sobre el que puede ser una variedad de péptidos covalentemente muestra 13. Aquí, se describen los pasos para 1) determinar cuál de las cisteínas accesible al disolvente en una cápside de virus están disponibles para la modificacióncatiónico, y 2) Bioconjugate péptidos a las cápsidas modificadas. Mediante el uso de los residuos de aminoácidos nativos o mutacionalmente inserta-ácidos y las tecnologías estándar de acoplamiento, una amplia variedad de materiales han sido presentados en la superficie de virus de plantas tales como, virus del mosaico del bromo 3, virus del moteado del clavel 12, caupí virus del moteado clorótico 6, del mosaico del tabaco 17 virus, virus mosaico amarillo del nabo 1, y MRFV 13.
Protocol
1. Virus Inoculación y purificación de las VLP plantas de Nicotiana benthamiana
- Producir recubiertas T7-ARN transcritos de Potato virus X (PVX)-basados en plásmidos vectores que transportan MRFV de tipo salvaje (wt) y las proteínas Cys-mutado capa (CP) 12 genes, utilizando T7-mMessage mMachine de Ambion Kit.
- Para cada reacción de transcripción T7, inocular dos hojas completamente expandidas de N. benthamiana con 10 reacciones mu l y se incuban las plantas durante 10 días en invernadero, a 60% de humedad durante 16 h con luz (25.000-30.000 lux) a 25 ° C y 8 horas de oscuridad a 20 ° C.
- Harves camisetas N. benthamiana infectadas por el virus hojas 10 días después de la inoculación (dpi), pese el tejido de la planta (50 gramos), y meterlo en hielo.
- Homogeneizar el material vegetal en una mezcladora en presencia de 100 ml de una solución enfriada de 0,5 M de citrato sódico, pH 5,5 (uso 2 ml de tampón por gramo de tejido de la planta).
- Filtrar homogeneizado a través de 3 capas de cheeseclanto y clarificar por centrifugación a 27.000 xg durante 30 min. Transferir el sobrenadante a un cilindro graduado fría, medir el volumen y, a continuación, transferir a un matraz estéril fría. Descartar el sedimento.
- Procesar el sobrenadante mediante la adición de 10% de polietilenglicol 8.000 (PEG 8.000), se agita durante 15 min a 4 ° C, y se incuba durante 45 min a 4 ° C para precipitar las partículas parecidas a virus-(VLPs)-PEG matriz.
- Centrifugar la muestra a 27.000 xg durante 20 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante.
- Procesar el precipitado mediante la adición de 8 ml de 0,05 M tampón citrato de Na, 5,5 que contiene 2% de Triton X-100 pH. Remolino tubos de la centrífuga bien para liberar el sedimento. Transferir el sedimento y tampón a un vaso de precipitados estéril enfriada. Enjuague los tubos inmediatamente con 2 ml del mismo tampón y añadir al vaso de precipitados. Se agita la suspensión a 4 ° C hasta que los gránulos se disolvieron (generalmente 1 hr).
- Clarificar por centrifugación durante 5 min a 27.000 xg, desechar el sedimento, y proceso el sobrenadante por centrifugación a 140.000 xg durante 2 horas a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado en 1 ml de 0,05 M de citrato sódico, pH 5,5 y colocar la suspensión en la parte superior de un gradiente de sacarosa al 10-40% hecha en 0,05 M de citrato sódico, pH 5,5.
- Centrifugar el gradiente durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C.
- Brillar una luz sobre la parte superior del tubo de centrífuga y recoger la banda de dispersión de luz superior a 4 cm de la parte superior del tubo, se diluye con 0,05 M de citrato sódico, pH 5,5, y se centrifuga durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado en 0,5 ml de agua estéril y se almacena a 4 ° C durante hasta seis meses.
- Cuantificar la concentración de las VLP realizando un ensayo de proteínas de Bradford. El rendimiento de las VLP es de entre 1 y 3 mg / g de tejido de la planta.
2. Fluoresceína-5-maleimida-etiquetado Reacciones de VLPs
- Preparar una solución 1 mM de fluoresceína-5-maleimida (427,37 g / mol) en 50 mM de sodio Phosphate tampón, pH 7,0, 1 mM EDTA. Mezclar utilizando el vórtice y verificar la completa disolución. Evite que el tubo de la luz utilizando una lámina de aluminio.
- Añadir fluoresceína-5-maleimida para VLPs producidas en la etapa 1 y mezclar. Usar un exceso molar de 25-veces de fluoresceína-5-maleimida para la cantidad molar de sulfhidrilos. Generalmente, usando 30 l de VLPs en la concentración de 1 g / l y 60 l de la solución de fluoresceína-5-maleimida produce resultados aceptables.
- Se incuba la reacción durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Terminar la reacción mediante la adición de ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 50 mM.
- Eliminar sin reaccionar fluoresceína utilizando una columna de centrifugación de desalado (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) y centrifugación durante 2 min a 1.500 xg, a temperatura ambiente.
- Para análisis SDS-PAGE, añadir 10 l de 2 x SDS-PAGE de tampón de muestra de Laemmli a 10 l de cada reacción. La tienda de la proteína marcada protegido de la luz a 4 º C hasta por un mes ode un solo uso en alícuotas a -20 ° C hasta 3 meses.
3. Etiquetado de Reacción y Determinación de Constitución Biotina
- Utilice la desalación columnas de centrifugado (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) para llevar a cabo un intercambio de tampón de agua a salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0 de las VLPs producidas en el paso 1.
- Preparar una solución madre 20 mM de maleimida-PEG2-biotina mediante la adición de 190 l de PBS en n-Weigh maleimida-PEG2-biotina y mezclar pipeteando arriba y abajo.
- Añadir maleimida-PEG2-biotina a las VLPs y mezclar. Usar un exceso molar de 10 veces de reactivo de soluciones VLPs ≤ 2 mg / ml.
- Se incuba la reacción a temperatura ambiente durante 4 h.
- Eliminar no reaccionado maleimida-PEG2-biotina usando una columna de centrifugación de desalado (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) y centrifugación durante 2 min a 1.500 xg, a temperatura ambiente.
- Determine los moles de biotina por moles de VLP utilizando el Kit de cuantificación Pierce Biotina (Thermo Scientific) y foguientes instrucciones del fabricante.
4. La reticulación de Cys 2-VLP y el péptido F
- VLPs que resultó en residuos de cisteína disponibles para la reticulación en el paso 2 (Cys 2-VLPs) se utilizó en la etapa siguiente. Preparar una nueva reticulación solución madre (28,63 mM) disolviendo 10 mg de NHS-peg4-maleimida reticulante en 680 l de sulfóxido de dimetilo.
- Disolver un 17 (F)-amino ácido péptido largo (LLPNMOKDKEACAKAPL) en 50 l de tampón de conjugación (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) en una concentración de 0,1 mM.
- Añadir 4 l de agente de reticulación a 50 l de péptido disuelto (proteína-NH2) en 1 mM de concentración final (que es un exceso molar de 10-veces para 0,1 mM de solución de péptido).
- Se incuba la reacción durante 2 horas a 4 ° C.
- Purificar reticulado péptido usando una columna de desalación (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) equilibrada con tampón de conjugación (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) mediante centrifugación a 1.500 xgdurante 1 min a temperatura ambiente.
- Configurar una mezcla de reacción de la combinación de VLPs (proteína-SH) y reticulado péptido (proteína-NH2) en una relación molar determinada por el número de tioles y aminas activadas implicadas en la reacción y la diferencia de peso molecular entre VLPs y péptido.
- Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas a 4 ° C.
- Para el análisis de transferencia Western, mezclar el producto resultante conjugado 1:1 con tampón de Laemmli, hervir durante 10 min, y proceder con SDS-PAGE en un molde pre-10-20% Tris-Glicina gel (Invitrogen), seguido de electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). Bloquear las membranas con 1 x PBS, pH 7,2 que contiene 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) y 5% de polvo de leche descremada y la sonda con el péptido de anticuerpos específicos seguidos por la fosfatasa apropiada anticuerpo secundario marcado.
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Representative Results
La expresión transitoria de mutantes MRFV capa de proteínas (CP) genes en N. benthamiana plantas en un vector PVX VLPs basadas productoras se describe en la figura 1. La modificación capa MRFV gen de la proteína se amplifica por PCR y se coloca entonces bajo el control transcripcional del promotor subgenómico de CP duplicada en un vector basado en PVX, pP2C2S 2, (un regalo de D. Baulcombe, Laboratorios Sainsbury, Norwich, Inglaterra). En vitro la transcripción del ARN produce transcripciones de ARN que luego se utilizan para inocular N. benthamiana plantas. En las plantas infectadas (Figura 2A) MRFV-CP subunidades forma VLPs (Figura 2B), que se purifican fácilmente. Posteriormente, las VLP se reticulan a péptidos.
Un ejemplo de reactivos aminoácidos de la proteína de la cubierta MRFV se muestra en la Figura 3. Cada aminoácido seleccionado puede usarse para unir restos de si se trata de la superficie expuesta. La empresa químicatécnicas de la IA incluyen estrategias tradicionales bioconjugación tales como, la acilación del grupo amino de la lisina, la alquilación del grupo sulfhydrilic de cisteína, y la activación de los residuos de ácido carboxílico y acoplamiento con aminas añadidos. Además, los grupos aromáticos de tirosina y el triptófano pueden ser dianas atractivas para la bioconjugación a través de diazotación y alquilación.
La accesibilidad al disolvente de los residuos de Cys de las VLP a tiol reactivos específicos se ilustra en la Figura 4. Purificado en peso VLPs (carril 4) y Cys-VLP mutantes que llevan residuos de cisteína en la posición 107 a 111 (calle 1) y 192 a 194 (carril 3) del gen CP 12 no son reactivos en condiciones nativas con tiol reactivo específico (ausencia de fluorescencia). Fluoresceína-5-maleimida imparte fluorescencia naranja sólo para los residuos de Cys-VLP de mutantes de cisteína en libros en la posición 125-129 del gen CP (carril 2). El resultado muestra que las VLP en el carril 2 tiene un geométrico Arrantión de residuos de cisteína resulta en disolvente expuestos grupos tiol libres, mientras que los residuos de cisteína en las muestras en las calles 1 y 3 son tal vez implicados en puentes de disulfuro en el plegamiento de la proteína de la cubierta.
Reacciones de rotulación con maleimida-PEG2-biotina seguido por un ensayo de biotinilación representan otro ejemplo de análisis de la accesibilidad de disolvente de residuos de Cys. Debido a que la biotina es una molécula relativamente pequeña, puede ser conjugado en varias copias en las VLPs, cada uno de los cuales se puede unir una molécula de avidina como se muestra en la Figura 5. El nivel de biotinilación, 84,74 moles de biotina por mol de proteína de 13, indica el número de las moléculas de biotina unidas a las VLPs y en consecuencia el número de ligandos que se pueden mostrar en la superficie exterior. Debido a la disponibilidad de varios grupos tiol en las VLPs, los péptidos pueden unirse por reacciones de reticulación con NHS-peg4-maleimida. Este reactivo es un él tero-entrecruzador bifuncional que contiene extremos reactivos, tales como N-hidroxisuccinimida (NHS) éster y grupos maleimida, lo que permite la conjugación covalente de moléculas de amina-y que contiene sulfhidrilo. Como se muestra en la Figura 6A, el éster de NHS reacciona con aminas primarias que forman enlaces amida, mientras que maleimida reacciona con grupos sulfhidrilo formando enlaces tioéter estables. Reacciones de reticulación producir VLPs-péptido que son inmunorreactivos con los anticuerpos específicos en Western blot como se muestra en la Figura 6B.
Figura 1. Diagrama esquemático de la producción de VLPs en las plantas, seguido por purificación VLPs y reticulación subsiguiente de péptidos.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.
Figura 2. Los síntomas producidos por T7 transcripciones inoculación en N. plantas benthamiana (A) y microscopía electrónica de transmisión de las VLPs producidas (B).
Figura 3. Una predicción de estructura de proteína de tipo salvaje (wt)-MRFV-CP mostrando ácidos reactivos de cisteína amino (indicado por flechas).
Figura 4. Análisis SDS-PAGE de VLP purificado conjugado con fluoroscopiacein-5-maleimida. (A) Simply Blue segura mancha se utiliza para teñir proteínas. (B) con fluoresceína-5-maleimida detección por fotografía bajo iluminación UV. M: marcador preteñidos amplia gama de proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: 1-Cys purificada VLP, 2: 2-Cys purificada VLP, 3: 3-Cys purificada VLP, 4: VLPs purificadas en peso. (Cys 1-VLPs, VLPs-Cys 2 y 3 Cys Cys VLPs-son-MRFV-VLP mutantes 13).
Figura 5. AT = 3 modelo de cinta de VLPs isométrica que muestra la química de reactivo de sulfhidrilo para (A) etiquetado biotina y (B) etiquetado con fluoresceína-5-maleimida.
Figura 6. Diagrama que ilustra proteína de reticulación entre Cys 2-VLPs y F péptido (A) y Western blot (B) de la Cys-VLPs-F probaron con anticuerpos específicos para el péptido F. M: prestained marcador amplio rango de proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-VLP-F producido en el paso 4 Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
El método presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de cisteínas reactivas presentes en la superficie de VLPs producidos por plantas así como en otros complejos de proteínas. Las maleimidas son tiol reactivos específicos, que reaccionan con sulfhidrilo libres que contienen moléculas para formar enlaces tioéter estables. Este método se basa en la especificidad de las maleimidas para reaccionar con grupos sulfhidrilo que no participan en las interacciones con otros aminoácidos. Preservar la estructura nativa de las VLP es muy importante a través de todo el proceso. En la aplicación descrita, las reacciones se realizan en condiciones nativas y a pH 7 para mantener la estructura nativa de las VLPs. A pH neutro, maleimidas tienen reactividad óptima con grupos sulfhidrilo libres. Esto permite el etiquetado de las VLP, ya sea con fluoresceína o biotina a cisteína accesible a modificaciones.
PH suave (6.5 a 7.5) y condiciones de tampón se emplean también en la reticulaciónreacciones. El número de grupos funcionales en las VLPs determina la relación adecuada entre reticulante y VLPs. Baja reticulante a las proporciones de proteína se puede utilizar en los casos en los que hay muchos grupos funcionales. A la inversa, una mayor reticulación de al cociente de proteína se emplea con un menor número de grupos funcionales disponibles.
Una serie de factores, entre ellos el brazo espacio, cleavability, composición química, dimensión y solubilidad en última instancia determinan la selección de agentes de reticulación utilizados. Además, la elección del agente de reticulación utilizado es también una función del tamaño de las dos proteínas (en este caso, las VLPs y péptidos) que participan en la conjugación. Hetero-bifuncionales reticulantes son ideales para la proteína-péptido o proteína-proteína de reticulación. Ellos permiten más de dos pasos controlados reacciones que reducen al mínimo la indeseada auto-conjugación y la polimerización que se produce cuando bifuncionales homo-NHS-éster reactivos se utilizan. En la primera etapa, el éster de NHS reacciona with aminas primarias que forman enlaces amino. En el segundo paso, la maleimida reacciona con los grupos sulfhidrilo que forman enlaces tioéster.
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Disclosures
La mención de los nombres comerciales de los productos comerciales de la publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de EE.UU..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
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