En fremgangsmåde til at analysere opløsningsmidlet adgang til thiolgruppen af cysteinrester af<em> Majs rayado fino virus</em> (MRFV)-viruslignende partikler (VLP'er) efterfulgt af et peptid tværbindingsreaktion er beskrevet. Fremgangsmåden drager fordel af tilgængeligheden af adskillige kemiske grupper på overfladen af VLP'er, der kan være mål for specifikke reaktioner.
Efterligning og udnytte virus egenskaber og fysisk-kemiske og fysiske egenskaber besidder løfte om at levere løsninger til nogle af verdens mest presserende udfordringer. Alene rækkevidde og virustyper kombineret med deres spændende egenskaber potentielt give uendelige muligheder for ansøgninger i virus-baserede teknologier. Vira har evnen til at selv-samle til partikler med diskrete form og størrelse, specificitet symmetri, alsidighed og stabile egenskaber under et bredt område af temperatur-og pH-betingelser. Ikke overraskende med sådan en bemærkelsesværdig vifte af egenskaber, er virus foreslået til anvendelse i biomaterialer 9, vacciner 14, 15, elektroniske materialer, kemiske værktøjer og molekylær elektronisk beholdere 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
For at udnytte virus inden for nanoteknologi, skal de ændres fra deres naturlige former for at give nye funktioner. Denne udfordrende process kan udføres gennem flere mekanismer, herunder genetisk modifikation af det virale genom og kemisk fastgørelse af fremmede eller ønskede molekyler til viruspartiklen reaktive grupper 8. Evnen til at ændre en virus primært afhænger af de fysisk-kemiske og fysiske egenskaber af viruset. Desuden skal de genetiske eller fysisk-modifikationer, der skal udføres uden at påvirke den virus native struktur og virus-funktion. Majs rayado fino virus (MRFV) kappeproteiner selv samle i Escherichia coli, der producerer stabile og tomme VLP'er, der er stabiliseret med protein-protein interaktioner og som kan anvendes i virus-baserede teknologier applikationer 8. VLP'er produceret i tobaksplanter blev undersøgt som et stillads, på hvilken forskellige peptider kan være kovalent vises 13. Her beskriver vi trinene til 1) bestemme, hvilken af de opløsningsmiddel-tilgængelige cysteiner i en virus capsid fås til modifikation, og 2) Bioconjugate peptider til de modificerede capsider. Ved anvendelse af native eller mutation-indsat aminosyrerester og standard koblingsmidler teknologi, har en bred vifte af materialer er vist på overfladen af plantevirus, såsom Brome mosaikvirus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotisk skjoldet virussatellit 6, tobak mosaik virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1 og MRFV 13.
Fremgangsmåden præsenteres her muliggør en meget følsom og hurtig analyse af reaktive cysteiner er til stede på overfladen af plante-produceret VLP'er samt andre protein-komplekser. Maleimider er thiol-specifikke reagenser, som reagerer med frie sulfhydrylholdige molekyler til dannelse af stabile thioetherbindinger. Denne metode bygger på specificitet maleimider til at reagere med sulfhydrylgrupper ikke er involveret i samspillet med andre aminosyrer. Bevarer den native struktur af VLP'erne er meget …
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |