Summary
Bestemmelse donorcelle engraftment er en udfordring i mus knoglemarvstransplanterede modeller, der mangler veldefinerede fænotypiske markører. Vi beskrev en metode til at kvantificere mandlig donorcelle indpodning hos kvindelige transplantation recipientmus. Denne metode kan anvendes i alle musestammer til studiet af HSC funktioner.
Abstract
Murine knoglemarvstransplantation modeller giver et vigtigt redskab til måling af hæmatopoietiske stamceller (HSC) funktioner og bestemme gener / molekyler, der regulerer HSCs. I disse transplanterede modelsystemer, er funktionen af HSCs bestemt ved evnen af disse celler til indpode og rekonstituere letalt bestrålede recipientmus. Almindeligvis donorcellen bidrag / engraftment målt ved antistoffer mod donor-specifikke celleoverfladeproteiner ved anvendelse af flowcytometri. Men denne metode afhænger i høj grad af specificitet og evnen af celleoverflademarkør at differentiere donor-afledte celler fra recipient-stammer celler, som måske ikke er tilgængelige for alle musestammer. Blandt de forskellige baggrunde af genetisk modificerede musestammer på markedet, denne celleoverfladen / flowcytometri-baseret metode har væsentlige begrænsninger især i musestammer, som mangler veldefinerede overflademarkører at adskille donorceller fra congene recipient ceLLS. Her vi rapporteret en PCR-baseret teknik til at bestemme donorcelle engraftment / bidrag transplantation recipientmus. Vi transplanteret mandlige donorknoglemarv HSCs til letalt bestrålede kongene hunmus. Perifere blodprøver blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter transplantation. Knoglemarvsprøver blev opnået ved afslutningen af forsøgene. Genomisk DNA blev isoleret og Y-kromosomet specifikt gen, Zfy1, blev amplificeret ved brug af kvantitativ real time PCR. Den indpodning af mandlige donor-afledte celler i de kvindelige recipientmus blev beregnet mod standardkurve med kendte procentdel af mandlige vs kvindelige DNA'er. Bcl2 blev anvendt som reference-gen at normalisere den totale DNA beløb. Vore data tydede på, at denne fremgangsmåde pålideligt bestemmer donorcelle engraftment og giver en nyttig, men enkel fremgangsmåde til måling af hæmatopoietisk celle rekonstituering i murine knoglemarvstransplantation modeller. Vores metode kan rutinemæssigt udføres i de fleste laboratorier, da ingendyrt udstyr, såsom flowcytometri er påkrævet.
Introduction
Murin knoglemarv (BM) transplantation model blev først udviklet i 1960'erne 1. Denne model er blevet omfattende anvendt til undersøgelse af donor hæmatopoietisk stamcelle (HSC) biologi i en vært recipient mus. Murin knoglemarvstransplantation model har givet os værdifuld viden om HSC funktioner og deres regulering, og er uundværlig i HSC forskning. Allogen knoglemarvstransplantation model som C57BL/6J H2b-Balb / C H2d eller kongene transplantation model som C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 anvendes i mange laboratorier for at studere genfunktion på HSC aktivitet 2, virkningen af lægemiddelbehandling på HSC funktion 3 eller transplantation sygdomme, såsom graft-versus-vært sygdom (GVHD) 4.
Celleoverflademarkører, såsom MHC haplotype eller CD45.1 er almindeligt anvendt til at skelne mellem donor-afledte celler fra recipient-stammer celler. C57BL/6J H2b, CD45.2 H2d og B6.SJL CD45.1 er de mest almindeligt anvendte musestammer i knoglemarvstransplantation, fordi donorcellen bidrag kan let vurderes ved flow-cytometri måling CD45.1 mod CD45.2 eller H2b vs H2d. Men mange andre stammer, såsom FVB / NJ 5 og C3H også ofte til at generere genetisk manipuleret transgene eller knockout-mus. Disse mus kan tilbagekrydset til en indavlet linie og holdes i en blandet genetisk / MHC baggrund. I disse tilfælde kunne bestemme donorcelle engraftment og HSC funktionen være vanskeligt som donor specifik-celleoverflademarkører ikke kan være til rådighed.
Ved hjælp af Y-kromosom-specifik DNA-probe til påvisning donor mandlige celler ved Southern blot i sex-mismatchede knoglemarvstransplantation blev først udviklet af Dr. Miwa gruppe 6. Derefter blev en real-time PCR for sex-bestemmende region Y sig at være en nøjagtig og yderst specifik metode til kvantificering af male føtale celler i moderblod system 7. Dette koncept blev tilpasset af Dr. Schwarzenberger gruppe for udvikling af en real-time PCR teknik i et murint knoglemarvstransplantation til bestemmelse donorcelle engraftment 8. Vi yderligere modificeret denne metode til måling af donorcellen indpodning i FVB / NJ mus knoglemarvstransplantation model. Denne metode er i øjeblikket udstrakt grad i vores gruppe for at studere den rolle Pim1 kinase i HSC biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bone Marrow Cell Isolation
- Aflive mandlige donorer FVB / NJ mus og kvindelige FVB / NJ mus ved hjælp af CO2 metode efterfulgt af cervikal dislokation. De kvindelige FVB / NJ knoglemarvsceller vil blive brugt som kompetitive celler.
- Brug en lille saks og pincet, dissekere ud lårben og tibiaes fra mus og placere dem i en 60 mm vævsdyrkningsskål indeholdende 6 ml iskold RPMI1640 med 5% varmeinaktiveret FBS. Brug Kimwipe væv at fjerne muskler og andre væv. Afbrød begge ender af hvert knogleskaft i skålen.
- Tilslut enden af knoglen med 23G nål på 3 ml sprøjte, skyller knoglemarv med RPMI1640 med 5% varmeinaktiveret FBS i skålen. Disaggregere knoglemarv væv ved gentagne aspirationer anvender den samme nål. Overførsel af cellesuspensionen til 15 ml centrifugerør.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 400 x g, supernatanten fjernes, cellerne resuspenderes i 1 ml stuetemperatur røde blodlegemer lysisbuffer (155 mM potassium bicarbonat, 10 mM ammoniumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH = 7,4) og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter hvorefter der tilsættes 5-10 ml RPMI 1640 med 5% varmeinaktiveret FBS.
- Passere cellerne ved hjælp af en celle si. Opsaml strømmen gennem til et nyt rør. Spin ned i 5 minutter ved 400 x g. Fjern supernatanten; cellepelleten bør ikke indeholde nogen rød farve. Fraværet af røde farve indikerer en fuldstændig fjernelse af røde blodlegemer. Resuspender cellepelleten i 10 ml af RPMI1640 med 5% varmeinaktiveret FBS. Forsigtigt vortex for at sikre, at cellesuspensionen er fuldstændig ensartet. Udtag en aliquot og tæl cellerne i et hæmacytometer. Beregne, hvor meget mængden af celler, der er nødvendige for knoglemarvstransplantation, og alikvote nok celler og bland mandlige donorceller med konkurrerende kvindelige celler ved et forhold på 5:2. Spin ned i 5 minutter ved 400 x g, vaskes med PBS, resuspender i PBS med slutkoncentrationen af donorceller på 5 × 10 6 / ml og konkurrent-celler ved 2 x 10 6
2. Konkurrencedygtige knoglemarvstransplantation
- Bestråle kvindelige recipientmus (8-12 wks gamle) med 137Cs gamma-strålerne radiator ved en enkelt dosis på 11Gy 4-6 timer inden knoglemarvstransplantation.
- Placer de bestrålede hunmus i en mus harpiksstopperen. Injicere den blandede donor og konkurrerende celler via halevenen i 0,1 ml af det samlede volumen, således at hver mus modtager 5 × 10 5 donorceller og 2 × 10 5 konkurrerende knoglemarvsceller.
3. Prøvetagning
Par uger efter knoglemarvstransplantation, indsamle perifere blodprøver (~ 50 ul) fra kvindelige recipient mus ved retro-orbital blødning under bedøvelse tilstand. Opsamles i EDTA-rør. BM prøver kan også indsamles ved afslutningen af eksperimentet, sædvanligvis mindst 4 måneder efter transplantation, med samme fremgangsmåder som tidligere beskrevet (trin 1), sædvanligvis 20-40% af1 tibia BM celler er nok til at gøre nok mængde af DNA. Blod eller BM prøver fra alder matchede normale kvindelige og mandlige mus er også indsamles for at forberede standardkurve.
4. Genomisk DNA Isolation
- Tilsæt 4 × volumen stuetemperatur RBC lysis buffer (~ 200 pi) til hver blodprøve. Bland grundigt og inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Der tilsættes 1 ml PBS, derefter dreje ned for at fjerne det meste af lyserede RBC.
- Isolere DNA under anvendelse af en blod-DNA ekstraktion kit (QIAmp Blood DNA ekstraktion kit). Pre-varme elueringspufferen (AE) ved 37 ° C for at forøge udbyttet af eluerede DNA. Mandlige og kvindelige DNA'er for standardkurve, isoleres ligeledes.
- (Valgfrit) Genomisk DNA kan yderligere oprenses eller koncentreres ved hjælp af EtOH fældningsmetode i nærvær af 3 M natriumacetat (pH = 5,5). DNA pellets resuspenderes derefter i 40 til 50 ul destilleret vand til analyse med det samme eller opbevaret ved -20 ° C for fremtidig anvendelse.
- Måle DNA concentration med Nanodrop ND-1000 spektre fotometer. Prøver med OD 260/280 mellem 1,8 til 2,0, anvendes til yderligere analyse.
- Fortynd DNA med DNAase free H2O til 4ng/μl i et samlet volumen på 50 ul.
5. Standard Curve Preparation
Fortynd mandlig DNA og kvindelige DNA til en koncentration på 4 ng / ul, og at DNA-blanding ifølge den Tabel1
| % Af mandlige DNA i Female Baggrund | Volumen (pi) af 4ng/μl mandlige DNA | Volumen (pi) af 4ng/μl kvindelige DNA | Samlet volumen (pi) |
| 0,2 | 1 | 499 | 500 |
| 0,5 | 1 | 199 | 200 |
| 2,5 | 5 | 195 | 200 |
| 12,5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87,5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
Tabel 1. Prøvefremstilling til standardkurve. Normale mandlige og kvindelige FVB / NJ-mus i en alder af 8-12wks blev ofret. Blod og BM celler blev opsamlet. DNA'er fra mandlige celler og kvindelige celler blev isoleret og resuspenderet i en koncentration på 4ng/μl. Han-og hun-DNA'er blev blandet i forskellige forhold til at generere DNA-standardprøven blandinger.
6. Real-time PCR
- Nedsat PCR-reaktionen pladen ved at blande SYBR Green Supermix reagens med primere og genomisk DNA. Reaktionsvolumenet (20 ul) indeholder 400 nM af hver primer og 5 ul af blodlegemer genomisk DNA (4ng/μl x5 pi = 20 ng) i hver reaktion. DNA Samples og standarder blev oprettet i tre eksemplarer. Sekvenserne af primerne er vist i tabel 2.
| Gene navn | Fremad | Reverse |
| Bcl2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
Tabel 2. RT-PCR-primeren sekvensen for murin Bcl2 og Zfy1.
- Udføre PCR reaktion under anvendelse af Biorad iQ5 PCR maskine med følgende betingelser: 95 ° C 3 min, 42 amplifikationscykler ved 95 ° C i 10 sekunder, 58 ° C i 25 sek og 72 ° C i 15 sekunder, efterfulgt af en smelte-kurve trin.
- Opnå Cycle tærskel (Ct) værdier af Bio-Rad iQ5 2,1 Standard Edition Optical System. Beregn δCt (Ct Zfy1 </ Sup>-Ct Bcl2) værdi, og Zfy1 ekspressionsniveau beregnes som værdien af 2-δ Ct.
- Etablere standardkurver for hver reaktion serie anvendelse af 2-δCt læsning fra kendte mandlige / kvindelige standard blandinger. De faste kurver er dannet ved at plotte middelværdien af 2-δCt værdi af triplikater til de kendte% mænd DNA i blanding med lineær regression fitting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og 2 viste eksempler på standardkurver afbildet med middelværdier af 2-δCt mod procentdele af mandlig DNA. Figur 1A viste specifikke smeltetemperatur for BCL2 og Zfy1 amplikoner lokaliseret ved 78,5 ° C og 88,5 ° C, hhv. Bcl2 anvendes som reference-gen at normalisere den totale mængde belastet DNA i hver PCR-reaktion. Bcl2 amplifikations kurver (Log view) for hver standard prøve fusionere med hinanden uafhængig af mandlig DNA-koncentration, hvilket indikerer samme mængde belastet DNA (figur 1B). Imidlertid Zfy1 amplifikation kurve migreret til venstre med stigende mængde mandlig DNA i prøven (figur 1C). For at validere vores metode, testede vi mandlige donorcelle indpodning i transplanterede mus, der modtog BM-celler fra WT vs Pim triple knockout (TKO) mus på forskellige tidspunkter efter transplantation. Både perifert blod (6wks) og BM prøver (16wks) w ere analyseret. HSCs fra Pim TKO mus har defekter i rekonstituering letalt bestrålede mus (An, N et al., Manuskript under revision). Som forventet modtagende mus transplanteret med Pim TKO celler havde en meget lavere procentdel af mandlige celler sammenlignet med mus transplanteret med WT-celler (figur 3).
Fig. 1. (A) repræsentant smeltekurve fra flere prøver med forskellige mandlige DNA-procenter. Toppen ved 78,5 indikerer amplificering af Bcl2, medens toppen ved 88,5 ° C viser amplifikation af Zfy-1. Repræsentative amplifikation kurve fra flere prøver med forskellige mandlige DNA procentsats for Bcl2 (B) og Zfy1 (C), Ct: cycle tærskel.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se større figur.
Figur 2. RT-PCR standardkurve for mandlige DNA procent. Prøver (20 ng DNA i 20 gl totalt volumen) af mandlige og kvindelige DNA-blandingerne opnået fra knoglemarvsceller blev forarbejdet til RT-PCR som beskrevet i protokollen. Middelværdierne af δCt (Ct Zfy1-Ct Bcl2) for individuelle prøver blev beregnet og 2-δ Ct (Y-akse) blev afsat mod mandlig DNA procentdel (X-akse) (område fra 0,2% til 100%) med lineær regression fitting. R2 betegner determinationskoefficienten.
Figur 3. Competitive knoglemarvstransplantation experiments. 5 x 10 5 samlede BM-celler fra han-WT eller alder matchede mandlige Pim triple KO (TKO) mus sammen med 2 x 10 5 female konkurrerende knoglemarvsceller blev transplanteret til bestrålede kvindelige værter. Perifert blod (PB) kimærisme på 6 uger og BM kimærisme på 16 wks efter transplantationen blev estimeret ved procentdelen af mandlig DNA ved RT-PCR som fordømt i protokollen (* p <0,05, ** P <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med vores nuværende undersøgelse er at give publikum en PCR-baseret teknik til at kvantificere donorcelle indpodning i et konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation model. Adskillige undersøgelser er blevet rapporteret under anvendelse af RT-PCR til påvisning af donorceller i transplantation modeller 9-10. Dr. Schwarzenberger gruppe først udviklede en murin knoglemarvstransplantation model ved hjælp af real-time PCR til amplifikation y-kromosom-specifik 8. Denne metode blev anvendt til at undersøge Gli-1-funktion i HSC aktivitet 11. Vi derefter yderligere modificeret protokollen og fremlagde en detaljeret, trin-for-trin forsøgsprotokol i visualiseret format. Den visualiseret præsentation af vores protokol giver publikum mulighed for at følge vores protokol nemt. Vi sammenlignede også vores PCR-resultater under anvendelse af genomisk DNA fra BM prøver vs DNA fra perifert blod. Donor transplantation data fra BM og blodprøver er dybest set konsekvent blev imidlertid normalt mindre variation fundet i BM prøver. Dette ersandsynligvis på grund af resterende hæmoglobin efter RBC i det perifere blod, der kan kompromittere renheden / kvaliteten af genomisk DNA i blodprøver.
Der er flere fordele med vores PCR-baseret teknik til at kvantificere donorcelle indpodning. Først, og vores metode kan udføres i de fleste laboratorier. Der er ikke behov for specialiseret og dyrt udstyr end real time-PCR maskine. Vi yderligere modificeret PCR-reaktion komponent og anvendes SYBR Green Supermix stedet for Taqman. Denne ændring reducerer yderligere omkostninger og udgifter, som vi fjerner fluorescensmærket probe. For det andet vores teknik er pålidelig og meget reproducerbar. Vi brugte Bcl2 henvisning gen til at normalisere det totale DNA beløb i modsætning til DNA kvantificering kit. Bcl2 genet blev anvendt, fordi: 1) dette gen er ikke placeret på Y-kromosomet. Derfor er dets ekspression ikke påvirkes af mandlig donorcelle indpodning. 2). Bcl2 er ikke reguleret af de nuværende transplantation betingelser. Som shselv i figur 1, Bcl2 genet producerer en pålidelig og meget konsekvent kontrol for total DNA loading uafhængig af belastet mandlige DNA værdi. Zfy1 er et zinkfinger-gen i testis bestemmende region 12 og er placeret på Y-kromosom. Det er blevet rapporteret, at genekspressionsniveau af Zfy1 svarer godt til mængden af mandlige celle DNA'er i en mus transplantation model 8. For det tredje vores PCR-baseret teknik er meget følsomme og kan detektere donorcelle indpodning på <1%. Desuden kan prøverne opbevares i lang tid til senere analyse. I modsætning hertil kræver traditionelle flowcytometri-baseret metode øjeblikkelig behandling af prøver. Endelig vores teknik er musestamme uafhængig og kan anvendes til genetisk baggrund, der mangler veldefinerede overflademarkører at adskille donorceller fra recipientceller. Dette er den vigtigste fordel ved denne fremgangsmåde.
Under vores nuværende eksperimentel tilstand (donor / competiteller forholdet er 5/2), observerede vi omkring 80-90% donor indpodning efter 16 uger under anvendelse af PCR-baseret fremgangsmåde. Vore data er helt sammenlignelige med konventionelle, flowcytometri baseret-metode, udviste ~ 95% donorcelle indpodning ved 16 uger efter transplantation med donor (CD45.2) / konkurrent (CD45.1)-forhold på 04:01 2. Sammenlignet med den konventionelle metode, der anvender celleoverflademarkør til påvisning af donorceller i recipientmus, er den største ulempe ved vores metode manglende evne til at analysere indpodning i forskellige subpopulationer af blodceller, såsom i B-celler, T-celler eller granulocytter. Men hvis det er nødvendigt, er det muligt at samle hver population af celler ved hjælp af cellesortering teknik og derefter udsætte prøverne for RT-PCR til at bestemme donorcelle bidrag i hver cellepopulation. Da donorcellen transplantation blev beregnet ud fra standardkurven, prøven udlæsning er fuldstændig afhængig af hældningen og skæring med y-standardkurve. Det er muligt, at vi kan få off-range readout (dvs. over 100% af engraftment). Imidlertid kan disse "falsk positive eller falsk negative" resultater undgås, hvis: 1) de DNA-isoleringsprocedurer for undersøgte prøver og standardkurven prøver er identiske, og 2) den valgte række standardkurve er tæt på den forventede prøve udlæsning. Desuden, da der kan være forskelle i hver PCR-reaktion, og i kalibreringsstatus PCR maskine bør standardkurve prøver indbefattet i hver PCR-plade for at undgå variationer mellem hver PCR-reaktion.
Endelig har vi valideret vores teknik ved hjælp af vores Pim triple KO-mus. I overensstemmelse med foregående rapport 13, fandt vi, at donor HSCs fra Pim triple KO-mus er defekte i rekonstituering letalt bestrålede recipientmus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen konkurrerende økonomiske interesser at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Charles Greenberg for brugen af hans Real time PCR maskine. Dette arbejde understøttes af Musc Hollings Cancer Center Startup Fund, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103.780-01A1, og NIH 3P30CA138313-01S3. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health eller andre finansieringskilder midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
