סימון מטבולי של רנ"א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ"א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים
Summary
סה"כ הסלולרי RNA מספק תבנית עניים לחקר שינויים קצרי טווח בסינתזה וריקבון RNA, כמו גם את הקינטיקה של רנ"א עיבוד. כאן, אנו מתארים תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouridine אחרי biotinylation תיאול ספציפי ולטיהור של RNA החדש שעבד ומאפשר להתגבר על המגבלות האלה.
Abstract
הפיתוח של microarrays השלם transcriptome והדור הבא של רצף יש מהפכה ההבנה של המורכבות של ביטוי גני הסלולר שלנו. יחד עם הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים המעורבים, מידות מדויקות של קינטיקה הבסיסית הפכו להיות חשובה יותר ויותר. כאן מתודולוגיות רבי עוצמה אלה, עומדות בפני מגבלות עיקריות בשל מאפיינים פנימיים של דגימות תבניתו הם לומדים, RNA הסלולרי כלל כלומר. במקרים רבים שינויים ברנ"א הסלולרי כלל להתרחש גם לאט מדי או מהר מדי כדי לייצג את האירועים המולקולריים שבבסיס וקינטיקה שלהם עם רזולוציה מספיקה. בנוסף, התרומה של שינויים בסינתזת רנ"א, עיבוד, וריקבון אינה מובחנות בקלות.
לאחרונה פיתחנו פרופיל גנטי ביטוי ברזולוציה גבוה כדי להתגבר על המגבלות האלה. הגישה שלנו מבוססת על תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouriלסעוד (ובכך גם המכונה 4sU תיוג) ואחריו טיהור קפדני של RNA עבד מחדש באמצעות biotinylation תיאול ספציפי וחרוזים מגנטיים streptavidin מצופים. זה ישים למגוון רחב של יצורים בעלי חוליות, לרבות תסיסנית, ושמרים. אנחנו מיושמים בהצלחה 4sU תיוג ללמוד קינטיקה בזמן אמת של פעילות גורם שעתוק, לספק מדידות מדויקות של RNA מחצית חיים, ולקבל תובנות לתוך רומן קינטיקה של רנ"א עיבוד. לבסוף, יכולים להיות מועסקים מודלים חישוביים ליצירת ניתוח משולב, מקיף של המנגנונים המולקולריים שבבסיס.
Introduction
פרופיל גנטי ביטוי הוא כלי מרכזי המשמש ללמוד תהליכים תאיים וברשת יחסי הגומלין המורכבת המשויכת. שפע מחקרים על mRNA היו בדרך כלל בשיטה של בחירה כדי להשיג תובנות בסיסיות לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס. הפיתוח של microarrays השלם transcriptome 1, ולאחרונה רצף של הדור הבא, של רנ"א (RNA-אילך) 2-4 מונע את הגישה הזו. בעוד טכנולוגיות אלה חוללו מהפכה ההבנה של המורכבות של ביטוי גני הסלולר שלנו שהם עומדים בפני מגבלות עיקריות בשל מאפיינים פנימיים של תבנית המדגם שלהם, כלומר סך הסלולרי RNA. שינויים ראשונים, לטווח קצר ברמות רנ"א הכל אינם תואמים שינויים בשערי שעתוק, אבל מטבעם תלויים ברנ"א מחצית החיים של התמלילים, בהתאמה. בעוד אינדוקציה פי חמישה מתמליל, קידוד לדוגמה קצר לגורם שעתוק, תהיה בקלות להבחין ברנ"א הכלבתוך שעה, אותו הגיוס של תמליל, למשל קידוד חיים ארוכים לאנזים המטבולי, יישאר כמעט בלתי נראה. בנוסף, גם שלם כיבוי (> למטה רגולציה של פי 1,000) בשיעור השעתוק של גן ממוצע עם RNA מחצית חיים של חמש שעות תהיה פשוט לקחת חמש שעות לרמות רנ"א הכל לירידה של רק כפולה . לכן, ניתוח של RNA הכולל מעדיף את זיהוי של עד הוויסות של תמלילים קצרים ימים, שרבים מהם לקודד לגורמי שעתוק וגנים עם פונקציות רגולטוריות 5. בנוסף, המפל קינטית הנכון של רגולציה הוא מוסתר ולא יכול להיות מובחן אירועי איתות ראשוניים משני. שניהם, בתורו, עלולים לגרום להטיה משמעותית בניתוחים ביואינפורמטיקה במורד הזרם. שנית, לא ניתן לייחס שינויים ברמות RNA הכולל לשינויים בסינתזה או ריקבון רנ"א. מדידות של זה האחרון דורשות גישות פולשניות סלולריים, כגון חסימת transcriptiעל שימוש actinomycin 6 ד ', וניטור מורחב של ריקבון מתמשך RNA לאורך זמן. עם ה-mRNA ממוצע מחצית חיים בתאי יונקים של 5 – 10 שעות 5,7, רמות ה-mRNA של רוב הגנים תהיה ירדו רק על ידי פחות מכפול לאחר כמה שעות של מעצר תעתיק. הבדלים קטנים ולא אלו לגרום למדידות לא מדויקות בעליל של mRNA מחצית חיים עבור רוב הגנים סלולריים בשל אופי מעריכי של משוואות המתמטיות המשמשות כבסיס. לבסוף, בעוד RNA-ואילך בסך הכל הסלולרי RNA גילה כי כמחצית מהגנים שלנו כפופה לאירועי שחבור חלופיים 8, קינטיקה הבסיסית, כמו גם את המנגנונים הדינמיים מנחים רגולציה רקמות והקשר ספציפי של RNA עיבוד יישאר הבין היטב. בנוסף, התרומה של רנ"א עיבוד לביטוי ההפרש גן, במיוחד עבור RNAs ללא קידוד, עדיין לא נקבע. בסך הכל, על המגבלות האלה מייצגות מכשולים עיקריים לדוגמנות הקינטית bioinformatic של המנגנונים המולקולריים שבבסיס.
לאחרונה פתחנו גישה, פרופיל גנטי ביטוי ברזולוציה גבוה המכונה, כדי להתגבר על בעיות אלה 5,7,9. היא מבוססת על תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד באמצעות 4-thiouridine (4sU תיוג), נגזרת uridine מתרחש באופן טבעי, ומספקת גישה ישירה לתמלילים חדשים שעבדו עם התערבות מינימאלית בצמיחת תאים וביטוי גנים (ראה איור 1) 5, 10-12. חשיפה של תאים אוקריוטים לתוצאות 4sU בספיגתו המהירה, זירחון 4sU-אדנוזין, והכללתו RNA החדש שעבד. בעקבות בידוד בסך הכל הסלולרי רנ"א, רנ"א שבריר 4sU שכותרתו הוא biotinylated תיאול-במיוחד ליצירת קשר דיסולפיד בין ביוטין ואת הרנ"א חדש שעבד. לאחר מכן ניתן להפריד 'סה"כ סלולרי RNA' כמותית לכותרתו ("זה עתה עיבד ') וללא תווית (' מראש existinרנ"א) "G עם טוהר גבוה באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מצופים. לבסוף, שכותרתו RNA הוא התאושש מן החרוזים פשוט על ידי הוספת סוכן הפחתה (למשל dithiothreitol) ביקוע אג"ח דיסולפיד ומשחרר את הרנ"א חדש שעבד מהחרוזים.
RNA עיבד חדש מתאר את פעילות תעתיק של כל גן במהלך פרק הזמן של חשיפת 4sU. 4sU תיוג בלוח הזמנים של דקות ובכך מספק תמונת תמונת מצב של ביטוי אוקריוטים גן ותבנית אידיאלית לניתוחי bioinformatic מורד זרם (לדוגמה: ניתוח אמרגן). במקרים בהם ניתן להניח תנאי מצב יציב, את היחס של זה עתה עיבד / סך הכל, שזה עתה עיבד / ללא תווית וללא תווית / RNA הכולל לספק גישה לא פולשנית לרנ"א המדויק מחצית חיים 7,13. בנוסף, חשוב לציין כי RNA החדש שעבד מטוהר לאחר קטן כמו 5 דקות של 4sU תיוג (5 דקות 4sU-RNA) הוא צעיר מ -15 ו -60 דקות 4sU-RNA.בעת ביצוע שני אולטרה קצר וארוך יותר בהדרגה 4sU תיוג בהגדרה ניסיונית אחת בשילוב עם RNA-ואילך, קינטיקה של רנ"א עיבוד מתגלה ברזולוציה של נוקלאוטיד 9. לבסוף, ניתוחים בזמן קורס של RNA חדש שעבד ומוחלט בשילוב עם מודלים חישוביים לאפשר ניתוח אינטגרטיבי של סינתזה וריקבון 14-RNA.
לסיכום, גישה זו מאפשרת ניתוח הישיר של הדינמיקה של סינתזת RNA, עיבוד, והשפלה בתאים אוקריוטים. זה ישים בכל אורגניזמים המודל הגדולים, כולל יונקים, חרקים (דרוזופילה), דו חיים (Xenopus), ושמרים 5,15,16. זה תואם באופן ישיר עם microarray ניתוח 5,17, RNA-9,13,14 ואילך, והוא ישים in vivo 12,15. הנה, אנחנו פירוט המתודולוגיה לתייג, לבודד, ולטהר את RNA החדש שעבד בתאי יונקים בתרבית. בנוסף, potentiבעיות ואת החסרונות al הם דנו.
Protocol
Representative Results
Discussion
תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד באופן משמעותי מגביר את העצמה של טכנולוגיות תפוקה גבוהה כמו microarrays וRNA-Seq על ידי מתן תבניות מתאימות יותר להתייחס לשאלה הביולוגית של עניין. הפרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה נרחבת. היא מאפשרת העשרה> 1,000 פי חדש של RNA עיבד ומספקת תוצאות לשח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאיימי רגן לקריאה מדוקדקת של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NGFN פלוס # 01GS0801, MRC מלגת מענק G1002523 וNHSBT מענק WP11-05 לLD וDFG מענק FR2938/1-1 לCCF
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-thiouridine | Carbosynth | T4509 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze. |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) | WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C. |
| Chloroform | Sigma | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Isopropanol | Sigma | 650447 | |
| Sodium citrate, nuclease-free | Sigma | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water. |
| 5M nuclease-free NaCl | Sigma | 71386 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma | W4502 | Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes. |
| RNA precipitation buffer | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | ||
| Ethanol | Sigma | 459844 | Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C. |
| 1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| 500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| 10x Biotinylation Buffer (BB) | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml. | ||
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 | |
| EZ-Link biotin-HPDP | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. |
| Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml | Eppendorf | 0032 005.152 | Optional for the chloroform extraction step. |
| Zeta membrane | BIORAD | 162-0153 | |
| 10x Dot blot binding buffer | 100 mM NaOH, 10 mM EDTA | ||
| Biotin-oligo | 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence | ||
| Sodium dodecyl sulphate | Fisher | BPE9738 | For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate. |
| EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation. |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 10010-015 | |
| Dot blot blocking buffer | Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM. | ||
| Streptavidin-horseradish peroxidase | Vector Laboratories | SA5004 | Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use. |
| ECL reagent | GE Healthcare | RNP2109 | Use following the manufacturer’s instructions. |
| Super RX, X-RA Film, 18×24 cm | Fujifilm | 47410 19236 | |
| μMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store the beads at 4 °C. |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Washing buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O. | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use. |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature. |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.692.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.694.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified. | |||
| Equipment | |||
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | VWR International | 525-0153 | In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| High-speed rotor | Beckman Coulter | JLA-16250 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Adaptors for 15 ml tubes | Laborgeräte Beranek | 356964 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer compact | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 μMacs columns. |
| Waterbath | Grant | SUB Aqua 5 | Or equivalent. |
| Ultra-fine scale | A&D | GR-202 | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
References
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
- Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
- Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
- Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
- Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
- Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
- Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
- Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
- Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).
- Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).
- Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
- Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
- Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
- Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO – A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).
