Totalt cellulärt RNA ger en dålig mall för att studera kortsiktiga förändringar i RNA-syntes och förfall samt kinetiken för RNA-bearbetning. Här beskriver vi metabolisk märkning av nyligen transkriberat RNA med 4-tiouridin följt av tiol-specifik biotinylering och rening av nyligen transkriberat RNA gör det möjligt att övervinna dessa begränsningar.
Utvecklingen av hela transkriptom mikromatriser och nästa generations sekvensering har revolutionerat vår förståelse av komplexiteten av cellens genuttryck. Tillsammans med en bättre förståelse av de inblandade molekylära mekanismer, har exakta mätningar av de underliggande kinetik blivit allt viktigare. Här, dessa kraftfulla metoder inför stora begränsningar på grund av inneboende egenskaper mall prover de ska studera, dvs totala cellulära RNA. I många fall förändringar i totalt cellulärt RNA ske antingen för långsamt eller för snabbt för att representera de underliggande molekylära händelser och deras kinetik med tillräcklig upplösning. Dessutom är bidraget av förändringar i RNA-syntes, bearbetning, och förfall ej lätt differentierade.
Vi utvecklade nyligen högupplösta profilering av genuttryck för att övervinna dessa begränsningar. Vår strategi bygger på metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA med 4-thiouridine (således även kallad 4SU-taggning) följt av rigorös rening av nyligen transkriberade RNA med användning av tiol-specifik biotinylering och streptavidin-belagda magnetiska pärlor. Det är tillämpligt på ett brett spektrum av organismer, inklusive ryggradsdjur, Drosophila och jäst. Vi tillämpade framgångsrikt 4SU-taggning för att studera i realtid kinetik aktiviteter transkriptionsfaktor, ge exakta mätningar av RNA halveringstider, och få nya insikter i kinetik RNA bearbetning. Slutligen kan datormodellering användas för att generera ett integrerat, heltäckande analys av de bakomliggande molekylära mekanismerna.
Gene expression profiling är ett viktigt verktyg som används för att studera cellulära processer och tillhörande komplexa samspelet nätverk. Studier av mRNA överflöd har normalt varit en lämplig metod för att få grundläggande insikter i de bakomliggande molekylära mekanismerna. Utvecklingen av hela transkriptom mikromatriser 1 och, mer nyligen, nästa generations sekvensering av RNA (RNA-seq) 2-4 underblåst detta tillvägagångssätt. Även om dessa tekniker har revolutionerat vår förståelse av komplexiteten av cellens genuttryck, möter de stora begränsningar på grund av inneboende egenskaper deras mall prov, dvs totalt cellulärt RNA. Först kortsiktiga förändringar i den totala RNA-nivåer motsvarar inte förändringar i transkription priser, men är i sig beroende av RNA halveringstiden av respektive transkript. Medan en femfaldig induktion av en kortlivad transkriptet, t.ex. kodning för en transkriptionsfaktor, kommer att vara lätt detekterbara i totalt RNAinom en timme, samma induktion av en långlivad transkriptet, t.ex. kodning för ett metaboliskt enzym, kommer att förbli praktiskt taget osynlig. Dessutom, till och med en fullständig avstängning (> 1000-faldig ned-reglering) i transkriptionen satsen för en genomsnittlig genen med ett RNA-halveringstid på fem timmar kommer helt enkelt ta fem timmar för alla de RNA-nivåer för att minska med endast tvåfaldig . Därför gynnar analys av total RNA påvisande av uppreglering av kortlivade transkript, varav många kodar för transkriptionsfaktorer och gener med reglerande funktioner 5. Dessutom är den sanna kinetiska kaskad reglering fördunklas och primära signalering händelser kan inte skiljas från sekundärt. Både i sin tur kan resultera i betydande bias i nedströms bioinformatik analyser. Det andra, kan förändringar i totala RNA-nivåer inte kan hänföras till förändringar i RNA-syntes eller nedbrytning. Mätningar av de sistnämnda kräver cellen invasiva metoder, t.ex. blockerar transcriptipå att använda actinomycin D 6, och utökad övervakning av pågående RNA förfall över tid. Med en genomsnittlig mRNA halveringstid i däggdjursceller av 5 – 10 HR 5,7, kommer mRNA-nivåer av de flesta gener har bara minskat med mindre än dubbelt efter flera timmar av transkriptionell gripandet. Dessa ganska små skillnader leda till grovt oprecisa mätningar av mRNA-halveringstider för de flesta cellulära gener på grund av den exponentiella karaktären hos de underliggande matematiska ekvationer. Slutligen, medan RNA-seq av totalt cellulärt RNA visade att ungefär hälften av våra gener är föremål för alternativa splitsar händelser 8, underliggande kinetik samt dynamiska mekanismer som styr vävnads-och kontext-specifik reglering av RNA bearbetning Oklara. Dessutom bidrag RNA bearbetning till differentiell genexpression, i synnerhet för icke-kodande RNA, återstår att fastställa. Sammantaget dessa begränsningar utgör stora hinder förbioinformatic kinetisk modellering av de underliggande molekylära mekanismer.
Vi har nyligen utvecklat en metod, benämnd högupplöst profilering av genuttryck för att övervinna dessa problem 5,7,9. Den är baserad på metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA med 4-tiouridin (4SU-taggning), ett naturligt förekommande uridine derivat, och ger direkt tillgång till nyligen transkriberade utskrifter med minimal inblandning i celltillväxt och genuttryck (se figur 1) 5, 10-12. Exponering av eukaryota celler till 4SU resulterar i dess snabba upptag, fosforylering till 4SU-trifosfat, och inkorporering i nyligen transkriberade RNA. Efter isolering av totalt cellulärt RNA, är det 4SU-märkt RNA-fraktion tiol-specifikt biotinyleras generera en disulfidbindning mellan biotin och de nyligen transkriberade RNA. "Totalt cellulärt RNA" kan sedan kvantitativt separeras i märkt ("nyligen transkriberade) och omärkt (" pre-existing ') RNA med hög renhet med streptavidinbelagda magnetiska pärlor. Slutligen är märkt RNA återvinns från kulorna genom att helt enkelt lägga ett reduktionsmedel (t.ex. ditiotreitol) klyva disulfidbindningen och släppa de nyligen transkriberade RNA från kulorna.
Nyligen transkriberas RNA skildrar transkriptionsaktiviteten av varje gen under tidsramen för 4SU exponering. 4SU-taggning i tidsskalan minuter ger således en ögonblicksbild av eukaryot genexpression och en perfekt mall för nedströms bioinformatiska analyser (t.ex. promotor analys). I de fall där steady-state kan förutsättas, förhållandena nyligen transkriberade / totalt, nyligen transkriberas / omärkt och omärkta / totala RNA tillhandahålla icke-invasiv tillgång till exakta RNA halveringstider 7,13. Dessutom är det viktigt att notera att nyproducerade transkriberat RNA renade efter så lite som 5 min av 4SU-taggning (5 min 4SU-RNA) är yngre än 15 och 60 min 4SU-RNA.När du utför både ultrakorta och progressivt längre 4SU-taggning i en enda experimentell inställning kombinerad med RNA-seq är kinetiken av RNA bearbetning avslöjade vid nukleotid upplösning 9. Slutligen, tidsförlopp analyser av nyligen transkriberade och total RNA kombination med datormodellering möjliggöra en integrerad analys av RNA-syntes och förfall 14.
Sammanfattningsvis tillåter detta tillvägagångssätt för direkt analys av dynamiken i RNA-syntes, bearbetning, och nedbrytning i eukaryota celler. Det gäller i alla större modell organismer, inklusive däggdjur, insekter (Drosophila), amfibier (Xenopus), och jäst 5,15,16. Det är direkt kompatibel med microarray analys 5,17, RNA-seq 9,13,14, och är tillämplig i vivo 12,15. Här, vi detalj metoden att märka, isolera och rena nyligen transkriberade RNA i odlade däggdjursceller. Dessutom potentioal problem och fallgropar diskuteras.
Metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA ökar väsentligt kraften av teknik med hög kapacitet som microarrays och RNA-Seq genom att ge mer lämpliga mallar för att hantera den biologiska frågan om ränta. Det nuvarande protokollet genomgick omfattande optimering. Den tillåter> 1000-faldig anrikning av nyligen transkriberade RNA och ger mycket reproducerbara resultat.
Den experimentella designen av en 4SU-taggning försöket är av avgörande betydelse som nyligen transkribe…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Amie Regan för noggrann läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av NGFN Plus bevilja # 01GS0801, MRC gemenskap bidrag G1002523 och NHSBT bidrag WP11-05 till LD och DFG bidrag FR2938/1-1 till CCF
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-thiouridine | Carbosynth | T4509 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze. |
Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) | WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C. |
Chloroform | Sigma | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Isopropanol | Sigma | 650447 | |
Sodium citrate, nuclease-free | Sigma | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water. |
5M nuclease-free NaCl | Sigma | 71386 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma | W4502 | Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes. |
RNA precipitation buffer | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | ||
Ethanol | Sigma | 459844 | Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C. |
1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 | Lonza | 51237 | Stock solution |
500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
10x Biotinylation Buffer (BB) | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml. | ||
Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 | |
EZ-Link biotin-HPDP | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. |
Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml | Eppendorf | 0032 005.152 | Optional for the chloroform extraction step. |
Zeta membrane | BIORAD | 162-0153 | |
10x Dot blot binding buffer | 100 mM NaOH, 10 mM EDTA | ||
Biotin-oligo | 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence | ||
Sodium dodecyl sulphate | Fisher | BPE9738 | For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate. |
EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation. |
Phosphate buffer saline | Gibco | 10010-015 | |
Dot blot blocking buffer | Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM. | ||
Streptavidin-horseradish peroxidase | Vector Laboratories | SA5004 | Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use. |
ECL reagent | GE Healthcare | RNP2109 | Use following the manufacturer’s instructions. |
Super RX, X-RA Film, 18×24 cm | Fujifilm | 47410 19236 | |
μMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store the beads at 4 °C. |
Tween 20 | Sigma | P1379 | |
Washing buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O. | ||
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use. |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature. |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.692.005 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.694.005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified. | |||
Equipment | |||
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | VWR International | 525-0153 | In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g |
High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
High-speed rotor | Beckman Coulter | JLA-16250 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
Adaptors for 15 ml tubes | Laborgeräte Beranek | 356964 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer compact | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 μMacs columns. |
Waterbath | Grant | SUB Aqua 5 | Or equivalent. |
Ultra-fine scale | A&D | GR-202 | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |