Summary

Metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA för högupplöst profilering av genuttryck för RNA syntes, bearbetning och förfall i cellkultur

Published: August 08, 2013
doi:

Summary

Totalt cellulärt RNA ger en dålig mall för att studera kortsiktiga förändringar i RNA-syntes och förfall samt kinetiken för RNA-bearbetning. Här beskriver vi metabolisk märkning av nyligen transkriberat RNA med 4-tiouridin följt av tiol-specifik biotinylering och rening av nyligen transkriberat RNA gör det möjligt att övervinna dessa begränsningar.

Abstract

Utvecklingen av hela transkriptom mikromatriser och nästa generations sekvensering har revolutionerat vår förståelse av komplexiteten av cellens genuttryck. Tillsammans med en bättre förståelse av de inblandade molekylära mekanismer, har exakta mätningar av de underliggande kinetik blivit allt viktigare. Här, dessa kraftfulla metoder inför stora begränsningar på grund av inneboende egenskaper mall prover de ska studera, dvs totala cellulära RNA. I många fall förändringar i totalt cellulärt RNA ske antingen för långsamt eller för snabbt för att representera de underliggande molekylära händelser och deras kinetik med tillräcklig upplösning. Dessutom är bidraget av förändringar i RNA-syntes, bearbetning, och förfall ej lätt differentierade.

Vi utvecklade nyligen högupplösta profilering av genuttryck för att övervinna dessa begränsningar. Vår strategi bygger på metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA med 4-thiouridine (således även kallad 4SU-taggning) följt av rigorös rening av nyligen transkriberade RNA med användning av tiol-specifik biotinylering och streptavidin-belagda magnetiska pärlor. Det är tillämpligt på ett brett spektrum av organismer, inklusive ryggradsdjur, Drosophila och jäst. Vi tillämpade framgångsrikt 4SU-taggning för att studera i realtid kinetik aktiviteter transkriptionsfaktor, ge exakta mätningar av RNA halveringstider, och få nya insikter i kinetik RNA bearbetning. Slutligen kan datormodellering användas för att generera ett integrerat, heltäckande analys av de bakomliggande molekylära mekanismerna.

Introduction

Gene expression profiling är ett viktigt verktyg som används för att studera cellulära processer och tillhörande komplexa samspelet nätverk. Studier av mRNA överflöd har normalt varit en lämplig metod för att få grundläggande insikter i de bakomliggande molekylära mekanismerna. Utvecklingen av hela transkriptom mikromatriser 1 och, mer nyligen, nästa generations sekvensering av RNA (RNA-seq) 2-4 underblåst detta tillvägagångssätt. Även om dessa tekniker har revolutionerat vår förståelse av komplexiteten av cellens genuttryck, möter de stora begränsningar på grund av inneboende egenskaper deras mall prov, dvs totalt cellulärt RNA. Först kortsiktiga förändringar i den totala RNA-nivåer motsvarar inte förändringar i transkription priser, men är i sig beroende av RNA halveringstiden av respektive transkript. Medan en femfaldig induktion av en kortlivad transkriptet, t.ex. kodning för en transkriptionsfaktor, kommer att vara lätt detekterbara i totalt RNAinom en timme, samma induktion av en långlivad transkriptet, t.ex. kodning för ett metaboliskt enzym, kommer att förbli praktiskt taget osynlig. Dessutom, till och med en fullständig avstängning (> 1000-faldig ned-reglering) i transkriptionen satsen för en genomsnittlig genen med ett RNA-halveringstid på fem timmar kommer helt enkelt ta fem timmar för alla de RNA-nivåer för att minska med endast tvåfaldig . Därför gynnar analys av total RNA påvisande av uppreglering av kortlivade transkript, varav många kodar för transkriptionsfaktorer och gener med reglerande funktioner 5. Dessutom är den sanna kinetiska kaskad reglering fördunklas och primära signalering händelser kan inte skiljas från sekundärt. Både i sin tur kan resultera i betydande bias i nedströms bioinformatik analyser. Det andra, kan förändringar i totala RNA-nivåer inte kan hänföras till förändringar i RNA-syntes eller nedbrytning. Mätningar av de sistnämnda kräver cellen invasiva metoder, t.ex. blockerar transcriptipå att använda actinomycin D 6, och utökad övervakning av pågående RNA förfall över tid. Med en genomsnittlig mRNA halveringstid i däggdjursceller av 5 – 10 HR 5,7, kommer mRNA-nivåer av de flesta gener har bara minskat med mindre än dubbelt efter flera timmar av transkriptionell gripandet. Dessa ganska små skillnader leda till grovt oprecisa mätningar av mRNA-halveringstider för de flesta cellulära gener på grund av den exponentiella karaktären hos de underliggande matematiska ekvationer. Slutligen, medan RNA-seq av totalt cellulärt RNA visade att ungefär hälften av våra gener är föremål för alternativa splitsar händelser 8, underliggande kinetik samt dynamiska mekanismer som styr vävnads-och kontext-specifik reglering av RNA bearbetning Oklara. Dessutom bidrag RNA bearbetning till differentiell genexpression, i synnerhet för icke-kodande RNA, återstår att fastställa. Sammantaget dessa begränsningar utgör stora hinder förbioinformatic kinetisk modellering av de underliggande molekylära mekanismer.

Vi har nyligen utvecklat en metod, benämnd högupplöst profilering av genuttryck för att övervinna dessa problem 5,7,9. Den är baserad på metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA med 4-tiouridin (4SU-taggning), ett naturligt förekommande uridine derivat, och ger direkt tillgång till nyligen transkriberade utskrifter med minimal inblandning i celltillväxt och genuttryck (se figur 1) 5, 10-12. Exponering av eukaryota celler till 4SU resulterar i dess snabba upptag, fosforylering till 4SU-trifosfat, och inkorporering i nyligen transkriberade RNA. Efter isolering av totalt cellulärt RNA, är det 4SU-märkt RNA-fraktion tiol-specifikt biotinyleras generera en disulfidbindning mellan biotin och de nyligen transkriberade RNA. "Totalt cellulärt RNA" kan sedan kvantitativt separeras i märkt ("nyligen transkriberade) och omärkt (" pre-existing ') RNA med hög renhet med streptavidinbelagda magnetiska pärlor. Slutligen är märkt RNA återvinns från kulorna genom att helt enkelt lägga ett reduktionsmedel (t.ex. ditiotreitol) klyva disulfidbindningen och släppa de nyligen transkriberade RNA från kulorna.

Nyligen transkriberas RNA skildrar transkriptionsaktiviteten av varje gen under tidsramen för 4SU exponering. 4SU-taggning i tidsskalan minuter ger således en ögonblicksbild av eukaryot genexpression och en perfekt mall för nedströms bioinformatiska analyser (t.ex. promotor analys). I de fall där steady-state kan förutsättas, förhållandena nyligen transkriberade / totalt, nyligen transkriberas / omärkt och omärkta / totala RNA tillhandahålla icke-invasiv tillgång till exakta RNA halveringstider 7,13. Dessutom är det viktigt att notera att nyproducerade transkriberat RNA renade efter så lite som 5 min av 4SU-taggning (5 min 4SU-RNA) är yngre än 15 och 60 min 4SU-RNA.När du utför både ultrakorta och progressivt längre 4SU-taggning i en enda experimentell inställning kombinerad med RNA-seq är kinetiken av RNA bearbetning avslöjade vid nukleotid upplösning 9. Slutligen, tidsförlopp analyser av nyligen transkriberade och total RNA kombination med datormodellering möjliggöra en integrerad analys av RNA-syntes och förfall 14.

Sammanfattningsvis tillåter detta tillvägagångssätt för direkt analys av dynamiken i RNA-syntes, bearbetning, och nedbrytning i eukaryota celler. Det gäller i alla större modell organismer, inklusive däggdjur, insekter (Drosophila), amfibier (Xenopus), och jäst 5,15,16. Det är direkt kompatibel med microarray analys 5,17, RNA-seq 9,13,14, och är tillämplig i vivo 12,15. Här, vi detalj metoden att märka, isolera och rena nyligen transkriberade RNA i odlade däggdjursceller. Dessutom potentioal problem och fallgropar diskuteras.

Protocol

Ett. Metabolisk märkning med 4-tiouridin Gör en detaljerad plan för experimentuppställning / schema, t ex när man ska lägga till 4SU till cellodling och då för att skörda proverna. Planera för minst 5 minuter mellan varje skick. Endast behandla celler av ett villkor i taget. Handtag max. 3 – 5 rätter vid en given tidpunkt. Handtag celler så snabbt som möjligt för att minimera förändringar i temperatur och CO 2 nivåer. Undvik att utsätta cellerna för stark…

Representative Results

Ett. Utgångsmaterial och förväntad avkastning Efter 1 timme (h) i 4SU-exponering nyligen transkriberade RNA utgör cirka 1 – 4% av totalt cellulärt RNA. Detta kommer att vara lägre i tillväxtföretag arresterade-celler eftersom de inte längre syntetisera RNA redogöra för celltillväxt / replikation. När märkning för 1 timme, rekommenderar vi börjar analysen med 60-80 mikrogram av det totala RNA. Från och med mindre än 30 mikrogram av det totala RNA resulterar i små RNA pellets s…

Discussion

Metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA ökar väsentligt kraften av teknik med hög kapacitet som microarrays och RNA-Seq genom att ge mer lämpliga mallar för att hantera den biologiska frågan om ränta. Det nuvarande protokollet genomgick omfattande optimering. Den tillåter> 1000-faldig anrikning av nyligen transkriberade RNA och ger mycket reproducerbara resultat.

Den experimentella designen av en 4SU-taggning försöket är av avgörande betydelse som nyligen transkribe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Amie Regan för noggrann läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av NGFN Plus bevilja # 01GS0801, MRC gemenskap bidrag G1002523 och NHSBT bidrag WP11-05 till LD och DFG bidrag FR2938/1-1 till CCF

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-thiouridine Carbosynth T4509 Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze.
Trizol Invitrogen 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C.
Chloroform Sigma 372978 WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Isopropanol Sigma 650447
Sodium citrate, nuclease-free Sigma C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.
5M nuclease-free NaCl Sigma 71386 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma W4502 Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.
RNA precipitation buffer 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Ethanol Sigma 459844 Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C.
1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 Lonza 51237 Stock solution
500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
10x Biotinylation Buffer (BB) 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.
Dimethylformamide (DMF) Sigma D4551
EZ-Link biotin-HPDP Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml Eppendorf 0032 005.152 Optional for the chloroform extraction step.
Zeta membrane BIORAD 162-0153
10x Dot blot binding buffer 100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-oligo 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence
Sodium dodecyl sulphate Fisher BPE9738 For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin Pierce 21333 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.
Phosphate buffer saline Gibco 10010-015
Dot blot blocking buffer Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.
Streptavidin-horseradish peroxidase Vector Laboratories SA5004 Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use.
ECL reagent GE Healthcare RNP2109 Use following the manufacturer’s instructions.
Super RX, X-RA Film, 18×24 cm Fujifilm 47410 19236
μMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store the beads at 4 °C.
Tween 20 Sigma P1379
Washing buffer 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.
Dithiothreitol (DTT) Sigma 43817 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature.
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72.692.005 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72.694.005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.
Equipment
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes VWR International 525-0153 In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
High-speed rotor Beckman Coulter JLA-16250 Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
Adaptors for 15 ml tubes Laborgeräte Beranek 356964 Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer compact Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 μMacs columns.
Waterbath Grant SUB Aqua 5 Or equivalent.
Ultra-fine scale A&D GR-202 Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.

References

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO – A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

Play Video

Cite This Article
Rädle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dölken, L. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. J. Vis. Exp. (78), e50195, doi:10.3791/50195 (2013).

View Video