Summary

Yenidoğan subventricular Bölge Elektroporasyon

Published: February 11, 2013
doi:

Summary

Biz yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon olarak adlandırılan minimal invaziv tekniği göstermek. Tekniği yenidoğan yavruların lateral ventriküllerin içine plazmid DNA enjekte ve sunmak için elektrik akımı uygulayarak oluşur ve genetik nöral kök hücreleri manipüle

Abstract

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) hattı postnatal lateral ventriküllerin ve nöronlar, astrositler ve ependimal hücreleri 1 dahil olduğu birden fazla hücre tipleri yol açmaktadır. Moleküler MGK kendini yenileme, bağlılık sorumlu yollar ve farklılaşma anlama sokmak beyin onarım ve iyi merkezi sinir sistemi bozuklukları anlamak için eşsiz potansiyeli açısından son derece önemlidir. Memeli sistemlerin manipülasyon için Önceki yöntemler tüm hayvan 2 düzeyinde genetik mühendisliğinin zaman alıcı ve pahalı bir çaba gereklidir. Böylece, çalışmaların büyük çoğunluğu in vitro ya da omurgasız NSC moleküllerin fonksiyonlarının inceledik.

Burada, neonatal subventrikuler alanin (SVZ) elektroporasyon olarak ifade edilir neonatal NPC işlemek için basit ve hızlı bir teknik göstermektedir. Benzer teknikler embriyonik NSC'lerde çalışmak için bir on yıl önce geliştirilen ve cortica çalışmalar yardım etmişl geliştirme 3,4. Daha yakın zamanda bu postnatal kemirgen ön beyin 5-7 incelemek için kullanılmıştır. Bu teknik SVZ NSC'lerde ve yavrularının sağlam etiketleme sonuçlar. Böylece, postnatal SVZ elektroporasyon memeli MGK genetik mühendisliği için bir maliyet ve zaman etkin bir alternatif sunuyor.

Protocol

Bu prosedür Yale IACUC gereklerine uygun olduğunu. Bilim adamları IACUC kuralları kendi kurumsal ihtiyaçlarına göre onaylanmış ve takip edildiğinden emin olun. 1. Bölüm 1. DNA, Çözümler ve Cam Pipetler hazırlanması Yüksek saflıkta (OD 260/280> 1.80) yüksek konsantrasyon (mg / ul> 2.5) endotoksin-serbest DNA oluşturun. Bir 22 mikron filtre ile% 0.9 salin solüsyonu ve steril filtre hazırlayın. Sıra 10 cm yangın parlatılmış boros…

Representative Results

Cımbız elektrot "süpürme" hareketi (Şekil 1E) takiben dorsal, dorsal lateral ve lateral subventricular bölgesi ile mücavir neredeyse tüm radyal glia ve etiketleme Yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon sonuçlar. Ancak, elektroporasyon ilgili deney şartı uyarlanmış ancak elektrot süpürme ve video ayrıntılı olarak belirli yerleşimi ve yönlendirme kullanarak değil olabilir. Dorsal lokalize radyal glia bu astar ventrikülün lateral bölümünde farklı yana Örneği…

Discussion

Burada ayrıntılı yenidoğan SVZ elektroporasyon tekniği, hızlı ve güçlü bir etiket ve SVZ kök hücre ve yavrularının işlemek için bir tekniktir. Elektroporasyon için diğer teknikler ile karşılaştırıldığında, sahip olduğu birkaç avantajı vardır. İlk olarak, hücrelerin odak etiketleme göz önüne alındığında, tek hücre ve otonom olmayan hücre otonom etkilerini ayırt edebilir. Indüklenebilir sistemleri kullanarak İkincisi, genetik manipülasyon birini önce veya sinaptik entegrasyon …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Savunma Bakanlığı (Fikir geliştirme ödülü, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Kök hücre hibe (AB) ve Sağlık NRSA 10.668.225 (DMF) Ulusal Enstitüsü bağışları ile desteklenmiştir. Mevcut malzeme kısmen Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler Programı kapsamında Connecticut Eyaleti tarafından desteklenen çalışmaya dayanır. İçeriğinde sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Connecticut, Connecticut veya CT Yeniliklerin Devlet Halk Sağlığı Bölümü Devletin resmi görüşlerini temsil etmemektedir, Inc fon, veri toplama çalışması tasarım herhangi bir rolü vardı ve analiz, yayınlamak kararı veya yazının hazırlanması.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Heavy Polished Borosilicate Tubing Sutter Instrument BF150-110-10
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Square Wave Pulse generator Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-562-36
Tungsten Halogen lamp USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instruments 052-0312-900

References

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).

Play Video

Cite This Article
Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197, doi:10.3791/50197 (2013).

View Video