Mikrofluid-baserede Electrotaxis for On-demand kvantitativ analyse af<em> Caenorhabditis elegans</em> 'Locomotion
Summary
En semi-automatiseret MikroElektroMekaniske strømningsteknisk metode til at inducere on-demand bevægelse i<em> Caenorhabditis elegans</em> Beskrives. Denne metode er baseret på den neurofysiologiske fænomenet orme reagerer på milde elektriske felter ("electrotaxis") inden mikrofluidkanaler. Mikrofluid electrotaxis fungerer som en hurtig, følsom, billig og skalerbar teknik til at screene for faktorer, der påvirker neuronal sundhed.
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans er en alsidig model organisme til biomedicinsk forskning på grund af sin bevarelse af sygdomsrelaterede gener og stier samt dets lethed til dyrkning. Adskillige C. elegans sygdomsmodeller er blevet rapporteret, herunder neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom (PD), hvilket indebærer degeneration af dopaminerge (DA) neuroner 1.. Både transgener og neurotoksiske kemikalier er blevet anvendt til at inducere DA neurodegeneration og deraf bevægelse defekter i orme, der giver mulighed for undersøgelser grundlag af neurodegeneration og skærme til neurobeskyttende gener og forbindelser 2,3.
Skærme i lavere eukaryoter som C. elegans giver en effektiv og økonomisk middel til at identificere forbindelser og gener påvirker neuronal signalering. Konventionelle skærme er typisk udføres manuelt, og scorede ved visuel inspektion, hvorfor de er tid-consuming og tilbøjelige til menneskelige fejl. Derudover fleste fokuserer på celleniveau analyse samtidig ignorerer bevægelse, hvilket er en særlig vigtig parameter for bevægelsesforstyrrelser.
Vi har udviklet en ny mikrofluid screening (figur 1), der styrer og kvantificerer C. elegans 'bevægelse ved hjælp af elektrisk felt stimuli inde microchannels. Vi har vist, at en jævnstrøm (DC) felt robust kan fremkalde on-demand bevægelse mod katoden ("electrotaxis") 4.. Vende feltets polaritet forårsager ormen til hurtigt ændre sin retning. Vi har også vist, at defekter i dopaminerge og andre sensoriske neuroner ændrer svømning respons 5.. Derfor kan abnormaliteter i neuronal signalering bestemmes ved hjælp af bevægelse som en read-out. Bevægelsen respons kan præcist kvantificeres ved hjælp af en række parametre, såsom svømning hastighed, krop bøjning frekvens og tilbageførsel tid.
<p class = "jove_content"> Vores arbejde har afsløret, at den electrotactic respons varierer med alderen. Konkret unge voksne reagere på et lavere udbud af elektriske felter og bevæge sig hurtigere i forhold til larver 4.. Disse fund førte os til at designe en ny mikrofluid enhed til passivt at sortere orme efter alder og fænotype 6..Vi har også testet reaktion orme til pulserende DC og vekselstrøm (AC) elektriske felter. Impuls DC marker med forskellige driftscyklusser effektivt genererede electrotaxis i både C. elegans og dens fætter C. briggsae 7.. I et andet eksperiment, immobiliseret symmetriske AC felter med frekvenser fra 1 Hz til 3 KHz orme inde i kanalen 8.
Gennemførelsen af det elektriske felt i en mikrofluid miljø giver mulighed for hurtig og automatiseret udførelse af electrotaxis analysen. Denne fremgangsmåde lover at lette high-throughput genetiske og kemiske skærme til faktorerpåvirker neuronal funktion og levedygtighed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drage fordel af den adfærdsmæssige fænomen først beskrevet af Gabel og kolleger og bygge på dielektroforetiske manipulation arbejde Chuang og kolleger 11,12, vores microfluidic-baserede electrotaxis assay giver en nem, robust og følsom metode til at undersøge neuronal aktivitet i orme anvender bevægelse som en udgang. Analysen bevægelighed parametre muliggør kvantitativ sammenligning mellem forskellige genotyper. Præcisionen af mikrokanalplade fabrikation og elektrisk felt ansøgning vedlagt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada, Canada Research Stole Program, canadiske Institutes of Health Research, og Ontario Ministeriet for forskning og innovation gennem deres Early Eliteforsker Program for finansiel støtte.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92×16 mm Petri dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hot plate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -. M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -. M. D. i., Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
