Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Published: April 4, 2013 doi: 10.3791/50310
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 1
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

Summary

يوصف أسلوب لتجميع تدرجات لاصقة وقابل للذوبان في غرفة الفحص المجهري لدراسات الهجرة حية الخلية. هندسيا يجمع بين البيئة والسطوح المانعة لاصقة المسارات مع التدرجات الحل وبالتالي يسمح احد لتحديد الأهمية النسبية للمنبهات التوجيه.

Abstract

يمكن الشعور الخلايا وتهاجر نحو تركيزات أعلى من العظة لاصقة مثل البروتينات السكرية من المصفوفة خارج الخلية والعظة للذوبان مثل عوامل النمو. هنا، ونحن الخطوط العريضة لطريقة لإنشاء تدرجات لاصقة معارضة من العظة وقابل للذوبان في غرفة ميكروفلويديك، والذي يتوافق مع الخلية الحية التصوير. ويعمل A كوبوليمر من بولي-L-يسين والبولي ايثيلين جلايكول (PEG-PLL) إيقاف فاعلية coverslips الزجاج ومنع غير محددة امتزاز الجزيئات الحيوية والخلايا. وتستخدم الطباعة microcontact المقبل، أو الطباعة الحجرية تراجع القلم لخلق مسارات streptavidin على السطوح تخميلها لتكون بمثابة نقطة لرسو الببتيد المعقدة البيروكسيديز أرجينين حمض الأسبارتيك، جليكاين (RGD) كما جديلة لاصقة. يتم وضع الجهاز على سطح ميكروفلويديك تعديل واستخدامها لإنشاء الانحدار من العظة لاصقة (100٪ RGD لRGD 0٪) على المسارين streptavidin. وأخيرا، يتم استخدام نفس الجهاز ميكروفلويديك لإنشاء معامل ليمث جاذب كيميائيح ومصل بقري جنيني (FBS)، كما جديلة للذوبان في الاتجاه المعاكس من التدرج من العظة لاصقة.

Introduction

توجه الهجرة الخلية هو خاصية أساسية من العديد من الخلايا وهو أحد الجوانب الرئيسية لكثير من العمليات الفسيولوجية العادية، بما في ذلك التطور الجنيني، والدفاع ضد العدوى والتئام الجروح. وبالإضافة إلى ذلك، والهجرة الخلية كما تلعب دورا بارزا في كثير من الأمراض مثل أمراض الأوعية الدموية، ورم خبيث الخلايا المزمن والتهاب 1،2. في حين أن الولايات الكلاسيكية للهجرة الخلية - الاستقطاب والإرشاد بروز وتشكيل التصاق، وتوليد القوة وتراجع الخلفية - والمقبولة عموما 3،4، كان الكشف عن آليات الزمانية المكانية التي يتم من خلالها تنسيق التكامل إشارة أكثر تحديا.

المصفوفة خارج الخلية (ECM) بمثابة الركيزة للالتصاق الخلية، ومن خلال الكيميائية الكامنة 5 و المادية التنوع 6، يقدم العظة الاتجاه للملاحة الخلية 7،8. وبالإضافة إلى هذه العظة لاصقة 9، العوامل القابلة للذوبان 10-12 </ سوب> مثل كيموكينات وعوامل النمو يمكن أن تحدث الموجهة الهجرة الخلية من خلال مستقبلات الإشارات الخاصة بهم وجاذب كيميائي motogenic المصب. حاليا، من غير المعروف ما إذا كان يشير من خلال المشاركة ومستقبلات الالتصاق (أي integrins) أو مستقبلات جاذب كيميائي، مثل مستقبلات التيروزين كيناز (RTK)، هي المهيمنة. ولا هو يعرف ما إذا كان التسلسل الهرمي للأنظمة هي مستقبلات معينة من الخلايا النوع.

الحية المجهري خلية يعطي ثروة من المعلومات التي لا يمكن الوصول إليها في معظم المقايسات ويمكن دمجها مع أجهزة ميكروفلويديك لتوليد تدرجات من ثبتوا العظة وقابل للذوبان 13،14 15 16. الطريقة الموضحة هنا يستخدم سلسلة من الخطوات البسيطة، وأنشأ لتعديل السطح جنبا إلى جنب مع غرفة لميكروفلويديك المتاحة تجاريا لإنشاء فحص التصوير للهجرة الخلية التي يمكن بسهولة أن تنفذ في مختبر البيولوجيا خلية (الشكل 1). وتجميعهاالجهاز ميكروفلويديك والصفات البصرية التي يمكن مقارنتها على الزجاج (17) والتدرجات من الجزيئات إنتشاري مستقرة للا يقل عن 16 ساعة. ويمكن استخدام هذا النظام لتقنيات المجهر epifluorescence والمتقدمة. على عكس غيرها من الاجهزة الكيميائي 18، هذا النظام هو مناسبة لتسجيل المهاجرة ببطء، والخلايا الملتصقة. الأهم من ذلك أن النظام هو وحدات ويسمح بسهولة إدخال بديلة أو لاصقة قابلة للذوبان العظة الهجرة وفحص أنواع الخلايا المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التخميل من زجاج Coverslips مع PLL-PEG-البيوتين

تم تصميم هذه الخطوة إيقاف فاعلية سطح الخلايا بحيث تلتزم وتهاجر إلى مناطق معينة على ساترة الزجاج التي يتم إنشاؤها مع الطباعة microcontract (الخطوة 2-3A) أو تراجع الطباعة الحجرية القلم (الخطوة 3B). لالتخميل، يتم استخدام البوليمر المشترك للبولي-L-يسين (PLL) والبولي اثيلين جليكول (PEG) حيث يتم تطعيم 20٪ من الجزيئات PEG لالبيوتين (PLL-PEG-البيوتين).

  1. لتنظيف الزجاج coverslips (18 ملم × 18 ملم)، غمر لهم في رفوف في الإيثانول بنسبة 100٪ ووضع رف في الحمام لمدة 30 دقيقة sonicating. تجفيف coverslips الزجاج في الهواء أو تحت تيار من النيتروجين.
  2. المقبل، ويصوتن coverslips الزجاج لمدة 30 دقيقة في هيدروكسيد الصوديوم M 1. بعد ذلك شطف الأسطح الزجاجية بواسطة غمس بعناية رف في كوب مملوء 1.5 L-Q الملة O. 2 H تكرار عملية الشطف باستخدام ثلاث مرات الطازجة الملة-Q H 2 O في كل مرة. تجفيف coverslips الزجاج فيفرن عند 60 ° C.
  3. 1/2 بدلا من الزجاج نظيفة coverslips بشكل فردي في غرفة رطبة، وهو مصنوع من صفيحة مليئة جيدا 24-H 2 جزئيا مع O. بنسبة 15 ميكرولتر من PLL-PEG-البيوتين (1 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني على كل ساترة الزجاج. اتخاذ النصف الآخر من الزجاج coverslips نظيفة المتبقية بعناية وساندويتش الحل PEG. ترك لcoverslips 1 ساعة في غرفة رطبة. حرك بلطف بعيدا coverslips تقع من بعضها البعض دون إلغاء سطح PEG المغلفة وشطف لهم الملة-Q O. 2 H ينبغي أن تنزلق المياه قبالة بسهولة على الجانب PEG المعاملة. إذا لزم الأمر، والهواء الجاف وcoverslips الزجاج على منشفة ورقية مع سطح تعامل تواجه التصاعدي. تخزين coverslips الزجاج داخل مجفف فراغ حتى استخدامها مرة أخرى.

2. تصنيع طوابع للطباعة Microcontact

وصفنا لعمليتين المسارات نمط streptavidin على الزجاج وcoverslips تخميلها. أول واحد، هيئة التصنيع العسكريrocontact الطباعة، يتطلب عادة على درجة الماجستير تصنيع السيليكون الذي يتم تلقي طابع PDMS. في حالتنا، على نمط الطابع PDMS هي 100 ميكرون على نطاق الخطوط التي متباعدة 290 ميكرومتر إلى مركز مركز مع ارتفاع ميزة من 25 ميكرومتر. أدناه، وصفنا لفترة وجيزة كيفية افتعال ماجستير السيليكون مناسبة (2،1-2،3 الخطوة) وختم PDMS (الخطوة 2.4). ومع ذلك، هناك بروتوكولات متعددة للطباعة microcontact وصفها في المؤلفات 19-23، والتي هي مناسبة لطباعة أنماط البروتين على coverslips الزجاج. ويمكن أيضا أن يتم الماجستير المخصصة والتي تم شراؤها من مصادر تجارية.

  1. أولا، قم بتنظيف رقاقة السيليكون (4 "في قطر) من خلال احتضان في حل البيرانا (3:1 الخامس: الخامس من حامض الكبريتيك و 30٪ بيروكسيد الهيدروجين). لمدة 20 دقيقة يشطف جيدا الرقاقة 10 مرات مع 2 MilliQ O. H تجفيف رقاقة في الفرن على 150 درجة CO / N.
  2. شطف رقاقة السيليكون نظيفة وجافة مع الأسيتون 100٪، تليها ايزوبروبيل 100٪. التاليتدور معطف 2 مل من GM1070 SU-8 مقاومة للضوء (Gersteltec SARL) على الرقاقة على 3،100 دورة في الدقيقة لمدة 40 ثانية لخلق طبقة سميكة ميكرومتر 25. تخبز ثم العينة على لوحة الساخن في C ° 65 لل5 دقائق تليها 5 دقائق أخرى في 95 ° C.
  3. كشف SU-8 مقاومة للضوء للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية تحت ألواح photomask مع نمط المطلوب (على سبيل المثال باستخدام قناع اليجنر Quintel Q6000) وتكرار هذه العملية الخبز في وصف 2.2. ثم يتم وضع العينة عن طريق غمر الرقاقة في 8-SU المطور (Gersteltec SARL) لمدة 4 دقائق، تشطف في ايزوبروبيل 100٪ ويجفف تحت تدفق النيتروجين. وبالتالي تتم إزالة منطقة مقاومة للضوء SU-8 التي لم تتعرض للأشعة فوق البنفسجية، وخلق نمط معكوس الطابع PDMS.
  4. والخطوة التالية هي أن يلقي طابع PDMS من سيد السيليكون. الأول، مزيج دقيق 1 الجزء (وزن / وزن) وكيل علاج مع 10 أجزاء من المطاط الصناعي سابق البلمرة (Sylgard 184). لإزالة أي فقاعات الهواء، ديغا الخليط داخل مجفف تعلق على خط الفراغل1 ساعة. المقبل، صب المطاط الصناعي PDMS على سيد السيليكون داخل طبق بتري إلى 1 سم في الطول وعن علاج الخليط الماجستير وPDMS في فرن في 70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. وأخيرا، تتم إزالة الطابع PDMS من سيد السيليكون وخفض لحجم.

3. Streptavidin الزخرفة أو الإشارات لاصق على الزجاج Coverslips تخميلها

بعد تخميل coverslips الزجاج ويتم طباعة أنماط البروتين مع الطباعة microcontact (3A الخطوة) أو تراجع من ركلة جزاء الطباعة الحجرية (الخطوة 3B). في حالتنا، يتم طباعة streptavidin كخطوط، والتي تشكل الأساس لالتدرجات RGD (الخطوة 4). ويمكن أيضا نفس الإجراء يمكن استخدامها لطباعة مصفوفة البروتينات لخلق أنماط لاصقة.

طريقة بديلة لطباعة microcontact للتنميط من الجزيئات الحيوية على السطوح هو تراجع الطباعة الحجرية القلم. في مجمع دبي للاستثمار الطباعة الحجرية القلم، يتم استخدام ناتئ لنقل وحدة تخزين صغيرة من الحل على السطح. حجم الكابولي، والخامسiscosity من الحل، اتصل مرة من على سطح ناتئ، hydrophobicity من السطح والرطوبة في غرفة الطباعة تحديد حجم ملامح المطبوعة. وميزة هذا الأسلوب هو أن يمكن طباعة أنماط مختلفة لكل تجربة، وليس هناك حاجة الى افتعال الماجستير والطوابع. والعيب هو ان الامر يستغرق وقتا أطول لطباعة نمط معين والتي تراجع الطباعة الحجرية أداة القلم يتطلب المتخصصة التي قد لا تكون متاحة في العديد من المختبرات. كان القلم أداة الطباعة الحجرية مجمع دبي للاستثمار التي استخدمناها في NanoeNabler من علم النانو BioForce العلوم. هنا، نحن المطبوعة النقاط الصغيرة التي كانت <10 ميكرومتر في القطر، التي كنا SPT10 الكابولي.

3A. Microcontact الطباعة (μCP) وتقنيات

  1. لتنظيف وجعل الطابع PDMS أكثر ماء، وعلاج الجانب نمط من الطوابع PDMS في الأشعة فوق البنفسجية والأوزون (على سبيل المثال، الأشعة فوق البنفسجية الأوزون Procleaner من علم النانو BioForce العلوم) مقابل 1.5 ساعة. بدلا من ذلك، استخدام البلازماأنظف لوقت أقصر لنفس الغرض. هذه العملية يخلق أكسدة سطح PDMS 24، مما يحسن من عملية الطباعة.
  2. مباشرة بعد نشر العلاج بالأوزون أو البلازما، مكان و 10 ميكرولتر streptavidin (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) على الطوابع PDMS ويترك لمدة 1 ساعة في غرفة الرطبة (مثل لوحة 6 جيدا ملء جزئيا، انظر الخطوة 1.3) . إذا المسارات يجب أن تكون مرئية تحت المجهر الفلورسنت، واستخدام streptavidin هذا هو مترافق إلى fluorophore مثل streptavidin-AlexaFluor350.
  3. إزالة streptavidin الزائدة من الطابع مع المناديل الورقية والهواء الجاف الطابع لحوالي 1 دقيقة. اضغط برفق على الطابع ساترة الزجاج وPLL-PEG-البيوتين المغلفة.
  4. إذا تم استخدام الفلورسنت streptavidin في 3.a2 الخطوة، ودراسة نمط استخدام تحت ميكروسكوب epifluorescence. تخزين الأسطح المطبوعة داخل مجفف.

3B. تراجع القلم الطباعة الحجرية

  1. الأول، مزيج 1 جزء من 1 ملغ / مل أو streptavidin streptavidin-AlexaFluor350 مع 10 أجزاء من الجلسرين (V / V) وتحميل 5 ميكرولتر من الخليط على ناتئ. ثم تبدأ عملية الطباعة كما هو موضح في دليل تشغيل الطباعة الحجرية أداة القلم مجمع دبي للاستثمار. للحد من حجم البقعة إلى ما يقرب من 5 ميكرون، وضبط سرعة الطباعة، اتصل وقت ناتئ على مسافة السطح أو العمودي للناتئ إلى السطح. في المثال المبين في الشكل 2C، وطبعت في النقاط مع خط الصف والفصل العمود تعيين إلى 10-15 ميكرومتر. هذه المسافة كافية لمنع النقاط من الاندماج في بعضها البعض ولكن يسمح للمشاهدة من النقاط المتعددة في حقل واحد من الإعدادات الأكثر مشاهدة مع المجهر.
  2. تخزين الأسطح المطبوعة داخل مجفف.

4. إنشاء تدرجات لاصق على Streptavidin من الطراز السطوح

نخلق تدرجات لاصقة من البيوتين-RGD على coverslips الزجاج التي يتم بها طلاء مع streptavidin (الشكل 3) أو المشتركntain أنماط streptavidin على coverslips الزجاج تخميلها (الشكل 5). لإنشاء الانحدار السطح، استخدمنا جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا (وتسمى زجة-3D من الشرائح الانجذاب الكيميائي Ibidi) أن يخلق التدرج حل مستقر عن طريق الانتشار السلبي. للتنافس على مواقع الربط streptavidin، لدينا اثنين من العاملين التدرجات معارضة من البيوتين، والبيوتين RGD لم يكن مترافق لRGD (انظر الشكل 1).

  1. الالتزام الزجاج منقوشة أو streptavidin المغلفة-coverslips على الجانب زجة من الجهاز الانجذاب الكيميائي لزجة-3D الشرائح. لضمان عدم وجود تسرب لعدة ساعات، وختم حواف الجهاز مع طبقة رقيقة من الفازلين وتحسنت مع طبقة ثانية من خليط من 1 جزء من الفازلين إلى 1 جزء من شمع البارافين (وزن / وزن).
  2. ملء القناة للجهاز مع 6 ميكرولتر PBS في القناة. ثم ملء خزانين مع 70 ميكرولتر من 0.03 ميكروغرام / ميكرولتر البيوتين-فلوريسئين-4 في برنامج تلفزيوني و 70 و مش؛ لتر من 0.03 ميكروغرام / ميكرولتر البيوتين-RGD في برنامج تلفزيوني، على التوالي. احتضان العينات في RT في الظلام لمدة 1 ساعة.
  3. إزالة حلول البيوتين وشطف بعناية السطح بينما لا تزال تعلق على الجهاز ميكروفلويديك مرتين مع برنامج تلفزيوني. بمناسبة اتجاه الانحدار لاصقة وإذا لزم الأمر، حافظ على بقاء الجهاز مليئة PBS في C ° 4 لولكن تأكد من أن الجهاز لا تجف. إذا لزم الأمر، وتحليل الانحدار لاصقة مع المجهر الفلورسنت.

5. وسمها مع خلايا Fluorophores لايف التصوير الخليوي

وصفت الخلايا مع الأصباغ الفلورية التي تساعد الخلية تتبع تحت المجهر الفلورسنت. تحقيقات شيوعا هي علامات الفلورسنت عضية، مثل Syto 64 الأحمر، التي تصف نواة الخلية. للقيام بذلك، يتم غسلها 1 الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم حضنت مع الأحمر 64 1 ميكرومتر Syto في وسائل الإعلام والثقافة لمدة 45 دقيقة وأخيرا غسلت أخرى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. يرجى ملاحظة أن الخلايا لا ينبغي أن يكونيوضع في PBS لفترات طويلة من الزمن.

الأصباغ البديلة لتتبع الخلايا التي هي سلسلة CellTracker وصمة عار السيتوبلازم ويتم الاحتفاظ أثناء الهجرة الخلية والانقسام. ترنسفكأيشن من الخلايا مع البروتين الانصهار الفلورسنت مفيد جدا لتسجيل توزيعات التحت خلوية من البروتين من الفائدة خلال الهجرة. ومع ذلك، عادة البروتينات الفلورية الصور التبييض أسرع من الأصباغ العضوية بحيث قد الملاحظات على المدى الطويل لن يكون ممكنا.

6. التحميل من الخلايا القابلة للذوبان مع التدرج في الجهاز على microfluidics

  1. عد الخلايا fluorescently وصفت وتنقسم الى اثنين من أنابيب أعداد الخلايا متساوية. غسل و resuspend أنبوب واحد من الخلايا التي تحتوي على وسائل الإعلام مع جاذب كيميائي، مثل النسر انخفاض الجلوكوز في Dulbecco متوسطة التعديل (DMEM) مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS). غسل و resuspend الأنبوب أخرى من الخلايا في وسائل الإعلام دون جاذب كيميائي، أي DMEM FBS مع 0٪. تركيز النهائيوينبغي من الخلايا في كل أنبوب تكون 5 × 10 5 خلية / مل.
  2. إزالة كافة الحلول من الجهاز ميكروفلويديك (من الخطوة 4.3) ووضعه على المسرح المجهر (انظر الخطوة 7). تحميل 70 ميكرولتر من الخلايا (5 × 10 5 خلية / مل في DMEM FBS 0٪) إلى واحدة و 70 خزان ميكرولتر من خلايا هيلا (5 × 10 5 خلية / مل في DMEM FBS 10٪) إلى آخر. وضع شريط فضفاضة على الخزانات لتجنب التبخر. إذا الخلايا على السطح قبل المحتضنة قبل التصوير، فإنه من المستحسن أن يتم تحميل خلايا في الجهاز في وسائل الإعلام دون نمو التدرج. ثم يتم وضع الجهاز على المسرح المجهر واستبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام أي التدرج DMEM FBS في واحدة من دون خزان وDMEM FBS مع 10٪ في المجموعة الأخرى.

7. يعيش خلية التصوير وتحليل البيانات

  1. تشغيل المجهر (نيكون تي E) والاحماء المرحلة على الأقل 1 ساعة قبل بدء التجربة.
  2. تأكد من أن قناة للميكرالجهاز هو ofluidic في مجال الرؤية والخلايا هي في التركيز. حدد الصورة المعلمة اقتناء مثل التعرض مرات والمرشحات الفلورسنت، وتسلسل الصور من الميدان مشرق ومضان الذي يلتقط الخلايا والمسارات وكذلك نقاط الوقت وطول تسجيل (مثل كل 15 دقيقة لمدة 16 ساعة).
  3. تحليل البيانات مع برامج مناسبة مثل يماغيج دليل تتبع الانجذاب الكيميائي أو Ibidi وأداة الترحيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لفهم كيفية دمج الخلايا إشارات المهاجرة 25، وقد وضعنا طريقة لخلايا صورة مع المجهري مضان التي تهاجر في بيئة تتنافس مع تدرجات لاصقة وقابل للذوبان (الشكل 1). تم إنشاء المسارات التي تحتوي على لاصق streptavidin الفلورسنت وRGD المعقدة البيروكسيديز مع المسارات microcontact المطبوعة وتراجع الطباعة الحجرية القلم (الشكل 2). يشار ناجحة الطباعة microcontact من خط صورة للكثافة مضان عبر المسارات حيث المسارات والمناطق لاصقة مانعة للقاذورات يمكن تمييزها بوضوح (الشكل 2B). النقاط المطبوعة مع تراجع القلم الطباعة الحجرية تظهر مدورة، لا المسيل للدموع على شكل، مما يدل على نجاح عملية الطباعة. الكيمياء السطحية والرطوبة يؤثر على نتائج عملية الطباعة. بشكل عام، كلما كان سطح مسعور، كان ذلك أفضل نتائج الطباعة.

A التدرج من العظة لاصقةعلى المسار المطبوعة تم إنشاؤها بواسطة جهاز بسيط على microfluidics عن طريق تحميل البيوتين-4-فلوريسئين والبيوتين، RGD في الجانب الآخر من غرفة ميكروفلويديك (الشكل 3). لأن كلا جزيئات ربط تنافسية إلى المسار streptavidin على سطح الزجاج، ويتم إنشاء التدرج يجمد من يغاندس RGD. بعد إزالة الحل البيوتين / البيوتين-RGD، يمكن استخدام نفس الغرفة لتقديم الانحدار القابلة للذوبان، وهي مستقرة داخل القناة ميكروفلويديك مدة لا تقل عن 16 ساعة (الشكل 4).

قدمنا ​​خلايا هيلا في غرفة مع التدرج جاذب كيميائي، والتي كانت تستخدم FBS. في كثافة منخفضة، خلايا هيلا انضمت إلى تفضيلي وهاجر على المسارين streptavidin / RGD (خلايا N = 50) وتجنب المناطق PEG المانعة للقاذورات (خلايا N = 19). تم تسجيل موقف من الخلايا الفردية أكثر من 16 ساعة وتحليلها مع خلية تتبع البرامج. في تجربة لاصقة وسولو حيثأظهرت مسارات الخلايا الفردية ويعارض التدرجات بلي لبعضها البعض (الشكل 5)، أن أكثر خلايا هيلا هاجر نحو مصدر (آثار الحمراء في الشكل 5C، N = آثار 36) جاذب كيميائي من نحو تركيزات أعلى من RGD ملتصقة (الأسود آثار في الشكل 5C، N = آثار 14). متوسط ​​المسافة التي هاجرت الخلايا ضد (آثار سوداء) أو في الاتجاه (آثار أحمر) من الانحدار FBS (X-مكون من التشرد المتوسط ​​لكل مسار) كان 0،1700 0،1172 ± ± 0.1280 0.2278 و، على التوالي (P <0.0001، طالبة اختبار t) رغم عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط ​​التشرد بين آثار الأسود (56.18 ± 32.27 ميكرون) وآثار الأحمر (72.86 ± 45.05 ميكرومتر؛ P> 0.05، طالبة اختبار t). ترحيل خلايا هيلا بمتوسط ​​سرعة بلغ 17،47 ± 4،72 من ميكرون / ساعة في وجود كل من الانحدار لاصقةجديلة (أي RGD) وقابل للذوبان جديلة (أي FBS). وتشير البيانات إلى أن ذلك لخلايا هيلا، التدرج FBS يحدد اتجاه الهجرة في حين أن خلايا الحفاظ على سرعة الهجرة الذاتية على المسارين لاصقة.

لقد قمنا بتقييم أيضا الهجرة من خط الخلية البلاعم J774. في حالة عدم وجود تدرجات لاصقة وقابل للذوبان، وهذه الخلايا تهاجر بسرعة أعلى من ذلك بكثير (38.55 ± 17.88 ميكرون / ساعة) من خلايا هيلا (16.47 ± 4.28 ميكرومتر / ساعة) ولكن مع أقل الثبات أي تغير اتجاهها J774 الخلايا (اتجاهية 0،059 0،091 ± )، التي تقاس على أنها نسبة النزوح لتتبع كثير من الأحيان طول خلايا هيلا (0.57 ± 0.12) على المسارات microcontact فبرونيكتين المطبوعة. J774 الخلايا هي أيضا أقل اعتمادا من الاتصال خلايا هيلا. كان تهجير J774 الخلايا أعلى على مناطق PEG (102.20 ± 54.73 ميكرون) من على المسارات فبرونيكتين (42.95 ± 39.90 ميكرون). وبالإضافة إلى ذلك، J774 خلاياppeared على التكيف مع كيمياء السطوح المختلفة عن طريق تغيير آلية على الهجرة من الوسيطة لamoeboid. في الختام، العظة لاصقة ليست مهمة فيما يتعلق J774 الخلايا كما هي للخلايا هيلا. كل أنواع الخلايا هاجر نحو تفضيلي اتجاه جديلة القابلة للذوبان.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي لعملية تلفيق إعداد ميكروفلويديك التي تسمح للتصوير من الخلايا المهاجرة الرد على التدرجات عكس الاشارات لاصقة مقابل القابلة للذوبان. أ. وتخميلها coverslips الزجاج مع PLL-PEG المعقدة البيروكسيديز. ب. يتم طباعة لاصق يحتوي على أنماط streptavidin الفلورسنت على والمعقدة البيروكسيديز سطح إما باستخدام خطوط الطباعة microcontact (ب) أو نقاط الانخفاض استخدام القلم الطباعة الحجرية (ب). ج. د. والانحدار جاذب كيميائي قابل للذوبان من 0-10٪ يتم تحميل FBS في الجهاز ميكروفلويديك. بعد الانضمام إلى خلايا السطح، ويعيش أكثر من التدرجات الهجرة الخلية RGD على المسارات وstreptavidin في وجود تدرجات FBS ولا يمكن تصوير في قناة تربط الخزانات اثنين.

الشكل 2
الشكل 2. يمكن أن تتولد أنماط الخلية لاصقة (خطوط ونقاط) مع اثنين من تقنيات الطباعة المختلفة من صورة نيون microcontact المطبوعة streptavidin-AlexaFluor350 المسارات (ABS: 346 نانومتر، EM: 442 نانومتر؛ الرمادي). coverslips الزجاج على PLL-PEG المغلفة. تم تصميم قناع الطباعة microcontract كخطوط التي كانت 100 ميكرون واسعة مع 290 ​​ميكرومتر إلى مركز مnter الفضاء. ب. متوسط ​​كثافة الفلورية من microcontact طبع المسارات streptavidin، كما هو مبين في، من خمسة أسطح منفصلة والمقاطع العرضية من أعلى إلى أسفل. عرض متوسط ​​المسار هو 90 ± 6 ميكرون ومتوسط ​​مركز إلى مركز تباعد هو 293 ± 2 ميكرون. ج. صورة brightfield من streptavidin التي تحتوي على نقاط ولدت مع تراجع الطباعة الحجرية القلم. تراوحت أقطارها من النقاط 6 حتي 9 ميكرومتر مع 15 مركز الفضاء إلى مركز ميكرومتر. على نطاق والحانات في و ج هي 100 ميكرون.

الشكل 3
الشكل 3. تم تحميل على أسطح الزجاج المطلي موحد مع streptavidin البيوتين-4-فلوريسئين والبيوتين RGD في الخزان إما من الجهاز ميكروفلويديك (مثبت-3D الشرائح الانجذاب الكيميائي - البيوتين-4-فلوريسئين الانحدار (0.03 ميكروغرام / ميكرولتر 0 ميكروغرام / ميكرولتر). ، Ibidi) التي هيقناة متصلة بواسطة طويلة 1 مم. بعد حضانة 1 ساعة، ويشطف الجهاز مع برنامج تلفزيوني وتعبئتها مع PBS أ. تم التقاط صور الفسيفساء بطول 60 مع الصورة الإجمالية 3072 ميكرومتر وب تم قياس كثافة مضان عبر طول الفسيفساء بأكمله. تم تركيب خطوط الاتجاه الخطي لكثافة مضان للإشارة إلى التدرج RGD في القناة.

الشكل 4
الشكل 4. كثافة مضان من الانحدار فلوريسئين (0 ميكرومتر - 1 ميكرومتر) في قناة ميكروفلويديك على الفور بعد الإعداد (T = 0 ساعة) وبعد الحضانة ب HR 16 PBS دون ومع 1 ميكرومتر تم تحميل فلوريسئين من اليسار واليمين. خزان للجهاز ميكروفلويديك (مثبت-3D الشرائح الانجذاب الكيميائي، Ibidi)، على التوالي. قناة ميكروفلويديك هي 1 ملم في الطول وتم العثور على 50 إلى 1050 موقف ميكرومتر. وكان التدرج مستقرة للا يقل عن 16 ساعة.

الشكل 5
الشكل 5. هيلا الهجرة الخلية في غرفة على microfluidics (مثبت-3D الشرائح الانجذاب الكيميائي، Ibidi) مع معارضة التدرج لاصقة (RGD يجمد على المسارات streptavidin) والانحدار القابلة للذوبان (0-10٪ FBS) أ. صورة ممثل الخلايا في غرفة على microfluidics مع معارضة التدرجات. شريط النطاق هو 50 ميكرومتر. ب الزمن الفاصل بين الصور من خلية تؤخذ مع مجهر epifluorescence (تي نيكون-E). أخذت الصور على فترات 15 دقيقة لمدة 20 ساعة ومسار الخلية (الخط الأزرق) لتحديد المواقع عن طريق الحصول على الخلايا النقطة الوسطى (يماغيج المساعد تتبع الخط). شريط النطاق هو 50 ميكرومتر. ج. مسار خلية من الصور كما هو موضح في ب. خلية TRوتظهر ajectories التي هاجرت نحو تركيز أعلى من FBS قابل للذوبان في الحمراء (N = آثار 36)، وتظهر مسارات الخلية التي هاجرت نحو تركيزات أعلى من RGD تمسكا باللون الأسود (N = آثار 14). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول، استخدمنا جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا (لزجة-3D من الشرائح الانجذاب الكيميائي Ibidi) لدراسة آثار السطوح معدلة كيميائيا والتدرجات جاذب كيميائي على الهجرة الخلية. هذا الإعداد ميكروفلويديك لا يتطلب تدفق لأن يتم تأسيس التدرج عن طريق الانتشار على طول القناة. هذا مهم جدا لأنه يمكن أن يؤثر على تدفق الهجرة بشكل مختلف الخلايا ببطء مثل الخلايا الليفية التي تشكل الالتصاقات البؤرية مستقر وسريع الخلايا المهاجرة مثل معظم الكريات البيض التي تشكل مجمعات التنسيق الصغيرة ونقاط الاشتباك العصبي 26. قد إجهاد القص من تدفق الصفحي تؤثر على استقرار التصاق الخلية لاصقة والعظة الكيميائي الخلايا القابلة للذوبان نحو 27،28 العظة. وجدنا اختلافات في السلوك بين الهجرة بطيئة الحركة وخلايا هيلا تتحرك بسرعة J774 الخلايا مما يدل على أن الإعداد ميكروفلويديك ينطبق على كل أنواع الخلايا الملتصقة وتمسكا أقل. مثل هذه المقارنات أيضا revealeد الفرق بين أنواع الخلايا مثيرة للاهتمام في الردود التصاق والهجرة إلى أنماط السطحية التي ترد كل من العظة لاصقة (الببتيد RGD أو فبرونيكتين) ومنع القاذورات المناطق (مناطق PEG).

تم إنشاء أنماط الطباعة مع سطح microcontact 29 و من ركلة جزاء مجمع دبي للاستثمار 30،31 الطباعة الحجرية. الطباعة Microcontact هو بسيط وسريع نسبيا، وعملية تنميط استنساخه. ومع ذلك، فإن تصميم وتصنيع ختم PDMS، الذي يتحقق من خلال ضوئيه، هو أكثر المعنيين وقتا طويلا. انه يقدم أيضا القيود الخاصة بها في هذا الميزات الصغيرة (<5 ميكرومتر) يصعب تحقيق وتعتمد على نسبة العرض إلى الارتفاع هذا النمط. وباختصار، الطباعة microcontact مثالية لأنماط كبيرة تصل إلى مئات حجم ميكرون والتجارب في، حيث تحتاج إلى نفس أنماط إنشاء عدة مرات. من ناحية أخرى، يمكن استخدام دبوس تراجع الطباعة الحجرية لتوليد ميكرون إلى أنماط nanoscaled. فمن أكثر ملاءمة للطباعة النقاطمن خطوط، يمكن أن تكون ملفقة على الرغم من أن الخطوط. تراجع الطباعة الحجرية دبوس يتيح حرية أكبر في نمط تصاميم، وليس هناك حاجة للسادة الجاهزة، وأقنعة أو الطوابع. ومع ذلك، فإن سرعة عملية الزخرفة بطيئة، مما يجعل من الطباعة مرهقة مناطق واسعة والحصول على صك المتخصصة أمر بالغ الأهمية. أساليب الزخرفة هما ذات الصلة للنظر لأن حجم وشكل أنماط جديلة لاصقة التأثير على المنظمة وتوزيع الآليات التي تنظم النشاط الحيوي الهجرة الخلية 32،33. بالإضافة إلى ذلك، الحد من الجهاز ميكروفلويديك التجارية المستخدمة هنا هي أن طول القناة (1 ميكرومتر) لا يمكن تغيير واحد حتى لا يمكن السيطرة شدة الانحدار إلى أقصى حد من التدرجات لاصقة وقابل للذوبان. إذا حاد التدرجات ضرورية، يحتاج المرء الى افتعال الجهاز ميكروفلويديك مع قناة أقصر بين الخزانات اثنين. والميزة الرئيسية لبروتوكول الموصوفة هنا هو تصميم وحدات مختلفة بحيث سويمكن الجمع rfaces، كيمياء السطح، والنهج الزخرفة والأجهزة ميكروفلويديك لمجموعة واسعة من التجارب الحية التصوير الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليست لدينا مصالح تجارية في الكشف عنها.

Acknowledgments

الكتاب يعترف بتمويل من مجلس البحوث الوطني الاسترالي والصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا وأود أيضا أن أشكر مرفق التصنيع الوطنية الأسترالية للسيد SU-8 لطباعة microcontact. ويدعم SHN من قبل وزارة التعليم العالي وماليزيا يونيفرسيتي سينز ماليزيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass staining outfits Thomas Scientific 8542 E40 Coverslip rack
Oven Binder ED 53 series
Silicon wafer Silicon Quest 708-007 Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist Gersteltec Sarl
SU-8 developer Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%) SuSos AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) 1 mg/ml in PBS
Fluorescein Sigma 46955 1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249 1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein Invitrogen B-1370 0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD GenScript SC1208 0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red Invitrogen S-11346 1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D Ibidi 80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip Greiner Bio-One 739261
Vaseline Sigma 16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C Sigma 327204
Nano eNabler 10 μm cantilever BioForce SPT-S-C-10s
Image J software National Institute of Health rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin Fabrice Cordelières rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool Ibidi GmbH www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 74، علم الأحياء الدقيقة، علم الأحياء الخلوي والكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، الفيزياء الحيوية، والهجرة الخلية، ويعيش التصوير الخلية، التدرجات القابلة للذوبان وتمسكا والطباعة microcontact، وتراجع الطباعة الحجرية القلم، على microfluidics، RGD، PEG، البيوتين، streptavidin، الكيميائي، جاذب كيميائي، التصوير
إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., … More

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., Tønnesen, L., Fairjones, Z., Gooding, J. J., Böcking, T., Gaus, K. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (74), e50310, doi:10.3791/50310 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter