Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Published: April 4, 2013 doi: 10.3791/50310
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 1
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

Summary

Метод для сборки клеем и растворимых градиентов в камере для микроскопии живых исследований миграции клеток описано. Инженерии окружающей среды сочетает в себе обрастания поверхности и клея треки с решением градиенты и, следовательно, позволяет определить относительную важность указания сигналы.

Abstract

Клетки могут чувствовать и мигрировать в сторону более высоких концентраций клей сигналы, такие как гликопротеины внеклеточного матрикса и растворимых сигналы, такие как факторы роста. Здесь мы опишем метод, чтобы создать противоположные градиенты клея и растворимых сигналы в микрофлюидных камеры, которая совместима с изображений живых клеток. Сополимер поли-L-лизин и полиэтиленгликоля (PEG-PLL) используется для пассивации стекла покровные и предотвращения неспецифической адсорбции биомолекул и клеток. Далее, печать микроконтакта или падение пера литографии используется для создания треков стрептавидин на поверхности хроматированная в качестве точки крепления для биотинилированный пептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) в качестве клея кия. Микрофлюидных устройство помещается на модифицированной поверхности и используется для создания градиента клей сигналы (100% РГД до 0% RGD) на стрептавидин треков. Наконец, те же микрофлюидных устройство используется для создания градиента хемоаттрактанта успешноч, как эмбриональная бычья сыворотка (FBS), так как растворимые кия в направлении, противоположном направлению градиента клей сигналы.

Introduction

Режиссер клеточной миграции является фундаментальным свойством многих клеток и является ключевым аспектом многих нормальных физиологических процессах, в том числе эмбрионального развития, защиты от инфекции и заживление ран. Кроме того, миграция клеток и играет важную роль во многих заболеваниях, таких как сосудистые заболевания, метастазирование опухолевых клеток и хронических воспалений 1,2. В то время как классические состояния клеточной миграции - поляризация, выступ расширение, формирование адгезия, сила поколения и задней отвода - как правило, принимается 3,4, выяснение пространственно-временные механизмы, с помощью которых сигнал интеграции координирует была более сложной.

Внеклеточного матрикса (ECM) служит субстратом для адгезии клеток, а через присущих химическим 5 и 6 физических разнообразие, предоставляет направленности сигналы для навигации 7,8. В дополнение к этим клеем сигналы 9, растворимые факторы 10-12 </ SUP>, таких как хемокинов и факторов роста, может вызвать направлены миграцию клеток через хемоаттрактанта рецепторов и их вниз по течению motogenic сигнализации. В настоящее время неизвестно, является ли участие и сигнализации через рецепторы адгезии (т.е. интегринов) или хемоаттрактанта рецепторов, таких как рецептор тирозинкиназы (RTK), являются доминирующими. Также не известно, является ли иерархия рецепторных систем являются специфическими типа клеток.

Онлайн микроскопии клетки дает огромное количество информации, которая не доступна в объеме анализов и могут быть объединены с микрофлюидных устройств для создания градиентов иммобилизованных 13,14 и растворимых сигналов 15 16. Метод, описанный здесь использует ряд простых и установил шаги для модификации поверхности в сочетании с коммерчески доступными микрофлюидных камеры для создания изображений анализа для миграции клеток, которые могут быть легко реализованы в лаборатории клеточной биологии (рис. 1). Собравшиесямикрофлюидных устройство имеет оптические свойства, сравнимые со стеклом 17 и градиенты диффузии молекул стабильны в течение по крайней мере 16 часов. Система может быть использована для эпифлуоресцентной и передовые методы микроскопии. В отличие от других установок хемотаксис 18, эта система подходит для записи медленно мигрируют, прилипшие клетки. Важно отметить, что система является модульной и легко позволяет внедрение альтернативных клея или растворимые сигналы миграции и исследования различных типов клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Пассивация Покровные стекла с PLL-PEG-биотин

Этот шаг предназначен для пассивации поверхности, так что клетки придерживаются и переносить на конкретных регионов на стекло покровное, которые создаются с microcontract печати (шаг 2-3а) или падение пера литографии (Шаг 3b). Для пассивации, сополимер поли-L-лизин (PLL) и полиэтиленгликоля (PEG) используется в которой 20% молекул ПЭГ привиты с биотином (PLL-PEG-биотин).

  1. Для очистки стекла покровные (18 мм х 18 мм), погрузить их в стойке на 100% этанола и установите решетку на ультразвуковую ванну в течение 30 минут. Протрите стекло покровные в воздухе или под струей азота.
  2. Далее, разрушать ультразвуком покровные стекла в течение 30 мин в 1 М NaOH. После этого промойте поверхность стекла тщательно погружения стойку в стакан наполнен 1,5 л Milli-Q H 2 O. Повторите процесс промывки три раза свежих Milli-Q H 2 O каждый раз. Протрите стекло покровные вдуховке при температуре 60 ° C.
  3. Место половине чистое стекло покровные индивидуально во влажной камере, которая состоит из 24-луночный планшет частично заполненный H 2 O. Оставьте 15 мкл PLL-PEG-биотин (1 мг / мл) в PBS на каждый стакан покровное. Возьмите другую половину оставшейся чистой покровные стекла и тщательно сэндвич-PEG решение. Оставьте покровные в течение 1 ч во влажной камере. Вставьте зажатой покровные мягко далеко друг от друга, не поцарапав PEG-покрытием и промойте их Milli-Q H 2 O. Вода должна легко соскальзывать на PEG-лечение сторону. Если необходимо, воздушно-сухого стекла покровные на бумажном полотенце с обработанной поверхностью вверх. Храните стекло покровные в вакуум-эксикаторе до дальнейшего использования.

2. Изготовление штампов для микроконтактной печати

Дается описание двух процессов треков картины стрептавидин на хроматированная покровные стекла. Первое, микрофонrocontact печати, как правило, требует изготовления мастер кремния, из которого штамп PDMS брошен. В нашем случае, рисунок на штамп PDMS на 100 мкм всей линии, расположенные на 290 мкм от центра до центра с функцией высотой 25 мкм. Ниже мы кратко опишем, как изготовить подходящую мастер кремния (шаг 2.1-2.3) и штамп PDMS (шаг 2,4). Тем не менее, существует несколько протоколов для микроконтактной печати описаны в литературе 19-23, которые подходят для печати белка моделей на стекло покровные. Мастера также может быть выполнена на заказ и приобрести из коммерческих источников.

  1. Во-первых, очистить кремниевой пластины (4 "в диаметре) путем инкубации ее в пираньи решение (3:1 V: серной кислоты и 30% перекиси водорода). Течение 20 минут промойте пластины тщательно 10 раз MilliQ H 2 O. Сухие пластины в духовке при 150 ° CO / N.
  2. Промойте чистой и сухой кремниевой пластины со 100% ацетоном, а затем 100% изопропилового спирта. Следующийспин-пальто 2 мл GM1070 SU-8 фоторезиста (Gersteltec Sarl) на пластине при 3100 оборотов в минуту в течение 40 секунд, чтобы создать толщиной 25 мкм слоя. Затем образец запеченные на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 5 мин, а затем еще в течение 5 мин при 95 ° C.
  3. Expose SU-8 фоторезиста к УФ-светом в течение 60 секунд при фотошаблонов с желаемой картины (например, с помощью Quintel Q6000 маски Aligner) и повторить процесс выпечки описаны в п. 2.2. Затем образец разработан погружение подложки в SU-8 разработчик (Gersteltec Sarl) в течение 4 мин, промывают в 100% изопропилового спирта и сушат в токе азота. Площадь SU-8 фоторезиста, который не подвергается воздействию УФ света, таким образом, удалить, создать обратную картину штамп PDMS.
  4. Следующим шагом является приведение штамп PDMS от мастера кремния. Во-первых, тщательно смешать 1 часть (в / в) от отвердителя с 10 частями из эластомера форполимера (Sylgard 184). Для удаления пузырьков воздуха, дегазации смеси в эксикаторе прикреплены к вакуумной линиив течение 1 часа. Затем залить эластомера PDMS на кремнии мастер внутри чашки Петри около 1 см в высоту и вылечить мастера и PDMS смесь в духовке при температуре 70 ° С в течение 1 часа. Наконец, штамп PDMS удаляется от мастера кремния и нарезанные по размеру.

3. Стрептавидин Создание массивов или клей Cues на Пассивированная Покровные стекла

После пассивирующего покровные стекла, белка модели печатаются с микроконтактной печати (шаг 3а) или падение пера литографии (Шаг 3b). В нашем случае, стрептавидин печатаются в виде линий, которые образуют основу для градиентов RGD (Шаг 4). Такая же процедура также может быть использована для печати матричные белки для создания клея моделей.

Альтернативный метод микроконтактной печати для структурирования биомолекул на поверхности является падение пера литографии. В падению пера литографии, консольные используется для передачи небольших объемов раствора на поверхность. Размер консолями, VВязкость раствора, времени контакта кантилевера на поверхность, гидрофобность поверхности и влажности в камере печати определить размер печатной возможности. Преимуществом этого метода является то, что различные модели могут быть распечатаны для каждого эксперимента, так как нет необходимости в изготовлении мастеров и штампов. Недостатком является то, что она занимает больше времени, чтобы распечатать данный шаблон, и что падение пера литографии требуется специалист инструментов, которые не могут быть доступны во многих лабораториях. Литография падение пера инструмент, который мы использовали, был NanoeNabler от Bioforce Нанонауки. Здесь мы печатали маленьких точек, которые были <10 мкм в диаметре, на которые мы использовали SPT10 консолей.

3а. Микроконтактной печати (μCP) Техника

  1. Чтобы очистить и сделать штамп PDMS более гидрофильными, лечить узорные стороны штампов PDMS в УФ и озона (например, УФ-Procleaner озона из Bioforce Нанонауки) в течение 1,5 часов. Кроме того, использование плазменногоочиститель для более короткое время для этой же цели. Этот процесс создает окисленные PDMS поверхность 24, которая улучшает процесс печати.
  2. Сразу после того, озон или плазменной обработки, месте и распространить 10 мкл стрептавидина (1 мг / мл в PBS) на марках PDMS и оставить на 1 час во влажной камере (например, частично заполненный 6-луночный планшет, см. Шаг 1,3) . Если треки должны быть видны под флуоресцентным микроскопом, использовать стрептавидин, что сопряжено с флуорофором, таких как стрептавидин-AlexaFluor350.
  3. Удалите излишки стрептавидин от штампа с бумагой и сухой воздух штамп в течение примерно 1 мин. Слегка нажмите на штамп на PLL-PEG-биотин-покровного стекла с покрытием.
  4. Если флуоресцентные стрептавидин был использован в шаге 3.a2, изучить образец, используя при эпифлуоресцентной микроскопом. Хранить печатных поверхностях в эксикаторе.

3b. Dip Pen Литография

  1. Во-первых, смешать 1 часть 1 мг / мл стрептавидин или STREptavidin-AlexaFluor350 с 10 частей глицерина (V / V) и загружаете 5 мкл смеси на консоли. Затем начинается процесс печати, как описано в руководстве по эксплуатации литографии инструмент пера падение. Чтобы уменьшить размер пятна около 5 мкм, регулировать скорость печати, обратитесь время кантилевера на поверхность или вертикальное расстояние от кантилевера на поверхность. В примере, приведенном на рисунке 2, в точках были напечатаны в соответствии с строк и столбцов разделения установлен в 10-15 мкм. Это расстояние является достаточным для предотвращения точек от слияния друг с другом, но позволяет просматривать несколько точек в одном поле зрения с самых настройках микроскопа.
  2. Хранить печатных поверхностях в эксикаторе.

4. Создание клей Градиенты на стрептавидин-модель поверхности

Мы создали клей градиенты биотин-RGD на стекло покровные, которые покрыты стрептавидина (рис. 3) или соntain стрептавидин узоры на хроматированная покровные стекла (рис. 5). Для создания градиента поверхности, мы использовали имеющийся в продаже микрофлюидных устройство (так называемые липкие-Slide Хемотаксис 3D от Ibidi), что создает устойчивый градиент решения путем пассивной диффузии. Чтобы успешно конкурировать на стрептавидин сайты связывания, мы использовали две противоположные градиенты биотин-RGD и биотина, который не был конъюгированных с RGD (см. Рисунок 1).

  1. Придерживайтесь покрытой стрептавидином покровные или-узорчатого стекла на липкой стороне липкой Презентация Хемотаксис 3D-устройства. Чтобы убедиться, что нет утечки в течение нескольких часов, по краям устройства запечатаны тонким слоем вазелина и нагревали со вторым слоем смеси из 1 части вазелина и 1 части парафина (м / м).
  2. Заполните канал устройства с 6 мкл PBS в канале. Затем залейте двумя резервуарами с 70 мкл 0,03 мкг / мкл биотин-4-флуоресцеина в PBS и 70-мU; л 0,03 мкг / мкл биотин-RGD в PBS, соответственно. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа.
  3. Снимите биотин решениях и тщательно промыть поверхность, а еще привязаны к микрофлюидных устройство дважды с PBS. Отметить направление градиента клея и, если необходимо, храните устройство заполнено PBS при 4 ° С в течение но убедитесь, что устройство не высыхает. При необходимости проанализировать клей градиент с флуоресцентным микроскопом.

5. Маркировка Клетки с флуорофоры для живых клеток

Клетки помечены флуоресцентными красителями, которые помогают клетке отслеживания под флуоресцентным микроскопом. Общие зонды флуоресцентных маркеров органелл, таких Syto 64 Red, который называет клеточного ядра. Для этого клетки сначала три раза промывают PBS, затем инкубировали с 1 мкМ Syto 64 красных в культуральной среде в течение 45 минут и, наконец, промывали еще три раза с PBS. Пожалуйста, обратите внимание, что клетки не должно бытьхраниться в PBS в течение длительного периода времени.

Альтернативные красители для сотового слежения, CellTracker серии, которые окрашивают цитоплазму и сохраняется во время миграции и деление клеток. Трансфекции клеток с флуоресцентным белком слияния особенно полезна для записи субклеточном распределении интерес белка во время миграции. Тем не менее, флуоресцентные белки обычно фото-отбеливатель быстрее, чем органические красители, так что долгосрочных наблюдений может оказаться невозможным.

6. Загрузка Клетки с Растворимые Gradient в устройство Microfluidics

  1. Граф флуоресцентно меченых клеток и разделилась на две трубы из равного числа клеток. Вымойте и ресуспендируют одна трубка клеток с носителя, содержащего хемоаттрактанта, таких как изменение Eagle низкий уровень глюкозы в Дульбекко Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Вымойте и ресуспендируют другие трубки клетки в средах без хемоаттрактанта, т.е. DMEM с 0% FBS. Конечная концентрацияклеток в каждой пробирке должна быть 5 х 10 5 клеток / мл.
  2. Удалите все решения от микрофлюидных устройства (начиная с шага 4,3) и поместить его на предметный столик микроскопа (см. Шаг 7). Загрузите 70 мкл клеток (5 × 10 5 клеток / мл в 0% FBS DMEM) в одном резервуаре и 70 мкл клеток HeLa (5 х 10 5 клеток / мл в 10% FBS DMEM) в другой. Свободно разместить ленты на водохранилищах, чтобы избежать испарения. Если клетки на поверхности предварительно инкубировали до визуализации, желательно, что клетки будут загружены в устройство в питательной среде без градиента. Устройство помещается на столик микроскопа и средств массовой информации заменили градиентных сред DMEM т.е. без FBS в одном резервуаре и DMEM с 10% FBS в другой.

7. Изображений живых клеток и анализ данных

  1. Включите микроскопа (Nikon Ti-E) и согреться этапе по крайней мере, 1 ч до начала эксперимента.
  2. Убедитесь, что канал микрofluidic устройство находится в поле зрения и клетки находятся в фокусе. Выберите изображение приобретение параметров, таких как воздействие раза и флуоресцентных фильтров, последовательность изображений из светлого поля и флуоресценции, которая фиксирует клетки и композиции, а также моменты времени и длительности записи (например, каждые 15 минут в течение 16 часов).
  3. Анализ данных с соответствующими программного обеспечения, таких как ImageJ Руководство слежения или Ibidi хемотаксиса и миграции Tool.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы понять, как клетки интеграции миграционных сигналов 25, мы разработали метод изображений клеток с флуоресцентной микроскопии, которые мигрируют в окружающую среду с конкурирующими клея и растворимых градиентов (рис. 1). Клей треков, которые содержали флуоресцентные стрептавидином и биотинилированным RGD были созданы с микроконтакта печатных дорожек и падение пера литографии (рис. 2). Успешная печать микроконтакта указывается профиль линии интенсивности флуоресценции через пути, где клей треки и противообрастающих регионах можно четко отличать (рис. 2б). Многоточие печатается с падения пера литографии появляются округлые, а не разрушать форму, с указанием успешного процесса печати. Химия поверхности и влажность влияет на результат процесса печати. Вообще говоря, более гидрофобные поверхности, тем лучше результаты печати.

Градиент клея сигналына печатной дорожки были созданы с помощью простого устройства микрофлюидики путем загрузки биотин-4-флуоресцеина и биотин-RGD в противоположную сторону микрофлюидных камеры (рис. 3). Так как молекулы связываются конкурентоспособным на стрептавидин дорожки на поверхности стекла, иммобилизованным градиентом RGD лигандов генерируется. После удаления биотин / биотин-RGD решение, то же камера может быть использована для введения растворимых градиент, который является стабильным в течение микрофлюидных каналов по крайней мере 16 ч (рис. 4).

Мы ввели HeLa клеток в камере с хемоаттрактанта градиента, для которых FBS был использован. При низкой плотности, HeLa клетки преимущественно придерживались и мигрировали на стрептавидин / RGD треков (N клетках = 50) и избегать противообрастающей PEG регионах (N клетках = 19). Позиция отдельных клеток был записан за 16 ч и анализировали с помощью программного обеспечения отслеживания клетки. В эксперименте, где клей и решенияBLE градиенты противоположны друг другу (рис. 5), траектории отдельных клеток показало, что более HeLa клетки мигрировали к источнику хемоаттрактанта (красные следы на рисунке 5в, N следы = 36), чем к более высокой концентрации приверженцем RGD (черный Следы на рисунке 5в, N следы = 14). Среднее расстояние, что клетки мигрировали в отношении (черные следы) или (красные следы) направление градиента FBS (х-компонента среднего водоизмещения каждой траектории) был 0,1700 ± 0,1172 и 0,2278 ± 0,1280, соответственно (P <0,0001, студент Т-тест), хотя не было никакой статистически значимой разницы в среднем смещение между черными следами (56,18 ± 32,27 мкм) и красные следы (72,86 ± 45,05 мкм, P> 0,05, Стьюдента-тест). HeLa клетки мигрируют со средней скоростью 17,47 ± 4,72 мкм / ч в присутствии обоих градиент клеяКий (т.е. RGD) и растворимые кия (т.е. FBS). Поэтому данные позволяют предположить, что для клеток HeLa, FBS градиент определяет направление миграции в то время как клетки сохраняют внутреннюю скорость миграции на клей треков.

Мы также оценивали миграцию макрофагов клеточной линии J774. В отсутствие клея и растворимых градиенты, эти клетки мигрируют на более высоких скоростях (38,55 ± 17,88 мкм / ч), чем клетки HeLa (16.47 ± 4,28 мкм / ч), но с меньшей настойчивостью J774 т.е. изменение направления клетки (направленность 0,059 ± 0,091 ), измеряемый как отношение смещения отслеживать длину чаще, чем HeLa клеток (0,57 ± 0,12) на микроконтакта печатных фибронектина треков. J774 клетки также менее зависимы, чем контакт клеток HeLa. Смещения J774 клеток была выше на регионы PEG (102,20 ± 54,73 мкм), чем на фибронектин треков (42,95 ± 39,90 мкм). Кроме того, J774 клетокppeared чтобы адаптироваться к различным химии поверхности путем изменения механизма их миграции из мезенхимальных к амебоидной. В заключение, клей сигналы не столь важно J774 клеток, так и для клеток HeLa. Оба типа клеток преимущественно мигрировали в направлении растворимого кия.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема процесса изготовления из микрофлюидных установку, которая позволяет изображений мигрирующих клеток в ответ на противоположных градиентов клея по сравнению с растворимым сигналы.. Стекла покровные пассивированы с биотинилированным PLL-PEG. Б. Клей моделей люминесцентные ртутьсодержащие стрептавидин печатаются на биотинилированные поверхность либо в качестве линий с использованием микроконтактной печати (б) или точек с помощью DIP-перо литографии (б '). с. Г. Клеток и растворимых градиент хемоаттрактанта 0-10% FBS загружаются в микрофлюидных устройства. После клетки прилипают к поверхности, живут миграцию клеток через RGD градиентов на треки стрептавидином и в присутствии FBS градиенты могут быть отображены в канале, соединяющем два резервуара.

Рисунок 2
Рисунок 2. Сотовые клей моделей (линии и точки) могут быть получены с двумя различными методами печати флуоресцентное изображение микроконтакта печатных стрептавидин-AlexaFluor350 треков (Abs: 346 нм, Em: 442 нм, серый).. На PLL-PEG-покрытием покровные стекла. Microcontract маску печати был разработан в качестве линии, которые были 100 мкм, шириной 290 мкм от центра до н.э.Гюнтер пространстве. б. средняя интенсивность флуоресценции микроконтактных печатных стрептавидин треки, как показано на, из пяти отдельных поверхностей, сечения от верха до низа. Средняя ширина трассы составляет 90 ± 6 мкм, а средний центра до центра расстояние составляет 293 ± 2 мкм. С. Изображение светлого стрептавидина содержащие точки, созданные с падения пера литографии. Диаметры точек колебался от 6 - 9 мкм 15 мкм от центра до центра пространства. Шкала баров и с-100 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3. Биотин-4-флуоресцеина градиент (0 мкг / мкл - 0,03 мкг / мкл). На стеклянную поверхность равномерно покрыта стрептавидин биотин-4-флуоресцеина и биотин-RGD были загружены в любой резервуар микрофлюидных устройства (липкие-Slide Хемотаксис 3D , Ibidi), которые являютсясвязанные 1 мм длиной канала. После 1 часа инкубации, устройство промывали PBS и наполняется PBS.. 60 изображений мозаики были взяты с общей длиной 3072 мкм изображения и б интенсивности флуоресценции измеряют по длине всей мозаики. Линейный линии тренда были установлены на интенсивность флуоресценции для обозначения RGD градиента в канале.

Рисунок 4
Рисунок 4. Интенсивность флуоресценции флуоресцеина градиент (0 мкм - 1 мкм) в микрофлюидных канала сразу после установки (Т = 0 ч) и б после 16 ч инкубации PBS без и с 1 мкМ флуоресцеина был загружен из левых и правых. резервуаром микрофлюидных устройства (липкие-Slide Хемотаксис 3D, Ibidi), соответственно. Микрофлюидных канала 1 мм в длину инаходится в положении от 50 до 1050 мкм. Градиент был стабильным в течение по крайней мере 16 часов.

Рисунок 5
Рисунок 5. HeLa миграции клеток в микрофлюидики камеры (липкие-Slide Хемотаксис 3D, Ibidi) с противоположными клей градиент (иммобилизованные РГД на трассах стрептавидин) и растворимые градиентом (0-10% FBS).. Представитель изображения клеток в камере с микрофлюидики противоположные градиенты. Шкала бар 50 мкм. Б замедленной изображения ячейки, взятой с эпифлуоресцентной микроскопа (Nikon Ti-E). Изображения были приняты на 15 мин интервалами в течение 20 часов и сотовых траектории (синяя линия), полученные с помощью мобильного центра тяжести позиционирования (ImageJ ручного отслеживания плагин). Шкала бар 50 мкм. С. Сотовые траектории от изображения, как показано на б. Сотовые TRajectories, которые мигрировали к более высокой концентрации растворимых FBS показаны красным (N следы = 36); клетки траекториям, которые мигрировали в сторону более высоких концентраций приверженцем RGD представлены в черном (N следы = 14). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе, мы использовали имеющийся в продаже микрофлюидных устройства (липкие-Slide Хемотаксис 3D от Ibidi) для изучения последствий химически модифицированной поверхности и хемоаттрактанта градиентов на миграцию клеток. Это микрофлюидных установка не требует потока, потому что градиент устанавливается путем диффузии по длине канала. Это важно, поскольку поток может повлиять дифференциально медленно мигрируют клетки, такие как фибробласты, образующие стабильные фокальные адгезии и быстро мигрирующих клеток, как и большинство лейкоцитов, которые образуют небольшие координационные комплексы и синапсов 26. Напряжение сдвига от ламинарного течения могут повлиять на устойчивость клеточной адгезии клея для киев и клетки хемотаксис по отношению к растворимым сигналы 27,28. Мы обнаружили, что различия в поведении между миграцией медленно движущихся клеток HeLa и быстро движущихся J774 клетки тем самым показывая, что микрофлюидных установку применимо для обоих приверженцем и сторонником менее типов клеток. Такое сравнение также revealeг интересное различие между типами клеток в адгезии и миграции ответы на поверхности модели, которые содержали как клей сигналы (RGD пептиды или фибронектин) и противообрастающих регионов (PEG районы).

Поверхность модели были созданы с микроконтактной печати 29 и DIP-перо литографии 30,31. Микроконтактной печати представляет собой простой и относительно быстрый, воспроизводимый процесс структурирования. Тем не менее, проектирование и изготовление штампа PDMS, которая достигается с помощью фотолитографии, является более сложным и трудоемким. Он также вводит свои ограничения в том, что мелкие черты (<5 мкм) трудно добиться и зависят от пропорций шаблону. Короче говоря, микроконтактной печати идеально подходит для больших моделей до сотен микрон размера и в экспериментах, где те же модели необходимо создано много раз. С другой стороны, падение контактный литографии может быть использован для создания микрон до наноразмерных образцов. Это больше подходит для печати точекчем линии, хотя линии могут быть сфабрикованы. Dip контактный литография дает большую свободу в шаблон дизайна, так как нет необходимости сборных маски, мастеров или марки. Тем не менее, скорость структурирования процесс идет медленно, делая печати больших площадей громоздкими и доступ к специализированным инструментом является решающим. Эти два способа структурирования имеют значение для рассмотрения, так как размер и форма клей модели кия влияет на организацию и распределение биомеханические механизмы, которые регулируют миграцию клеток 32,33. Кроме того, ограничение коммерческой микрофлюидных устройство, используемое здесь является то, что длина канала (1 мкм) не может быть изменена и поэтому никто не может контролировать максимальную крутизну клея и растворимых градиентов. Если крутые градиенты необходимости, можно было бы необходимо для изготовления микрофлюидных устройство с более короткий канал между двумя водохранилищами. Ключевым преимуществом протокола описаны здесь является модульная конструкция, так что разные суrfaces, поверхностные химические, структурирование подходов и микрофлюидных устройств могут быть объединены для широкого круга живых экспериментов визуализации ячейки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас нет никаких коммерческих интересов раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают, финансирование из Австралийского исследовательского совета и национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, а также хотел бы поблагодарить Австралийский Национальный фонд для изготовления SU-8 мастер для микроконтакта печати. SHN при поддержке Министерства высшего образования Малайзии и Universiti Sains Малайзии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass staining outfits Thomas Scientific 8542 E40 Coverslip rack
Oven Binder ED 53 series
Silicon wafer Silicon Quest 708-007 Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist Gersteltec Sarl
SU-8 developer Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%) SuSos AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) 1 mg/ml in PBS
Fluorescein Sigma 46955 1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249 1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein Invitrogen B-1370 0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD GenScript SC1208 0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red Invitrogen S-11346 1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D Ibidi 80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip Greiner Bio-One 739261
Vaseline Sigma 16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C Sigma 327204
Nano eNabler 10 μm cantilever BioForce SPT-S-C-10s
Image J software National Institute of Health rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin Fabrice Cordelières rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool Ibidi GmbH www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Tags

Биоинженерия выпуск 74 микробиологии клеточной биологии биохимии молекулярной биологии биофизики миграция клеток получение изображений живых клеток растворимый и приверженцем градиентов микроконтактной печати падение пера литографии микрофлюидики RGD PEG биотин стрептавидин хемотаксис хемоаттрактанта визуализации
Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., … More

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., Tønnesen, L., Fairjones, Z., Gooding, J. J., Böcking, T., Gaus, K. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (74), e50310, doi:10.3791/50310 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter