Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Opprette Lim og Løselig overgangar for Imaging Cell Migration med fluorescens mikroskopi

Published: April 4, 2013 doi: 10.3791/50310
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 1
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

Summary

Fremgangsmåte for sammenstilling av klebende og løselig gradienter i en mikroskopi kammer for live celle migrasjon studier er beskrevet. De utviklet miljø kombinerer bunnstoff overflater og lim spor med løsning gradienter og derfor gjør det mulig å bestemme den relative betydningen av veiledning signaler.

Abstract

Celler kan føle og migrere mot høyere konsentrasjoner av selvklebende signaler som de glykoproteiner av ekstracellulær matriks og løselige signaler som vekstfaktorer. Her, skissere vi en fremgangsmåte for å lage motstridende gradienter av klebende og løselig pekepinner i en microfluidic kammer, som er kompatibel med levende celle bildebehandling. En kopolymer av poly-L-lysin og polyetylenglykol (PLL-PEG) er anvendt for å passivere glass dekkglass og hindre ikke-spesifikk adsorpsjon av biomolekyler og celler. Neste, microcontact utskrift eller dip penn litografi er brukt til å lage sporene streptavidin på passiverte overflater for å tjene som forankringspunkter for biotinylert peptid arginin-glycin-asparaginsyre (RGD) som limet stikkordet. En microfluidic enheten er plassert på den modifiserte overflaten og brukes til å lage gradient av selvklebende pekepinner (100% RGD til 0% RGD) på streptavidin spor. Endelig, er det samme microfluidic enhet som brukes til å opprette en gradient av en kjemotiltrekkende sukh som føtalt bovint serum (FBS), som det løselige stikkordet i motsatt retning av gradienten av selvklebende signaler.

Introduction

Rettet celle migrasjon er en grunnleggende egenskap av mange celler og er en viktig del av mange normale fysiologiske prosesser, herunder embryoutvikling, forsvar mot infeksjoner og sårheling. I tillegg spiller cellemigrering også en fremtredende rolle i mange sykdommer som vaskulær sykdom, tumorcelle metastasering og kronisk inflammasjon 1,2. Mens de klassiske statene celle migrasjon - polarisering, protrusion forlengelse, dannelse av vedheft, kraft generasjon og bak tilbaketrekking - er generelt akseptert 3,4, har klarlegging av Spatiotemporal mekanismer som signal integrasjon er koordinert vært mer utfordrende.

Den ekstracellulære matriks (ECM) fungerer som et substrat for celleadhesjon, og gjennom iboende kjemisk 5 og fysiske 6 mangfold, gir retningsbestemte signaler for celle navigering 7,8. I tillegg til disse lim pekepinner 9, oppløselige faktorer 10-12 </ Sup> for eksempel chemokines og vekstfaktorer kan indusere rettet celle migrasjon gjennom kjemotiltrekkende reseptorer og deres nedstrøms motogenic signalveier. Foreløpig er det ikke kjent om engasjement og signalering gjennom adhesjonsreseptorer (dvs. integriner) eller kjemotiltrekkende reseptorer som reseptor tyrosinkinase (RTK) er dominerende. Det er heller ikke kjent om hierarkier av reseptorsystemer er celletype bestemt.

Levende celle mikroskopi gir et vell av informasjon som ikke er tilgjengelig i bulk analyser og kan kombineres med microfluidic enheter å generere graderinger av immobilisert 13,14 og løselig pekepinner 15 16. Metoden beskrevet her anvender en serie enkle og etablerte trinn for overflatemodifisering sammen med et kommersielt tilgjengelig microfluidic kammer for å opprette en avbildning assay for celle migrasjon som lett kan gjennomføres på en cellebiologi laboratorium (figur 1). Den sammensattemicrofluidic enhet har optiske egenskaper som er sammenlignbare med glass 17 og gradienter av diffusjonsevne molekyler er stabil i minst 16 timer. Systemet kan brukes til epifluorescence og avanserte mikroskopi teknikker. I motsetning til andre chemotaxis oppsett 18, er dette systemet egnet for opptak langsomt migrere, adherente celler. Viktigere er systemet modulært og lett tillater innføring av alternative klebemiddel eller oppløselige migrasjon signaler og undersøkelse av forskjellige celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Passivisering av Glass Dekkglass med PLL-PEG-biotin

Dette trinnet er utformet for å passivere overflaten slik at cellene fester seg og migrere bort bestemte områder på dekkglass som opprettes med microcontract trykkteknikker (Trinn 2-3a) eller dip penn litografi (Trinn 3b). For passivering, er en co-polymer av poly-L-lysin (PLL) og polyetylenglykol (PEG) som brukes i hvilken 20% av PEG molekyler blir podet til biotin (PLL-PEG-biotin).

  1. Å rengjøre glass dekkglass (18 mm x 18 mm), dukke dem i et rack i 100% etanol og plassere rack i en sonicating bad i 30 min. Tørk glass dekkglass i luft eller under en strøm av nitrogen.
  2. Neste, sonicate glasset dekkglass i 30 min i 1 M NaOH. Etterpå skyller glassflatene ved forsiktig å dyppe rack i et beger fylt med 1,5 L Milli-Q H 2 O. Gjenta skylling tre ganger med ferske Milli-Q H 2 O hver gang. Tørk av glasset dekkglass ien ovn ved 60 ° C.
  3. Plass halvparten av rent glass dekkglass individuelt i et fuktig kammer, som er laget av en 24-brønns plate delvis fylt med H 2 O. Slipp 15 pl av PLL-PEG-biotin (1 mg / ml) i PBS på hvert glass dekkglass. Ta den andre halvparten av de gjenværende rent glass dekkglass og nøye sandwich PEG løsning. La dekkglass for 1 hr i fuktig kammer. Skyv klemt dekkglass forsiktig bort fra hverandre uten skraping PEG-belagte overflaten og skyll dem med Milli-Q H 2 O. Vannet skal gli av lett på PEG-behandlet side. Om nødvendig, air-Tørk av glasset dekkglass på papir håndkle med behandlet overflate vender oppover. Oppbevar glass dekkglass i et vakuum eksikator inntil videre bruk.

2. Fabrikasjon av stempler for Microcontact Printing

Vi beskriver to prosesser til mønster streptavidin spor på de passive glass dekkglass. Den første, microcontact trykkteknikker, krever vanligvis fabrikasjon av en silisium malen som en PDMS stempel støpes. I vårt tilfelle, mønsteret på PDMS stempel er 100 mikrometer brede linjer som fordeles 290 mikrometer senter-til-senter med en funksjon høyde på 25 mikrometer. Nedenfor beskriver vi kort hvordan å dikte opp en egnet silisium master (trinn 2.1 til 2.3) og PDMS stempel (trinn 2.4). Det er imidlertid flere protokoller for microcontact trykkteknikker beskrevet i litteraturen 19-23, som er egnet for trykking protein mønstre på glass dekkglass. Masters kan også være skreddersydde og kjøpt fra kommersielle kilder.

  1. Først rengjøres silisiumskive (4 "i diameter) ved å inkubere det i piranha løsning (03:01 v: v av svovelsyre og 30% hydrogenperoksid). I 20 min Skyll wafer grundig 10 ganger med MilliQ H 2 O. Tørk wafer i en ovn ved 150 ° CO / N.
  2. Skyll den rene og tørkede silisiumskive med 100% aceton, etterfulgt av 100% isopropylalkohol. Nestespin-coat 2 ml GM1070 SU-8 fotoresist (Gersteltec Sarl) på wafer på 3100 rpm i 40 sekunder for å lage en 25 mikrometer tykt lag. Prøven blir deretter bakt på en kokeplate ved 65 ° C i 5 min etterfulgt av en ytterligere 5 min ved 95 ° C.
  3. Utsett SU-8 fotoresist for UV-lys i 60 sekunder under en photomask med ønsket mønster (for eksempel ved hjelp av en Quintel Q6000 maske aligner) og gjenta bakeprosessen beskrive i 2.2. Deretter prøven er utviklet ved å dyppe wafer i SU-8 utvikler (Gersteltec SARL) etter 4 min, skylles i 100% isopropylalkohol og tørket under nitrogenstrøm. Arealet av SU-8 fotoresist som ikke ble eksponert for UV-lys blir dermed fjernet, skaper den inverse mønster av PDMS stempel.
  4. Det neste trinnet er å kaste en PDMS stempel fra silisium master. Først blandes en del (w / w) av den herdemiddel med 10 deler av elastomer prepolymer (Sylgard 184). Å fjerne luftbobler, Degas blandingen i en eksikator festet til et vakuum linjei 1 time. Neste, hell PDMS elastomer på silisium masteren i en petriskål til ca 1 cm i høyde og kurere master og PDMS blandingen i en ovn ved 70 ° C i 1 time. Til slutt blir PDMS stempel fjernes fra silisiumoverflaten master og skåret til størrelse.

3. Mønster Streptavidin eller selvklebende Cues på passivated Glass Dekkglass

Etter passiviserende glass dekkglass, er protein mønstre trykt med microcontact utskrift (Trinn 3a) eller dip-penn litografi (trinn 3b). I vårt tilfelle, er streptavidin skrives som linjer, som danner grunnlag for RGD gradienter (trinn 4). Den samme fremgangsmåten kan også brukes for utskrift matriksproteiner opprette selvklebende mønstre.

En alternativ metode for å microcontact utskrift for fordelingen av biomolekyler på overflater er dip penn litografi. I dip penn litografi, en cantilever brukes til å overføre et lite volum av løsning på overflaten. Størrelsen på kantilever, viscosity av løsningen, kontakttid av cantilever på overflaten, hydrofobitet av overflaten og fuktighet i utskriften kammeret avgjør størrelsen av de trykte funksjoner. Fordelen med denne metoden er at ulike mønstre kan skrives ut for hvert eksperiment, som det ikke er behov for å fabrikkere mestere og frimerker. Ulempen er at det tar lengre tid å skrive ut et gitt mønster og at dip penn litografi krever en spesialist instrument som kanskje ikke er tilgjengelig i mange laboratorier. Dip penn litografi instrument som vi brukte var NanoeNabler fra Bioforce Nanovitenskap. Her trykket vi små prikker som var <10 mm i diameter, som vi brukte SPT10 cantilevers.

3a. Microcontact utskrift (μCP) Teknikk

  1. Å rengjøre og gjøre PDMS stempel mer hydrofile, behandle det mønstrede side av PDMS stempler i en UV og ozon (for eksempel UV-Ozone Procleaner fra Bioforce Nanovitenskap) for 1,5 timer. Alternativt kan du bruke en plasmarenere for en kortere tid for samme formål. Denne prosessen skaper en oksidert PDMS 24 overflate, noe som forbedrer utskriften.
  2. Umiddelbart etter ozon eller plasma behandling, sted og spre 10 ul streptavidin (1 mg / ml i PBS) på de PDMS frimerker og la stå 1 hr i et fuktig kammer (for eksempel en delvis fylt 6-brønners plate, se trinn 1.3) . Hvis spor skal være synlig under fluorescerende mikroskop, bruker streptavidin som er konjugert til en fluorofor som streptavidin-AlexaFluor350.
  3. Fjern overflødig streptavidin fra stempel med silkepapir og lufttørke stempel for ca 1 min. Trykk lett på stempel på PLL-PEG-biotin-belagt glass dekkglass.
  4. Hvis fluoriserende streptavidin ble brukt i trinn 3.a2, undersøke mønster ved hjelp under en epifluorescence mikroskop. Oppbevar utskrevne flater i en eksikkator.

3b. Dip Pen Litografi

  1. Først, bland 1 del av 1 mg / ml streptavidin-eller streptavidin-AlexaFluor350 med 10 deler av glyserol (v / v) og laste 5 pl av blandingen på cantilever. Deretter starte utskriften prosessen som beskrevet i bruksanvisningen som fulgte med dip penn litografi instrument. Å redusere punktstørrelse til omkring 5 um, juster utskriftshastigheten, kontakttid av cantilever på overflaten eller vertikal avstand cantilever til overflaten. I eksemplet vist i figur 2c, ble prikker trykt i en linje med rad og kolonne separasjon satt til 10-15 pm. Denne avstanden er tilstrekkelig til å forhindre prikker fra sammenslåing til hverandre, men tillater visning av flere punkter i en enkelt synsfelt med fleste mikroskop innstillinger.
  2. Oppbevar utskrevne flater i en eksikkator.

4. Opprette selvklebende overgangar bort på Streptavidin-mønster Overflater

Vi skaper adhesive gradienter av biotin-RGD på glassplater dekkglass som er belagt med streptavidin (figur 3) eller contain streptavidin mønstre på passiverte glass dekkglass (figur 5). Å skape en overflate gradient, brukte vi en kommersielt tilgjengelig microfluidic enhet (kalt klebrig-Slide chemotaxis 3D fra Ibidi) som skaper en stabil løsning gradient ved passiv diffusjon. Å konkurrere om streptavidin bindingssteder, brukte vi to motstridende graderinger av biotin-RGD og biotin som ikke var konjugert til RGD (se figur 1).

  1. Følge de streptavidin-belagte eller-mønstrede glass dekkglass på den klebrige siden av sticky-Slide chemotaxis 3D enhet. For å sikre at det ikke er noen lekkasje i flere timer, blir kantene av enheten forseglet med et tynt lag av varme vaselin og med et andre lag av en blanding av 1 del av vaselin til 1 del av parafinvoks (w / w).
  2. Fyll kanalen på enheten med 6 pl PBS i kanalen. Deretter fyller de to reservoarene med 70 pl av 0,03 ug / ul biotin-4-fluorescein i PBS og 70 & mu; l av 0,03 ug / ul biotin-RGD i PBS, henholdsvis. Inkuber prøvene ved RT i mørket i 1 time.
  3. Fjern biotin løsninger og nøye skyll overflaten mens fortsatt festet til microfluidic enhet to ganger med PBS. Marker retning av limet gradient og hvis nødvendig, oppbevar enheten fylt med PBS ved 4 ° C for, men sikre at enheten ikke tørker ut. Hvis nødvendig, analysere limet gradient med en fluorescerende mikroskop.

5. Merking av celler med fluoroforer for Live Cell Imaging

Celler er merket med fluorescerende fargestoffer som bistår celle sporing under fluorescerende mikroskop. Vanlige sonder er fluorescerende organellesystemer markører, slik Syto 64 Red, som betegner cellekjernen. Å gjøre det, er celler først vasket tre ganger med PBS, deretter inkubert med 1 uM Syto 64 Rød i dyrkningsmedier for 45 minutter og til slutt vasket ytterligere tre ganger med PBS. Vær oppmerksom på at cellene ikke skal væreholdt i PBS i lange perioder av gangen.

Alternative fargestoffer for celle sporing er CellTracker serie som flekken cytoplasma og beholdes under celle migrasjon og divisjon. Transfeksjon av celler med fluorescerende fusjonsprotein er spesielt nyttig til å registrere de subcellulære distribusjoner av et protein av interesse i løpet av overføringen. Men fluorescerende proteiner typisk foto-blekemiddel raskere enn organiske fargestoffer, slik at langsiktige observasjoner ikke kan være mulig.

6. Lasting av celler med en Løselig Gradient i MicroFluidics enhet

  1. Tell fluorescensmerkede celler og delt inn i to tuber like celle tall. Vask og resuspender ett rør av celler med mediet som inneholder kjemotiltrekkende, slik som lav glukose Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS). Vask og resuspender det andre røret av celler i medier uten kjemotiltrekkende, dvs. DMEM med 0% FBS. Den endelige konsentrasjonenav celler i hvert rør bør være 5 x 10 5 celler / ml.
  2. Fjern alle løsninger fra microfluidic enheten (fra trinn 4.3) og plasser den på mikroskopet scenen (se trinn 7). Last 70 ul celler (5 x 10 5 celler / ml i 0% FBS DMEM) i ett reservoar og 70 pl av HeLa-celler (5 x 10 5 celler / ml i 10% FBS DMEM) inn i en annen. Løst plassere en tape over reservoarene for å unngå fordampning. Hvis cellene på overflaten er pre-inkubert før bildebehandling, er det tilrådelig at cellene blir lastet inn i enheten i vekstmedier uten gradient. Enheten blir deretter plassert på mikroskopet scenen og media erstattet med gradient media dvs. DMEM uten FBS i en reservoar-og DMEM med 10% FBS i den andre.

7. Lever Cell Imaging og dataanalyse

  1. Slå på mikroskop (Nikon Ti-E) og varme opp scenen minst 1 time før du starter eksperimentet.
  2. Sørg for at kanalen for den microfluidic enheten er i synsfeltet og cellene er i fokus. Velg bilde oppkjøpet parameter som eksponeringstider og fluorescerende filtre, bildesekvens av lyse felt og fluorescens som fanger celler og spor samt tidspunkter og opptak lengde (f.eks hvert 15 min i 16 timer).
  3. Analysere data med passende programvare som ImageJ Manuell Tracking eller Ibidi chemotaxis og Migration Tool.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å forstå hvordan celle integrere trekkende signaler 25, har vi utviklet en metode for å bildet celler med fluorescens mikroskopi som vandrer i et miljø med konkurrerende lim og løselig gradienter (figur 1). Selvklebende spor som inneholdt fluorescerende streptavidin og biotinylert RGD ble opprettet med microcontact trykte spor og dip penn litografi (figur 2). Vellykket microcontact trykkteknikker indikeres av linje profilen av fluorescensintensiteten tvers sporene der limet spor og anti-fouling regioner klart skiller (Figur 2b). Punkter som skal skrives med dip penn litografi vises avrundet, ikke rive formet, noe som indikerer en vellykket utskrift. Overflatekjemi og fuktighet påvirker utfallet av prosessen. Generelt sett, jo mer hydrofobe overflaten er, jo bedre utskrift utfall.

En gradering av selvklebende pekepinnerden trykte spor ble opprettet med en enkel MicroFluidics enheten ved å laste biotin-4-fluorescein og biotin-RGD i motsatt side av en microfluidic kammer (Figur 3). Siden begge molekyler binde kompetitivt til streptavidin sporet på glassflaten, en immobilisert gradient av RGD ligander generert. Etter fjerning biotin / biotin-RGD-løsning, kan det samme kammer bli brukt til å innføre en oppløselig gradient, som er stabil innenfor microfluidic kanalen i minst 16 timer (figur 4).

Introduserte vi HeLa celler inn i kammeret med en kjemotiltrekkende gradient, hvor FBS ble anvendt. Ved lave tettheter, HeLa-celler fortrinnsvis overholdt og migrerte på streptavidin / RGD spor (N celler = 50) og unngikk bunnstoff PEG regioner (N celler = 19). Plasseringen av individuelle celler ble spilt inn over 16 timer og analysert med en celle sporing av programvare. I et eksperiment hvor lim og løsningerBLE gradienter motsetning til hverandre (figur 5), viste baner av individuelle celler som flere HeLa celler vandret mot kilden til kjemotiltrekkende (røde spor i Figur 5c, N spor = 36) enn mot høyere konsentrasjoner av tilhenger RGD (svart spor i fig 5c, N = 14) spor. Den gjennomsnittlige avstanden at celler migrert mot (svarte spor) eller i (røde spor) retningen av FBS gradienten (x-komponenten av gjennomsnittlig forskyvning av hver bane) var 0,1700 ± 0,1172 og 0,2278 ± 0,1280, henholdsvis (P <0,0001, Student t-test), selv om det ikke var noen statistisk signifikant forskjell i gjennomsnittlig forskyvning mellom de svarte spor (56,18 ± 32,27 mikrometer) og Red spor (72,86 ± 45,05 jim, P> 0,05, Student t-test). HeLa celler migrere med en gjennomsnittlig hastighet på 17,47 ± 4,72 mikrometer / t i nærvær av både gradient av limcue (dvs. RGD) og løselig cue (dvs. FBS). Dataene foreslår derfor at for HeLa-celler, bestemmer FBS gradient retning migrasjon mens cellene opprettholde en iboende migrasjon hastighet på limet sporene.

Vi har også vurdert migrering av macrophage cellelinjen J774. I fravær av klebende og løselig gradienter, disse celler migrere ved mye høyere hastigheter (38,55 ± 17,88 mikrometer / hr) enn HeLa celler (16,47 ± 4,28 um / time), men med mindre persistency dvs. J774 celler endre retning (retningen på 0,059 ± 0,091 ), målt som forholdet mellom forskyvningen å spore lengde oftere enn HeLa celler (0,57 ± 0,12) for microcontact trykt fibronektin spor. J774 celler er også mindre kontakt avhengig enn HeLa celler. Forskyvning av J774 celler var høyere på PEG regioner (102,20 ± 54,73 mikrometer) enn på fibronektin spor (42.95 ± 39.90 mm). I tillegg J774 celler enppeared å tilpasse seg ulike overflatekjemi ved å endre sin mekanisme av migrasjon fra mesenchymale til amoeboid. I konklusjonen, selvklebende signaler er ikke så viktig for J774 celler som de er for HeLa celler. Begge celletyper fortrinnsvis migrert mot retning av det oppløselige stikkordet.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av fabrikasjon prosessen med en microfluidic oppsett som gjør at avbildning av trekkende celler reagerer på motsatt gradienter av selvklebende versus løselig signaler. En. Glass dekkglass er passiviseres med biotinylert PLL-PEG. B.. Adhesive mønstre som inneholder fluorescerende streptavidin skrives på biotinylert overflaten enten som linjer ved hjelp av microcontact utskrift (b) eller prikker med dip penn litografi (b '). c.. D. Celler og en løselig kjemotiltrekkende gradient av 0-10% FBS er lastet inn microfluidic enheten. Etter cellene fester seg til overflaten, live celle migrasjon over RGD gradienter på streptavidin spor og i nærvær av FBS gradienter kan avbildes i kanalen som forbinder de to reservoarer.

Figur 2
Figur 2. Cell lim mønstre (streker og prikker) kan genereres med to forskjellige trykketeknikker en Fluorescent bilde av microcontact trykt streptavidin-AlexaFluor350 spor (Abs: 346 nm, Em: 442 nm, grå).. På PLL-PEG-belagte glass dekkglass. Den microcontract trykkemaske designet som linjer som var 100 mikrometer brede med 290 mikrometer senter-til-center plass. b.. Den gjennomsnittlige fluorescerende intensiteten av microcontact trykt streptavidin spor, som vist i en, fra fem forskjellige overflater som tverrsnitt fra topp til bunn. Den gjennomsnittlig bredde av sporet er 90 ± 6 um og gjennomsnittlig senter-til-senter avstand er 293 ± 2 um. C.. En lysfelt bilde av streptavidin-holdige prikker generert med dip penn litografi. Diameterne prikkene varierte 6-9 mikrometer med 15 mikrometer senter-til-senter mellomrom. Scale barer i en og c er 100 um.

Figur 3
Figur 3. Biotin-4-fluorescein gradient (0 ug / pl - 0,03 ug / ul). På et glassflater jevnt belagt med streptavidin Biotin-4-fluorescein og biotin-RGD ble lastet i enten reservoaret av microfluidic enheten (klebrig-Slide kjemotaksis 3D , Ibidi) som erkoblet sammen med en 1 mm lang kanal. Etter en 1 timers inkubasjon, ble enheten skylt med PBS og etterfylt med PBS. En. 60 mosaikk bildene ble tatt med et totalbilde lengde 3072 um og b fluorescensintensiteten ble målt over hele lengden av hele mosaikk. Lineære trendlinjer ble montert på fluorescensintensiteten å indikere den RGD gradient i kanalen.

Figur 4
Figur 4. Fluorescens intensiteten i en fluorescein gradient (0 - 1 uM uM) i microfluidic kanalen en umiddelbart etter oppsett (T = 0 t) og b etter en 16 timers inkubasjon PBS uten og med 1 uM fluorescein ble lastet fra venstre og høyre. reservoar av microfluidic enheten (klebrig-Slide chemotaxis 3D, Ibidi), henholdsvis. Microfluidic kanalen er 1 mm i lengde oger funnet i posisjon 50 til 1050 mikrometer. Gradient var stabil i minst 16 timer.

Figur 5
Figur 5. HeLa celle migrasjon i en MicroFluidics kammer (klebrig-Slide chemotaxis 3D, Ibidi) med motstående selvklebende gradient (immobilisert RGD på streptavidin spor) og løselig gradient (0-10% FBS). En. Et representativt bilde av celler i en MicroFluidics kammer med motstridende gradienter. Målestokk er 50 mikrometer. B Time-lapse bilder av en celle tatt med en epifluorescence mikroskop (Nikon Ti-E). Bildene ble tatt på 15 min intervaller i 20 timer og celle banen (blå linje) oppnådd via celle Tyngdepunktet posisjonering (ImageJ manuell sporing plugin). Målestokk er 50 mikrometer. C.. Cell bane fra bilder som er vist i b. Cell trajectories som migrerte mot høyere konsentrasjon av løselig FBS er vist i rødt (N spor = 36); celle baner som migrerte mot høyere konsentrasjoner av tilhenger RGD er vist i svart (N spor = 14). Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen, brukte vi en kommersielt tilgjengelig microfluidic enhet (klebrig-Slide chemotaxis 3D fra Ibidi) for å studere effektene av kjemisk modifiserte overflater og kjemotiltrekkende graderinger på celle migrasjon. Dette microfluidic oppsettet krever ikke flyt fordi gradienten er etablert ved diffusjon langs lengden av kanalen. Dette er viktig fordi strømning kunne differensielt påvirke langsomt migrerende celler slik som fibroblaster som danner stabile fokale adhesjoner og raske migrerende celler som de fleste leukocytter som danner små kontaktpunkter komplekser og synapser 26. Skjærspenning fra laminær kan påvirke stabiliteten i celleadhesjon til limet signaler og celle chemotaxis mot løselige pekepinner 27,28. Vi fant forskjeller i migrasjon atferd mellom langsom bevegelse HeLa celler og raske J774 celler og dermed viser at microfluidic oppsettet er aktuelt for både tilhenger og mindre tilhenger celletyper. Slike sammenligninger også revealed interessant forskjell mellom celletyper i vedheft og migrasjon svar på overflaten mønstre som inneholdt både lim signaler (RGD peptider eller fibronektin) og bunnstoff regioner (PEG områder).

Overflaten mønstre ble opprettet med microcontact utskrift 29 og dip-penn litografi 30,31. Microcontact utskrift er en enkel og relativt rask, reproduserbar mønster prosess. Imidlertid er utformingen og fabrikasjon av PDMS stempel, noe som oppnås ved fotolitografi, mer involvert og tidkrevende. Det introduserer også sine egne begrensninger ved at små funksjoner (<5 mikrometer) er vanskelig å oppnå, og avhenger av størrelsesforholdet av mønsteret. I korte trekk er microcontact utskrift ideell for store mønstre opp til hundrevis av mikron størrelse og i eksperimenter, hvor de samme mønstrene må skapt mange ganger. På den annen side, kan dip pin litografi brukes til å generere micron til nanoscaled mønstre. Det er mer egnet til utskrift prikkerenn linjer, kan selv om linjene være fabrikkert. Dip pin litografi gir større frihet i mønster design, så det er ikke behov for pre-fabrikerte masker, mestere eller frimerker. Imidlertid er hastigheten på mønster prosessen langsom, noe som gjør trykking av store områder tungvinte og tilgang til et spesialisert instrument er avgjørende. De to mønster metodene er relevante for betraktning fordi størrelsen og formen av selvklebende cue mønstre påvirke organiseringen og distribusjon av biomekaniske machineries som regulerer celle migrasjon 32,33. Tillegg er begrensning av kommersielle microfluidic enhet anvendes her at kanal lengde (1 uM) ikke kan endres og så en ikke kan kontrollere det maksimale steepness av klebende og løselig gradienter. Hvis brattere stigninger er nødvendig, vil man trenge å dikte opp en microfluidic enhet med en kortere kanal mellom de to reservoarene. En viktig fordel med protokollen som er beskrevet her er modulær design, slik at ulike surfaces, overflate kjemi, mønster tilnærminger og microfluidic enheter kan kombineres for et bredt spekter av levende celle bildebehandling eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen kommersielle interesser å utlevere.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner støtte fra den australske Forskningsrådet og National Health and Medical Research Council of Australia og liker også å takke Australian National Fabrication Facility for SU-8 master for microcontact utskrift. SHN støttes av departementet for høyere utdanning Malaysia og Universiti Sains Malaysia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass staining outfits Thomas Scientific 8542 E40 Coverslip rack
Oven Binder ED 53 series
Silicon wafer Silicon Quest 708-007 Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist Gersteltec Sarl
SU-8 developer Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%) SuSos AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) 1 mg/ml in PBS
Fluorescein Sigma 46955 1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249 1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein Invitrogen B-1370 0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD GenScript SC1208 0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red Invitrogen S-11346 1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D Ibidi 80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip Greiner Bio-One 739261
Vaseline Sigma 16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C Sigma 327204
Nano eNabler 10 μm cantilever BioForce SPT-S-C-10s
Image J software National Institute of Health rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin Fabrice Cordelières rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool Ibidi GmbH www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Tags

Bioteknologi mikrobiologi cellebiologi biokjemi molekylærbiologi biofysikk Cell migrasjon levende celle bildebehandling løselig og tilhenger gradienter microcontact utskrift dip penn litografi MicroFluidics RGD PEG biotin streptavidin chemotaxis kjemotiltrekkende bildebehandling
Opprette Lim og Løselig overgangar for Imaging Cell Migration med fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., … More

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., Tønnesen, L., Fairjones, Z., Gooding, J. J., Böcking, T., Gaus, K. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (74), e50310, doi:10.3791/50310 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter