Summary
라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.
Abstract
세포는 세포 외 기질 및 성장 요인과 같은 수용성 신호의 glycoproteins와 같은 접착제 신호의 높은 농도를 향해 감지하고 마이그레이션 할 수 있습니다. 여기, 우리는 라이브 세포 이미징와 호환되는 마이크로 유체 챔버에 접착제 및 가용성 신호의 반대 그라디언트를 만드는 방법을 설명합니다. 폴리-L-라이신 및 폴리에틸렌 글리콜 (PLL-PEG)의 공중 합체는 유리 coverslips을 패시베이션 및 분자 및 세포의 비 특정 흡착을 방지하기 위해 사용된다. 다음 microcontact 인쇄 또는 딥 펜 리소그래피는 접착제 단서로 biotinylated 펩타이드 아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 (RGD)에 포인트를 고정 역할을 passivated 표면에 streptavidin의 트랙을 만드는 데 사용됩니다. 마이크로 유체 장치는 수정 표면에 배치하고 streptavidin 트랙에 접착제 신호 (100 % 0 % RGD에 RGD)의 기울기를 만드는 데 사용됩니다. 마지막으로, 같은 마이크로 유체 장치는 chemoattractant suc의 기울기를 만드는 데 사용됩니다접착제 신호의 기울기의 반대 방향으로 용해 신호로 태아 소 혈청 (FBS)과 같은 H.
Introduction
감독 세포 이주는 많은 세포의 기본 특성이며, 배아 개발, 감염에 대한 방어와 상처 치유 등 많은 정상적인 생리 과정의 핵심 부분입니다. 또한, 세포 마이그레이션은 또한 혈관 질환, 종양 세포의 전이 및 만성 염증의 1,2 등 여러 질병에 눈에 잘 띄는 역할을합니다. 클래식 세포 마이그레이션 상태 동안 - 편광, 돌출부 확장, 부착, 힘 생성 및 후면 철회 형성은 - 일반적으로 3,4를 사용할 수 있습니다, 신호 통합 조정하는이 spatiotemporal 메커니즘의 해설이 더 도전했습니다.
세포 외 기질 (ECM)은 세포 접착을위한 기판으로 제공하며, 고유의 화학 5 물리적 여섯 다양성을 통해, 셀 탐색 7,8에 대한 방향 신호를 제공합니다. 이러한 접착제 단서 9, 수용성 요소 10-12 외에도 </ 저녁을 먹다> 같은 chemokines 및 성장 요인으로 할 수 chemoattractant 수용체 및 하류 motogenic 신호를 통해 직접 세포 이주를 유도. 현재, 그것은 참여와 유착 수용체 (즉, integrins) 또는 수용체 티로신 키나제의 (RTK)와 같은 chemoattractant 수용체를 통해 신호가 지배적인지 알 수 없습니다. 또한이 수용체 시스템의 계층 셀 타입 특정 있는지 여부 알려져 있습니다.
라이브 세포 현미경은 대량 assays에 액세스 할 수 있으며, 고정 13,14 및 가용성 단서 15 16의 그라디언트를 생성하기 위해 마이크로 유체 장치와 결합 될 수있는 정보의 풍부한을 제공합니다. 여기에 설명 된 방법은 쉽게 세포 생물학 연구실 (그림 1)으로 구현 될 수있는 세포 마이그레이션에 대한 이미지 분석을 만들 수있는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 챔버와 함께 표면 변형에 대한 간단하고 안정적인 일련의 단계를 사용합니다. 조립마이크로 유체 장치는 유리 17 비교하고 diffusible 분자의 기울기는 최소 16 시간을위한 안정적인 광학 특성이 있습니다. 이 시스템은 epifluorescence 및 고급 현미경 기술을 사용할 수 있습니다. 다른 chemotaxis 설정에서 18과는 달리,이 시스템은 천천히 마이그레이션, 자기편 세포를 녹음에 적합합니다. 중요한 시스템은 모듈 방식이며, 쉽게 대체 접착제 또는 용해 마이그레이션 단서 및 다양한 세포 유형의 시험의 소개가 있습니다.
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Protocol
1. PLL-PEG-비오틴과 유리 Coverslips의 패시베이션
이 단계는 그 세포가 microcontract 인쇄 (2 단계-3A) 또는 딥 펜 리소그래피 (단계 3B)로 만든 유리 coverslip의 특정 지역에 준수하고 마이그레이션 있도록 표면을 패시베이션하기 위해 설계되었습니다. 패시베이션를 들어, 폴리-L-라이신 (PLL) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공동 폴리머는 PEG 분자의 20 %가 비오틴 (PLL-PEG-비오틴)에 이식되는 사용됩니다.
- 유리 coverslips (18mm X 18mm), 100 % 에탄올의 랙에 잠수함을 청소하고 30 분에 sonicating 목욕탕에서 랙을 배치합니다. 공기 또는 질소의 흐름에 따라 유리 coverslips를 말린다.
- 다음 1 M NaOH의 30 분의 유리 coverslips를 sonicate. 이후 조심스럽게 1.5 L 밀리 Q H 2 O.로 가득 찬 비커에 랙을 찍어하여 유리 표면을 세정 린스 과정을 신선한 밀리 Q H 2 O 할 때마다 사용을 세 번 반복합니다. 에 유리 coverslips을 건조60 오븐 ° C.
- 깨끗한 유리의 장소 반은 부분적으로 H 2 O.로 가득 찬 24 잘 플레이트로 구성되어 습기 챔버에 개별적으로 coverslips 각 유리 coverslip에 PBS에서 PLL-PEG-비오틴 (1 MG / ML) 15 μl를 버려라. 나머지 깨끗한 유리 coverslips의 다른 반쪽을 가지고주의 깊게 샌드위치 PEG 솔루션을. 습기 챔버에서 1 시간 동안 coverslips 둡니다. PEG-코팅 표면을 스크랩 않고 부드럽게 거리에 서로 끼어 coverslips을 밀고 밀리 Q H 2 O.과 함께 씻어 물은 PEG-처리 측면에 감정 밀어해야합니다. 필요한 경우, 치료를 표면과 종이 타월에 공기 건조 유리 coverslips이 위쪽으로 향하고 있습니다. 자세한 사용까지 진공 건조기에서 유리 coverslips를 저장합니다.
2. Microcontact 인쇄를위한 우표의 제작
우리는 passivated 유리 coverslips에 패턴 streptavidin 트랙 두 프로세스를 설명합니다. 첫 번째, 마이크rocontact 인쇄는 일반적으로 PDMS 스탬프가 캐스팅되어있는 실리콘 마스터의 제조가 필요합니다. 우리의 경우, PDMS 스탬프의 패턴은 25 μm의 기능 높이 290 μm 센터 - 투 - 센터를 간격을두고 아르 100 μm 전체 선입니다. 다음, 우리는 적절한 실리콘 마스터 (단계 2.1-2.3)와 PDMS 스탬프 (단계 2.4) 제조하는 방법을 간단히 설명합니다. 그러나, 유리 coverslips에 단백질 패턴을 인쇄에 적합한 문헌 19-23에 설명 microcontact 인쇄에 대한 여러 프로토콜이 있습니다. 석사도 맞춤 제작과 상업 소스에서 구입하실 수 있습니다.
- MilliQ H 2 O.으로 철저하게 10 시간 20 분의 웨이퍼를 씻어. : 첫째, 피라냐 솔루션 (황산 산의 V와 30 % 과산화수소 3시 1분 V)에 잠복기하여 실리콘 웨이퍼 (4 "직경)을 청소 150 오븐에 웨이퍼를 건조 ° CO / N.
- 백퍼센트 이소 프로필 알코올에 이어 100 % 아세톤으로 깨끗하고 마른 실리콘 웨이퍼를 씻어. 다음40 초 동안 3,100 rpm으로 웨이퍼 위에 GM1070 SU-8 포토 레지스트 (Gersteltec SARL)의 스핀 코트 2 ML은 25 μm 두께의 레이어를 만들 수 있습니다. 샘플 후 95에서 추가로 5 분 뒤에 5 분 ° C.에 65 ° C에서 핫 플레이트에 구운합니다
- 원하는 패턴 (Quintel Q6000 마스크 aligner를 사용하는 예를 들어)와 photomask에서 60 초에 UV 빛 SU-8 포토 레지스트를 노출하고 제빵 과정은 2.2에서 설명 반복합니다. 그런 다음 샘플 100 % 이소 프로필 알코올에 헹구어 및 질소 흐름 하에서 건조 4 분에 대한 SU-8 개발자 (Gersteltec SARL)에 웨이퍼를 immersing에 의해 개발되었습니다. UV 빛에 노출되지 SU-8 포토 레지스트의 영역은 따라서 PDMS 스탬프의 역 패턴을 생성, 삭제됩니다.
- 다음 단계는 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 캐스팅하는 것입니다. 첫째, 철저하게 엘라스토머 성 예비 중합체의 10 부품 (Sylgard 184)와 경화 에이전트 한 부분을 (w / w) 섞는다. 진공 라인에 부착 된 건조기에서 가스를 제거하다에게, 혼합물을 공기 방울을 제거하려면1 시간에. 다음, 높이 약 1cm에 페트리 접시 안에 실리콘 마스터에 PDMS 엘라스토머을 부어 1 시간 70에서 오븐 ° C에서 마스터와 PDMS 혼합물을 치료. 마지막으로, PDMS 스탬프는 실리콘 마스터에서 제거하고 크기로 절단됩니다.
3. Passivated 유리 Coverslips로 패턴의 Streptavidin 또는 접착제 큐
유리 coverslips을 부동화 한 후, 단백질 패턴은 microcontact 인쇄 (단계 3A) 또는 딥 - 펜 리소그래피 (단계 3B)로 인쇄됩니다. 우리의 경우, streptavidin는 RGD의 기울기 (4 단계)을위한 기반을 형성 선,로 인쇄됩니다. 동일한 절차는 접착제 패턴을 만들 매트릭스 단백질을 인쇄에 사용할 수 있습니다.
표면 위에 분자의 패터닝을위한 microcontact 인쇄에 대한 대안 방법은 딥 펜 리소그래피입니다. 딥 펜 리소그래피에서 캔틸레버는 표면에 솔루션의 작은 볼륨을 전송하는 데 사용됩니다. cantilevers의 크기, V솔루션의 점성이 표면에 캔틸레버 시간에 문의 인쇄 챔버의 표면과 습도의 소수성는 인쇄 기능의 크기를 확인합니다. 이 방법의 장점은 주인과 우표를 조작 할 필요가 없습니다에 따라 다른 패턴이 각 실험 인쇄 할 수 있다는 것입니다. 단점은 주어진 패턴을 인쇄 딥 펜 리소그래피는 많은 실험실에서 사용하지 못할 수 있습니다 전문 악기를 요구하는 데 시간이 오래 걸립니다 있다는 것입니다. 우리가 사용하는 딥 펜 리소그래피 장비는 Bioforce Nanoscience에서 NanoeNabler했다. 여기, 우리가 SPT10 cantilevers를 사용하는, 직경 <10 μm이었다 작은 점을 출력한다.
3A. Microcontact 인쇄 (μCP) 기술
- 세척 및 PDMS 스탬프가 더 친수성 수 있도록, 1.5 시간에 대한 UV와 오존 (Bioforce Nanoscience에서 예를 들어, UV 오존 Procleaner)의 PDMS 스탬프의 패턴 측면을 취급합니다. 또한, 플라즈마를 사용하여같은 목적을 위해 짧은 시간에 청소기. 이 과정은 인쇄 과정을 개선 산화 PDMS 표면 24, 만듭니다.
- 오존 또는 플라즈마 치료, 장소와는 PDMS 스탬프에 10 μl streptavidin을 (PBS 1 MG / ML) 확산과 습윤 챔버 (예 : 부분적으로 채워진 6 잘 판으로, 단계 1.3 참조) 1 시간에 출발 후 즉시 . 트랙 형광 현미경으로 볼 수 있어야 경우, 해당 streptavidin-AlexaFluor350 같은 형광에 복합이다 streptavidin을 사용합니다.
- 조직 종이와 공기를 약 1 분 동안 우표를 건조와 도장에서 초과 streptavidin을 제거합니다. 살짝 PLL-PEG-비오틴 - 코팅 유리 coverslip에 도장을 누릅니다.
- 형광 streptavidin이 단계 3.a2에 사용 된 경우 epifluorescence 현미경을 사용하여 패턴을 검사합니다. 건조기에 인쇄 된 표면을 저장합니다.
3B. 수영 펜 리소그래피
- 먼저, 1 MG / ML streptavidin 또는 stre의 1 부분을 혼합글리세롤의 10 부분 (V / V)와 ptavidin - AlexaFluor350하고 캔틸레버에 혼합물의 5 μl를로드합니다. 딥 펜 리소그래피 장비의 작동 설명서에 설명 된대로 다음 인쇄 작업을 시작합니다. 약 5 μm의 스폿 사이즈를 줄이기 위해 인쇄 속도를 조정하고, 표면에 캔틸레버의 표면 또는 수직 거리에 캔틸레버의 시간을 문의하십시오. 그림 2C에 표시된 예에서, 점 행과 10-15 μm로 설정 열 분리와 라인에 인쇄되었습니다. 이 거리가 서로 병합에서 점을 방지하기 위해 충분하지만 대부분의 현미경 설정보기의 단일 필드에 여러 점의 볼 수 있습니다.
- 건조기에 인쇄 된 표면을 저장합니다.
4. Streptavidin-패턴 표면 위에 접착제 그라디언트를 만들기
우리는 streptavidin (그림 3) 또는 공동으로 코팅되어 유리 coverslips에 비오틴-RGD의 접착제 그라디언트를 만들passivated 유리 coverslips에 ntain streptavidin 패턴 (그림 5). 표면 기울기를 만들려면, 우리는 수동적 확산에 의해 안정적인 솔루션 기울기를 만들어 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 장치 (Ibidi에서 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D이라고도 함) 사용됩니다. streptavidin 구속력이 사이트에 대해 경쟁하기 위해, 우리는 (그림 1 참조) RGD에 복합 아니었다 비오틴-RGD과 비오틴의 두 반대 그라디언트를 고용.
- 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D 장치의 끈적한면에 streptavidin - 코팅 또는 패턴 유리 coverslips을 준수합니다. 몇 시간에 대한 누설이없는 것을 확인하려면, 장치의 가장자리는 따뜻하게 바셀린의 얇은 층으로와 파라핀 왁스의 1 부분 (w / w)에 바세린 1 부분의 혼합물의 두 번째 층으로 밀봉되어 있습니다.
- 채널 6 μl PBS로 장치의 채널을 입력합니다. 그런 다음 PBS 70 & m에서 0.03 μg / μl 비오틴-4-fluorescein의 70 μl로 두 저수지를 작성U, 0.03 μg의 L / μl 비오틴-RGD 각각 PBS 인치 1 시간에 어둠 속에서 RT의 샘플을 품다.
- 비오틴 솔루션을 제거하고 여전히 PBS로 두 번 마이크로 유체 장치에 부착 동안주의 깊게 표면을 씻어. 접착제 그라디언트의 방향을 표시하고 필요한 경우에 대해 4 ° C에서 PBS로 가득 장치를 저장하지만 장치가 밖으로 건조하지 않도록. 필요한 경우, 형광 현미경으로 접착제 기울기를 분석 할 수 있습니다.
5. 라이브 셀 이미징에 대한 Fluorophores과 세포의 Labelling
세포는 형광 현미경으로 세포 추적을 지원 형광 염료로 표시됩니다. 일반 프로브는 형광 세포 기관 마커, 세포 핵을 레이블 등 Syto 64 레드입니다. 이렇게하려면 셀을 먼저 한 다음 45 분을위한 문화 미디어 1 μM Syto 64 레드와 incubated, PBS로 세 번 씻어 마지막으로 PBS를 추가로 세 번 씻어 수 있습니다. 세포가 아니어야합니다오랜 기간 동안 PBS에 보관.
셀 추적의 대체 염료는 세포질에 얼룩 CellTracker 시리즈이며, 세포 마이그레이션 및 부서 동안 유지됩니다. 형광 융합 단백질과 세포의 Transfection는 마이그레이션하는 동안 관심의 단백질의 subcellular 배포판을 기록 할 특히 유용합니다. 그러나, 유기 염료보다 일반적으로 사진 표백제를 빠르게 형광 단백질은 장기 관찰 있도록 할 수없는 경우가 있습니다.
6. Microfluidics 장치로 가용성식이 그라데이션으로 셀의로드
- 동일한 전화 번호의 두 튜브로 휘황 표시 셀 및 분할을 계산합니다. 이러한 10% 태아 소 혈청 (FBS)과 낮은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)로 chemoattractant를 포함하는 미디어와 셀 중 하나 관을 씻고 resuspend. 세탁 및 chemoattractant, 0퍼센트 FBS와 즉 DMEM없이 미디어 세포의 다른 튜브를 resuspend. 최종 농도각 튜브에 세포의 5 × 10 5 세포 / ML해야합니다.
- 마이크로 유체 장치 (단계 4.3에서)에서 모든 솔루션을 제거하고 (7 단계 참조) 현미경 스테이지에 배치합니다. 한 저수지와 다른에 HELA 세포의 70 μl (10 % FBS DMEM 5 × 10 5 세포 / ML)로 세포의 70 μl를 (0 % FBS DMEM 5 × 10 5 세포 / ML)로드합니다. 대충 증발을 방지하기 위해 저수지 위에 테이프를 배치합니다. 표면에 세포가 이전 영상에 대한 사전 incubated 경우,이 세포는 그라디언트없이 성장 미디어 장치에로드하는 것이 좋습니다. 장치는 다음 현미경 스테이지에 배치하고 미디어는 다른에서 10 % FBS와 하나 저수지와 DMEM에 FBS가없는 그라디언트 미디어 즉 DMEM로 대체됩니다.
7. 세포 이미징 및 데이터 분석 라이브
- 현미경 (니콘 티-E)에 전환하고 실험을 시작하기 전에 적어도 1 시간을 무대를 따뜻하게.
- 확인이 micr의 채널ofluidic 장치가 시야에 있으며 셀이 초점에 있습니다. 이러한 노출 시간과 형광 필터, 셀 및 트랙을 캡처 시야 및 형광의 이미지 시퀀스뿐만 아니라 시간 포인트 및 녹화 길이 (예 : 16 시간마다 15 분) 등의 이미지 수집 매개 변수를 선택합니다.
- 이러한 ImageJ 수동 추적 또는 Ibidi Chemotaxis 및 마이그레이션 도구 적절한 소프트웨어와 데이터를 분석합니다.
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Representative Results
셀 철새 신호를 25 통합 방법을 이해하기 위해, 우리는 경쟁 접착제 및 가용성 그라디언트 (그림 1) 환경에서 마이그레이션하는 형광 현미경으로 이미지 셀에 방법을 개발했습니다. 형광 streptavidin과 biotinylated RGD를 포함 접착제 트랙이 microcontact 인쇄 트랙과 딥 펜 리소그래피 (그림 2)로 만들어졌습니다. 성공적인 microcontact 인쇄는 접착제 트랙과 안티 오염 지역 명확하게 (그림 2B) 구별 할 수있는 트랙에서 형광 강도의 라인 프로파일로 표시됩니다. 딥 펜 리소그래피로 인쇄 점 반올림, 성공적인 인쇄 프로세스를 나타냅니다 모양 찢어 지지도 않아요 나타납니다. 표면 화학 및 습도는 인쇄 프로세스의 결과에 영향을 미칩니다. 일반적으로, 더 소수성 표면은, 인쇄 결과수록 좋습니다.
접착제 신호의 기울기인쇄 트랙에 비오틴-4-fluorescein를로드하고 마이크로 유체 챔버 (그림 3)의 맞은 편에 비오틴-RGD하여 간단한 microfluidics 장치와 함께 만들어졌습니다. 두 분자가 유리 표면에 streptavidin 트랙으로 경쟁력 바인딩 때문에, RGD 리간드의 고정화 기울기가 생성됩니다. 비오틴 / 비오틴-RGD 솔루션을 제거한 후, 동일한 챔버는 최소 16 시간 (그림 4)의 마이크로 유체 채널 내에서 안정적 용해 그라디언트를 소개하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 FBS가 사용하는 chemoattractant 그라디언트있는 챔버에 HELA 세포를 도입했습니다. 낮은 밀도에서 헬러 세포는 우선적으로 준수하고 streptavidin / RGD 트랙 (N 세포가 = 50)에 마이그레이션 및 안티 - 오염 PEG 지역 (N 세포가 = 19) 피했다. 개별 셀의 위치는 16 시간 이상 기록하고 셀 추적 소프트웨어로 분석되었다. 실험에 위치 접착제 및 solu경 그라디언트는 (그림 5) 서로 반대되어 개별 셀의 궤도 더 헬러 세포가 chemoattractant (그림 5C, N 흔적 = 36 붉은 흔적)의 원인으로 마이그레이션 것으로 나타났다 자기편 RGD보다 높은 농도 (검은 색에 대한보다 그림 5C, N 흔적 = 14 흔적). 에 대해 (검은 흔적) 또는 FBS 그라디언트 (각 궤도의 평균 변위의 x-구성 요소)의 (적색 흔적) 방향으로 마이그레이션 세포가 0.1700 ± 0.1172와 0.2278 ± 0.1280, 각각 (P <0.0001, 학생이라고 평균 거리 P> 0.05, 학생 t-테스트), 검은 흔적 (56.18 ± 32.27 μm)와 붉은 흔적 (72.86 ± 45.05 μm 사이의 평균 변위에 통계적으로 의미있는 차이가 없었다 t-테스트) 있지만. 헬러 전지는 17.47의 평균 속도 ± 접착제의 두 그라디언트의 존재에 4.72 μm / 시간으로 마이그레이션큐 (예 : RGD)과 수용성 큐 (즉, FBS). 데이터는 따라서 세포 접착제 트랙에 고유 마이그레이션 속도를 유지하면서 헬러 세포에 대해 FBS 기울기가 이전의 방향을 결정하는 것이 좋습니다.
우리는 또한 대 식세포 세포주 J774의 마이그레이션을 평가했습니다. 접착제 및 가용성 그라디언트의 부재에서 이러한 세포는 헬러 세포보다 훨씬 빠른 속도 (38.55 ± 17.88 μm / 시간) (16.47 ± 4.28 μm / 시간)에 있지만, J774 세포의 변화 방향 즉, 적은 persistency (0.059의 방향을 ± 0.091로 마이그레이션 ), 더 자주 microcontact 인쇄 fibronectin 트랙에 HELA 세포 (0.57 ± 0.12)보다 길이를 추적하는 변위의 비율로 측정. J774 세포는 또한 헬러 세포보다 의존 문의 이내의 거리에 있습니다. J774 세포의 변위는 fibronectin 트랙 (42.95 ± 39.90 μm)에 비해 PEG 영역 (102.20 ± 54.73 μm)에서 높은했습니다. 또한, J774 세포에게의중간 엽에서 amoeboid로 마이그레이션 자신의 메커니즘을 변경하여 다른 표면 화학에 적응하기 위해 ppeared. 그들은 헬러 세포에있는 한 결론적으로, 접착제 신호는 J774 셀에 중요하지 않습니다. 두 세포 유형은 우선적으로 용해 큐의 방향으로 마이그레이션.
1 그림. 이전 셀의 이미지는 접착제 대 용해 신호의 반대 기울기에 응답 할 수있는 마이크로 유체 설치의 제조 공정의 개략도.가. 유리 coverslips이 함께 passivated 아르 biotinylated PLL-PEG. 나. 형광 streptavidin을 포함하는 접착제 패턴은 biotinylated에 인쇄됩니다 표면 중 하나로 수영 펜 리소그래피를 사용하여 microcontact 인쇄를 사용하여 라인 (B) 또는 점 (B '). 다. 라. 전지를 통해 생성되어 0~10%의 가용성 chemoattractant 기울기는 FBS는 마이크로 유체 장치에로드됩니다. 세포 표면을 준수 후 streptavidin 트랙에 RGD 그라데이션으로 셀 마이그레이션 살고 FBS 그라디언트의 면전에서 두 저수지를 연결하는 채널에 이미징 할 수 있습니다.
그림 2. 세포 접착제 패턴 (라인과 점)은 두 개의 서로 다른 인쇄 기술을 생성 할 수 있습니다 microcontact의 형광 이미지가 streptavidin-AlexaFluor350 트랙을 (ABS : 346 nm의, 엠 : 442 nm의, 회색)으로 출력한다.. PLL-PEG-코팅 유리 coverslips에. microcontract 인쇄 마스크가 290 μm 센터 - 투 - CE 100 μm 폭있었습니다 선으로 설계되었습니다nter 공간. 나. microcontact의 평균 형광 강도는 위에서 아래로 크로스 섹션으로 5 개의 표면에서와 같은에 표시 streptavidin 트랙을, 인쇄. 트랙의 평균 폭이 90 ± 6 μm이며, 평균 중심으로 중심 간격은 293입니다 ± 2 μm. 다. 딥 펜 리소그래피를 생성 streptavidin 함유 점의 brightfield 이미지입니다. 15 μm 센터 - 투 - 센터 공간과 9 μm - 점의 직경은 6에서 원거리. 규모의 바 C 100 μm입니다.
그림 3. 비오틴-4-fluorescein 기울기 (0 μg / μl - 0.03 μg / μl). 균일 streptavidin으로 코팅 유리 표면에 비오틴-4-fluorescein과 비오틴-RGD는 마이크로 유체 장치 (끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D 중 하나 저수지에로드 된 , Ibidi)입니다 그1mm 긴 채널에 의해 연결되어 있습니다. 1 시간의 배양 후, 장치는 PBS로 헹구어되었으며, PBS로 리필.가. 60 모자이크 이미지는 형광 강도가 전체 모자이크의 길이에 걸쳐 측정 된 총 이미지 길이 3,072 μm와 b로 촬영되었다. 선형 추세 라인 채널에 RGD 기울기를 표시하는 형광 강도에 장착되었다.
4 그림. fluorescein 기울기 (0 μM - 1 μM)의 형광 강도 마이크로 유체 채널에 즉시 16 시간의 배양 후 설정 (T = 0 시간)와 b PBS 후이없는 1 μM과 fluorescein은 왼쪽과 오른쪽에서로드되었습니다. 마이크로 유체 장치 (끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D, Ibidi), 각각의 저수지. 마이크로 유체 채널 1의 길이 mm 있으며위치 50 1050 μm을에서 발견됩니다. 기울기는 최소 16 시간에 안정적이었다.
그림 5. 접착제 기울기 (streptavidin 트랙에 RGD 고정화)과 수용성 그라디언트 (0-10 % FBS)을 반대와 microfluidics 챔버 (끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D, Ibidi)에 HELA 세포 이주.가. microfluidics 챔버에서 셀의 대표 이미지와 그라디언트를 반대. 스케일 바는 50 μm이다. epifluorescence 현미경 (니콘 티-E)에서 찍은 셀의 B 시간 경과 이미지. 이미지는 20 시간과 셀 중심 위치 (ImageJ 수동 추적 플러그인)을 통해 얻은 세포 궤도 (파란색 선) 15 분 간격으로 촬영 된 것입니다. 스케일 바는 50 μm이다. 다. 셀 궤도 이미지에서 B와 같이. 셀 TR수용성 FBS의 높은 농도를 향해 마이그레이션 ajectories은 빨간색 (N 트레이스는 = 36)로 표시됩니다, 점착성의 RGD보다 높은 농도를 향해 마이그레이션 셀 궤도은 검은 색 (N 트레이스 = 14)로 표시됩니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 세포 이주에 대한 화학적으로 수정 표면과 chemoattractant 그라디언트의 효과를 연구하기 (Ibidi에서 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D) 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 장치를 사용했습니다. 그라디언트는 채널의 길이를 따라 확산에 의해 설립되기 때문에 이러한 마이크로 유체 설정은 흐름을 필요로하지 않습니다. 흐름이 differentially 등 안정적인 초점 adhesions 작은 초점 단지와 시냅스 26을 형성 대부분의 백혈구와 같은 빠른 마이그레이션 세포를 형성 섬유 아세포로 천천히 마이그레이션 세포에 영향을 미칠 수 있기 때문에 중요합니다. 층류에서 전단 응력은 수용성 신호 27,28에 대한 접착제 신호와 세포 chemotaxis에 세포 접착의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 느린 이동 헬러 세포함으로써 마이크로 유체 설치가 모두 자기편 덜 자기편 세포 유형에 대한 적용을 보여 빠르게 움직이는 J774 세포 사이의 마이그레이션 동작의 차이를 발견했다. 이러한 비교는 reveale접착제 신호 (RGD 펩티드 또는 fibronectin), 안티 오염 지역 (PEG 영역)을 모두 포함 표면 패턴 접착 및 마이그레이션 응답 세포 유형 간의 D 흥미로운 차이.
표면 패턴은 microcontact 인쇄 29 딥 - 펜 리소그래피 30,31으로 만들어졌습니다. Microcontact 인쇄는 간단하고 비교적 빠르고, 재현 패터닝 프로세스입니다. 그러나, 석판 술에 의해 달성된다 PDMS 스탬프,의 설계 및 제조 더 참여하여 소모 시간입니다. 그것은 또한 작은 기능 (<5 μm) 패턴의 가로 세로 비율에 달성하고 따라하기가 어렵에서 자신의 한계를 소개합니다. 간단히 말하자면, microcontact 인쇄는 마이크론 크기의 수백과 동일한 패턴이 여러 번 생성 할 필요가 실험에 최대 대형 패턴에 이상적입니다. 한편, 수영 핀 리소그래피는 nanoscaled 패턴 마이크론를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 인쇄 점에 더 적합합니다라인보다, 비록 줄이 제조 될 수있다. 사전 가공 마스크, 석사 또는 우표에 대한 필요가 없습니다으로 수영 핀 리소그래피는, 패턴 디자인의 큰 자유를 갖게. 그러나, 패터닝 과정의 속도는 복잡하고 전문 악기에 대한 액세스 넓은 영역의 인쇄 중요하고, 속도가 느린 것입니다. 크기와 접착제 큐 패턴의 모양 세포 마이그레이션 32,33을 조절 biomechanical 기계의 조직 및 배포에 영향을 미치는 때문에 두 패터닝 방법은 고려와 관련이 있습니다. 또한, 여기에 사용 된 상용 마이크로 유체 장치의 제한은 채널 길이 (1 μm)를 변경할 수 없습니다 그래서 하나가 접착제 및 가용성 그라디언트의 최대기구를 제어 할 수 있다는 것입니다. 가파른 기울기가 필요한 경우, 하나는 두 저수지 사이에 짧은 채널과 마이크로 유체 장치를 조작해야합니다. 여기에 설명 된 프로토콜의 주요 장점은 모듈 형 디자인입니다 다른 스와 그래서rfaces, 표면 화학, 패턴 접근 방식과 마이크로 유체 장치는 라이브 셀 이미징 실험의 다양한 결합 할 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할 상업적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 호주 연구 협의회 및 국민 건강과 호주의 의학 연구 협의회에서 기금을 인정하고 또한 감사드립니다 microcontact 인쇄 SU-8 마스터를위한 호주 국립 제조 시설. SHN는 고등 교육 말레이시아 Universiti Sains 말레이시아의 교육부에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A.
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A.
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A.
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
