Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Published: April 4, 2013 doi: 10.3791/50310
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 1
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

Summary

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Abstract

Zellen können zu erfassen und zu höheren Konzentrationen an Klebstoff Zeitgeber wie die Glycoproteine ​​der extrazellulären Matrix und löslichen Cues wie Wachstumsfaktoren migrieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur gegenüberliegenden Gradienten aus Klebstoff und löslichen Signale in einem Mikrofluidik-Kammer, die mit lebenden Zellen zu schaffen. Ein Copolymer aus Poly-L-Lysin und Polyethylenglykol (PEG-PLL) wird eingesetzt, um Glasdeckgläser passivieren und verhindern eine unspezifische Adsorption von Biomolekülen und Zellen. Weiter, Mikrokontaktdrucken oder Dip-Pen-Lithographie verwendet werden, um Spuren von Streptavidin an den passivierten Oberflächen zu schaffen, um so Verankerungspunkte für das biotinylierte Peptid Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) als klebende Cue dienen. Mikrofluidische Vorrichtung wird auf die modifizierte Oberfläche platziert und verwendet, um den Gradienten des Klebstoffs Queues (100% bis 0% RGD RGD) an den Streptavidin Spuren zu erzeugen. Schließlich wird der gleichen mikrofluidischen Vorrichtung verwendet, um einen Gradienten eines chemoattraktiven erfolg erstellenh wie fötalem Rinderserum (FBS), wie die lösliche Cue in der entgegengesetzten Richtung des Gradienten aus Klebstoff Signale.

Introduction

Regie Zellwanderung ist eine grundlegende Eigenschaft von vielen Zellen und ist ein wichtiger Aspekt von vielen physiologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Infektabwehr und Wundheilung. Zusätzlich Zellwanderung spielt auch eine wichtige Rolle bei vielen Krankheiten wie Gefäßerkrankung, Tumorzellenmetastase und chronischen Entzündungen 1,2. Während die klassischen Zuständen der Zellwanderung - Polarisation Vorsprung Erweiterung, Bildung Haftung, Krafterzeugung und hinten Rückzug - in der Regel 3,4 angenommen werden, hat die Aufklärung der raumzeitlichen Mechanismen, durch die Signal-Integration koordiniert wurde schwieriger.

Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient als Substrat für die Zelladhäsion und durch inhärente chemische und physikalische 5 6 Vielfalt stellt Richtungshinweise für Zellennavigationsmodus 7,8. Neben diesen Klebstoff Cues 9, lösliche Faktoren 10-12 </ Sup>, wie Chemokine und Wachstumsfaktoren können induzieren gerichteten Zellmigration durch chemoattraktive Rezeptoren und deren stromabwärts motogenic Signalisierung. Derzeit ist es nicht bekannt, ob Eingriff und Signalisierung durch Adhäsionsrezeptoren (dh Integrine) oder chemoattraktive Rezeptoren, wie Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), dominant sind. Auch ist es nicht bekannt, ob Hierarchien von Rezeptor-Systeme Zelltyp spezifisch sind.

Live-Mikroskopie bietet eine Fülle von Informationen, die nicht zugänglich ist lose Assays und kann mit mikrofluidischen Bauteilen kombiniert werden, um Steigungen von immobilisierten 13,14 und löslichen Cues 15 16 zu generieren. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Reihe von einfachen und bewährten Schritte zur Oberflächenmodifizierung in Verbindung mit einem handelsüblichen Mikrofluidik-Kammer, eine Abbildungsanordnung Assay für Zellmigration, dass leicht in einer Zelle Biologielaboranten (Abbildung 1) implementiert werden erstellen. Die zusammengebauteMikrofluidikvorrichtung besitzt optische Eigenschaften, die vergleichbar mit Glas und 17 sind die Steigungen der diffundierbare Moleküle sind für mindestens 16 Stunden stabil. Das System kann für Epifluoreszenz-Mikroskopie und fortschrittliche Techniken verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Chemotaxis Setups 18, eignet sich dieses System zum Aufzeichnen langsam wandernden, adhärenten Zellen. Wichtig ist, ist das System modular aufgebaut und leicht ermöglicht die Einführung alternativer Kleber oder lösliche Migration Signale und Prüfung verschiedener Zelltypen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ein. Passivierung von Deckgläsern mit PLL-PEG-Biotin

Dieser Schritt ist für die Oberfläche zu passivieren, so dass Zellen anhaften und auf spezifische Bereiche auf dem Deckglas, das mit microcontract Drucken (Schritt 2-3a) oder Dip-Pen-Lithographie (Schritt 3b) angelegt werden migrieren. Zur Passivierung ist ein Copolymer aus Poly-L-Lysin (PLL) und Polyethylenglykol (PEG) eingesetzt, bei denen 20% der PEG-Moleküle an Biotin (PLL-PEG-Biotin) gepfropft werden.

  1. Um Deckgläschen (18 mm x 18 mm), tauchen sie in ein Rack in 100% Ethanol reinigen und legen die Zahnstange in einer Ultraschallbehandlung Bad für 30 min. Trocknen Sie die Deckgläschen in der Luft oder unter einem Strom von Stickstoff.
  2. Anschließend beschallen die Deckgläser für 30 min in 1 M NaOH. Danach spülen Sie die Glasoberflächen durch vorsichtiges Eintauchen des Rack in einem Becher mit 1,5 l Milli-Q H 2 O. gefüllt Wiederholen Sie den Spülvorgang dreimal mit frischem Milli-Q H 2 O jeder Zeit. Trocknen Sie die Deckgläschen ineinen Ofen bei 60 ° C.
  3. Die Hälfte der sauberen Deckgläschen einzeln in einer feuchten Kammer, die aus einer 24-Well-Platte teilweise mit H 2 O. gefüllt wird Drop 15 ul PLL-PEG-Biotin (1 mg / ml) in PBS für jedes Deckglas. Nehmen Sie die andere Hälfte der verbleibenden sauber Deckgläschen und sorgfältig Sandwich die PEG-Lösung. Lassen Sie die Deckgläser für 1 Stunde in der feuchten Kammer. Schieben der sandwichartig Deckgläser sanft voneinander weg ohne Kratzen der PEG-beschichteten Oberfläche und spülen sie mit Milli-Q-H 2 O. Das Wasser sollte abrutschen leicht auf der PEG-behandelten Seite. Falls erforderlich, zugewandten lufttrockenem die Deckgläser auf Papierhandtuch mit der behandelten Oberfläche nach oben. Bewahren Sie die Deckgläschen in einem Vakuumexsikkator bis zur weiteren Verwendung.

2. Herstellung von Briefmarken für Mikrokontaktdrucken

Wir beschreiben zwei Prozesse Muster Streptavidin Tracks auf der passivierten Deckgläschen. Das erste, microcontact Druck, typischerweise erfordert die Herstellung eines Silicium-Master von dem ein PDMS-Stempel gegossen wird. In unserem Fall, sind die Muster auf dem PDMS-Stempel 100 um-breite Linien, die um 290 Mitte-zu-Mitte voneinander beabstandet sind mit einer Funktion Höhe von 25 um. Nachfolgend beschreiben wir kurz wie eine geeignete Silicium-Master (Schritt 2.1-2.3) und PDMS-Stempel (Schritt 2.4) herzustellen. Es gibt jedoch mehrere Protokolle für Mikrokontaktdrucken in der Literatur 19-23, die geeignet zum Drucken Proteinmuster auf Deckgläsern sind beschrieben. Masters können auch maßgeschneiderte und gekauft aus kommerziellen Quellen.

  1. Zuerst reinigen Siliziumwafer (4 "Durchmesser) durch Inkubation in Piranhalösung (3:1 v: v von Schwefelsäure und 30% Wasserstoffperoxid). Für 20 min Spülen des Wafers 10 mal gründlich mit MilliQ H 2 O. Trocknen der Wafer in einem Ofen bei 150 ° CO / N.
  2. Spülen der sauberen und getrockneten Siliziumwafers mit 100% Aceton, um 100% Isopropylalkohol gefolgt. NächsteSpin-Coat 2 ml GM1070 SU-8 Fotolack (Gersteltec Sarl) auf den Wafer bei 3.100 Umdrehungen pro Minute für 40 Sek. eine 25 um dicke Schicht. Die Probe wird dann auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 5 min gebacken um weitere 5 min bei 95 ° C.
  3. Freilegen SU-8 Photoresist mit UV-Licht für 60 Sekunden unter einer Photomaske mit dem gewünschten Muster (zum Beispiel unter Verwendung eines Quintel Q6000 Maskaligner) und wiederholen der Backvorgang in 2,2 beschreiben. Anschließend wird die Probe durch Eintauchen des Wafers in SU-8 Entwicklers (Gersteltec Sarl) für 4 min, 100% Isopropylalkohol gespült und getrocknet unter Stickstoffstrom entwickelt. Die Fläche des SU-8 Photoresist, die nicht dem UV-Licht ausgesetzt war wird somit entfernt, wodurch die inversen Muster der PDMS-Stempel.
  4. Der nächste Schritt ist es, ein PDMS-Stempel von dem Silizium-Master gegossen. Zuerst wird gründlich gemischt 1 Teil (w / w) des Härtungsmittels mit 10 Teilen Elastomer Prepolymer (Sylgard 184). Um mögliche Luftblasen zu entfernen, entgasen die Mischung in einem Exsikkator an eine Saugleitungfür 1 Stunde. Anschließend gießen PDMS Elastomer auf die Silizium-Master in einer Petrischale bis etwa 1 cm in der Höhe und Heilung der Master-und PDMS-Gemisch in einem Ofen bei 70 ° C für 1 Stunde. Schließlich wird die PDMS-Stempel aus dem Silizium-Master entfernt und auf Maß geschnitten.

3. Patterning Streptavidin oder Adhesive Cues auf Passivated Deckgläschen

Nach Passivierung Deckgläschen werden Proteinmuster mit Mikrokontaktdrucken (Step 3a) oder Dip-Pen-Lithographie (Step 3b) gedruckt. In unserem Fall wird Streptavidin als Linien, die die Grundlage für RGD Gradienten (Schritt 4) bilden gedruckt. Das gleiche Verfahren kann auch zum Bedrucken von Matrixproteinen an Klebemuster erstellen verwendet werden.

Eine alternative Methode zur Mikrokontaktdruck für die Strukturierung von Biomolekülen an Oberflächen ist Dip-Pen-Lithographie. In Dip-Pen-Lithographie ist ein Ausleger verwendet, um ein kleines Volumen der Lösung auf die Oberfläche übertragen. Die Größe der Ausleger, viskosität der Lösung, Kontaktzeit des Auslegers auf der Oberfläche, zu bestimmen Hydrophobie der Oberfläche und Luftfeuchtigkeit in der Druckkammer die Größe der gedruckten Features. Der Vorteil dieser Methode ist, dass verschiedene Muster für jedes Experiment gedruckt werden kann, da es keine Notwendigkeit, Mastern und Stempel herzustellen. Der Nachteil ist, dass es länger dauert, bis ein bestimmtes Muster zu drucken und Dip-Pen-Lithographie erfordert einen Spezialisten Instrument, das nicht sein kann in vielen Labors zur Verfügung. Der Dip-Pen-Lithographie Instrument, das wir verwendet wurde, war die NanoeNabler von Bioforce Nanowissenschaften. Hier druckten wir kleine Punkte, die <10 um im Durchmesser waren, für die wir SPT10 Cantilever verwendet.

3a. Mikrokontaktdrucken (mCP) Technik

  1. Zu reinigen und um das PDMS-Stempel mehrere hydrophile, behandeln des gemusterten Seite der PDMS-Stempel in einer UV-und Ozon (beispielsweise UV-Ozon aus Procleaner Bioforce Nanoscience) für 1,5 Stunden. Alternativ können Sie einen Plasma-Reiniger für eine kürzere Zeit für den gleichen Zweck. Dieser Prozess erzeugt eine oxidierte PDMS Oberfläche 24, die den Druckvorgang verbessert.
  2. Unmittelbar nach der Ozon-oder Plasmabehandlung, Ort und ausgebreitet 10 ul Streptavidin (1 mg / ml in PBS) auf die PDMS-Stempel und lassen für 1 Stunde in einer feuchten Kammer (z. B. eine teilweise gefüllte 6-Well-Platte, siehe Schritt 1.3) . Wenn Bahnen müssen unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar, verwenden Streptavidin, die an ein Fluorophor konjugiert wie Streptavidin-AlexaFluor350 ist.
  3. Entfernen Sie überschüssiges Streptavidin aus dem Stempel mit Seidenpapier und Luft trocknen den Stempel für ca. 1 min. Drücken Sie den Stempel auf die PLL-PEG-Biotin-beschichteten Deckglas.
  4. Wenn fluoreszierenden Streptavidin in Schritt 3.a2 verwendet wurde, überprüfen Sie die Muster mit unter einem Epifluoreszenzmikroskop. Bewahren bedruckten Oberflächen in einem Exsikkator.

3b. Dip Pen Lithography

  1. Zuerst mischen Sie 1 Teil 1 mg / ml Streptavidin oder streptavidin-AlexaFluor350 mit 10 Teilen Glycerin (v / v) und laden Sie 5 ul der Mischung auf dem Ausleger. Dann beginnen die Druckverfahren wie in der Bedienungsanleitung des Dip-Pen-Lithographie Instruments beschrieben. Um die Punktgröße zu verringern etwa 5 um, einzustellen Druckgeschwindigkeit Kontaktzeit des Auslegers auf der Oberfläche oder vertikale Abstand des Auslegers an die Oberfläche. In dem Beispiel in Abbildung 2c gezeigt, wurden Punkte in einer Linie mit Zeile und Spalte Trennung auf 10-15 um gedruckt. Dieser Abstand reicht aus, um Punkte von ineinander übergehen zu verhindern, sondern ermöglicht die Anzeige von mehreren Punkten in einem einzigen Blickfeld mit den meisten Mikroskopeinstellungen.
  2. Bewahren bedruckten Oberflächen in einem Exsikkator.

4. Erstellen Adhesive Farbverläufe auf Streptavidin-pattern Surfaces

Wir erzeugen Klebstoff Gradienten auf Deckgläschen, die mit Streptavidin (Abbildung 3) oder Co beschichtet sind Biotin-RGDntain Streptavidin Muster auf passiviert Deckgläschen (Abbildung 5). Eine Fläche Gradienten erzeugen, verwendeten wir ein handelsübliches Mikrofluidvorrichtung (Slide genannt klebrig-Chemotaxis 3D von Ibidi), die eine stabile Lösung Gradienten durch passive Diffusion erzeugt. Um für Streptavidin Bindungsstellen konkurrieren, beschäftigten wir zwei gegenüberliegenden Gradienten von Biotin-RGD und Biotin, das war nicht konjugiert RGD (siehe Abbildung 1).

  1. Kleben Sie die Streptavidin-beschichteten oder strukturierten Deckgläschen auf die Klebeseite des sticky-Slide Chemotaxis 3D-Gerät. Um sicherzustellen, daß es keine Leckage für mehrere Stunden, werden die Kanten der Vorrichtung mit einer dünnen Schicht aus Vaseline erwärmt und mit einer zweiten Schicht aus einem Gemisch aus 1 Teil bis 1 Teil Vaseline aus Paraffinwachs (w / w) abgedichtet ist.
  2. Füllen Sie den Kanal des Gerätes mit 6 ul PBS in den Kanal. Dann füllen Sie die beiden Reservoire mit 70 ul von 0,03 ug / ul Biotin-4-Fluorescein in PBS und 70 & mu; l von 0,03 ug / ul Biotin-RGD in PBS, jeweils. Inkubieren der Proben bei RT im Dunkeln für 1 Stunde.
  3. Entfernen Sie die Biotin-Lösungen und sorgfältig spülen die Oberfläche, während noch der mikrofluidischen Vorrichtung zweimal mit PBS angebracht. Markieren Sie die Richtung des Klebers Steigung und, wenn nötig, speichern Sie das Gerät mit PBS bei 4 ° C gefüllt für, sondern sicherzustellen, dass das Gerät nicht austrocknen. Falls erforderlich, den Klebstoff zu analysieren Gradienten mit einem Fluoreszenzmikroskop.

5. Kennzeichnung von Zellen mit Farbstoffen für das Live Cell Imaging

Zellen werden mit fluoreszierenden Farbstoffen, die Zellen-Tracking unter dem Fluoreszenzmikroskop unterstützen beschriftet. Gemeinsamen Sonden fluoreszierend sind Organelle Marker, wie Syto 64 Red, die den Zellkern markiert. Dazu werden die Zellen zunächst dreimal mit PBS gewaschen, dann mit 1 uM Syto 64 Rot in Kulturmedien für 45 min inkubiert und schließlich gewaschen noch dreimal mit PBS. Bitte beachten Sie, dass die Zellen sollten nichtgehalten in PBS für lange Zeiträume.

Alternative Farbstoffe für die Zell-Tracking sind CellTracker Serie, die das Zytoplasma Flecken und werden während der Zellwanderung und Teilung erhalten. Transfektion von Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsproteins ist besonders nützlich, um die subzelluläre Verteilungen eines Proteins von Interesse während der Migration aufzuzeichnen. Allerdings fluoreszierende Proteine ​​typischerweise Foto-bleach schneller als organische Farbstoffe, so dass langfristige Beobachtungen nicht möglich sein.

6. Laden der Zellen mit einem löslichen Gradient in der Mikrofluidik Geräte

  1. Fluoreszenzmarkierte Zellen zu zählen und in zwei Rohren mit gleichem Zellzahlen. Waschen und resuspendieren einen Röhre von Zellen mit Medium, das die chemische Lockstoffe wie modifiziertes Eagle low glucose Dulbeccos Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Waschen und resuspendieren Sie das andere Rohr von Zellen in Medien ohne Lockstoff, dh DMEM mit 0% FBS. Die Endkonzentrationder Zellen in jedem Schlauch sollte 5 x 10 5 Zellen / ml liegen.
  2. Entfernen Sie alle Lösungen aus der Mikrofluidik-Vorrichtung (aus Schritt 4,3) und legen Sie es auf dem Mikroskoptisch (siehe Schritt 7). Leistung 70 ul Zellen (5 × 10 5 Zellen / ml in DMEM 0% FBS) in einem Reservoir und 70 ul von HeLa-Zellen (5 x 10 5 Zellen / ml in 10% FBS DMEM) in eine andere. Locker legen einen Band über den Stauseen um Verdunstung zu vermeiden. Wenn Zellen auf der Oberfläche vorinkubierten sind vor der Bebilderung, ist es ratsam, dass die Zellen in die Vorrichtung in Wachstumsmedium ohne die Gradienten geladen. Die Vorrichtung wird dann auf dem Mikroskoptisch platziert und die Medien ersetzt Gradienten dh Medien DMEM ohne FBS in ein Reservoir und DMEM mit 10% FBS in der anderen.

7. Live Cell Imaging and Data Analysis

  1. Schalten Sie das Mikroskop (Nikon Ti-E) und erwärmen die Bühne mindestens 1 Stunde vor dem Start des Experiments.
  2. Sicherzustellen, dass der Kanal des Mikrofluidic Vorrichtung im Sichtfeld und Zellen sind im Fokus. Wählen Bildaufnahme Parameter wie Belichtungszeiten und fluoreszierenden Filter, Bildsequenz Hellfeld und Fluoreszenz, die Zellen und Spuren erfasst sowie Zeitpunkten und Aufzeichnungslänge (zB alle 15 Minuten für 16 Stunden).
  3. Analysieren von Daten mit den entsprechenden Software wie ImageJ Manuelle Tracking oder Ibidi Chemotaxis und Migration Tool.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zelle zu verstehen, wie Wanderungssignale integrieren 25 haben wir ein Verfahren entwickelt, um Bildzellen mit Fluoreszenzmikroskopie dass in einer Umgebung mit konkurrierenden Klebstoff und löslichen Gradienten (Abbildung 1) zu migrieren. Klebstoff Spuren, die fluoreszierende Streptavidin und biotinyliertem RGD enthalten waren, mit Mikrokontaktstruktur gedruckten Spuren und Dip-Pen-Lithographie (Abbildung 2) geschaffen. Erfolgreiche Mikrokontaktdruck wird durch die Linie Profil der Fluoreszenzintensität über die Gleise, wo Klebstoff Tracks und Anti-Fouling-Regionen deutlich unterschieden (Abb. 2b) werden angezeigt. Dots mit Dip-Pen-Lithographie gedruckt erscheinen abgerundet, nicht reißen geformt, was auf eine erfolgreiche Druckprozess. Oberflächenchemie und Luftfeuchtigkeit beeinflusst das Ergebnis des Druckvorgangs. Allgemein gilt: Je mehr hydrophobe die Oberfläche ist, desto besser ist die druckenden Ergebnissen.

Ein Gradient von Klebstoff Hinweiseauf der bedruckten Bahn wurden mit einer einfachen Mikrofluidvorrichtung durch Laden Biotin-4-Fluorescein und in die gegenüberliegende Seite einer mikrofluidischen Kammer (Abbildung 3) Biotin-RGD erstellt. Da beide Moleküle binden kompetitiv an die Streptavidin-Spur auf der Glasoberfläche, ist ein immobilisierter Gradienten von RGD-Liganden erzeugt. Nach dem Entfernen des Biotin / Biotin-RGD-Lösung kann dieselbe Kammer verwendet, um eine lösliche Gradienten, die stabil innerhalb des mikrofluidischen Kanals für mindestens 16 h (Abb. 4) einzuführen.

Wir führten HeLa-Zellen in die Kammer mit einem chemoattraktiven Gradienten, für die FBS wurde verwendet. Bei geringen Dichten, HeLa-Zellen bevorzugt eingehalten und migrierte an den Streptavidin / RGD Spuren (N Zellen = 50) und vermieden die Antifouling-PEG Regionen (N Zellen = 19). Die Position der einzelnen Zellen wurde über 16 Stunden aufgezeichnet und analysiert mit einer Zelle Tracking-Software. In einem Experiment, bei dem Klebstoff und Lösungenlich Gradienten zueinander (Abbildung 5) entgegengesetzt sind, zeigten die Flugbahnen der einzelnen Zellen, HeLa-Zellen mehr in Richtung der Quelle der chemoattraktiven (rot Spuren in 5c, N = 36 Spuren) migriert als gegenüber höheren Konzentrationen von adhärenten RGD (schwarz Spuren in 5c, N Spuren = 14). Die durchschnittliche Entfernung, die Zellen vor (schwarze Spuren) oder in (rote Kurven) die Richtung der FBS Gradienten (x-Komponente der durchschnittlichen Verschiebung jeder Trajektorie) migriert 0,1700 ± 0,1172 und 0,2278 ± 0,1280, bzw. (P <0,0001, Student war t-Test), obwohl es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in der durchschnittlichen Verschiebung zwischen den schwarzen Spuren (56,18 ± 32,27 um) und die roten Spuren (72,86 ± 45,05 um; P> 0,05, Student t-Test). HeLa-Zellen mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 17,47 ± 4,72 um / h in Gegenwart von sowohl Gradienten von Klebstoff migrierenCue (dh RGD) und löslichen Cue (FBS). Die Daten daher vor, dass für HeLa-Zellen, die FBS Gradienten die Richtung der Migration bestimmt, während die Zellen eine intrinsische Migration Geschwindigkeit zu halten auf den Kleber Spuren.

Wir haben auch die Migration der Macrophagen J774 beurteilt. In Abwesenheit von Klebemittel und löslichen Gradienten, diese Zellen mit wesentlich höheren Geschwindigkeiten (38,55 ± 17,88 um / h) als HeLa-Zellen (16,47 ± 4,28 um / h), jedoch mit weniger Persistenz dh J774-Zellen Änderungsrichtung (Richtungsabhängigkeit von 0,059 ± 0,091 migrieren ), gemessen als das Verhältnis der Länge zum Verschieben öfter als HeLa-Zellen (0,57 ± 0,12) auf Mikrokontaktstruktur gedruckten Fibronectin Spuren verfolgen. J774-Zellen sind auch weniger Kontakt abhängig als HeLa-Zellen. Die Verschiebung des J774-Zellen höher war auf den PEG Regionen (102,20 ± 54,73 um) als auf Fibronektin Spuren (42,95 ± 39,90 um). Darüber hinaus J774 Zellen einppeared auf unterschiedliche Oberflächenchemie durch Veränderung ihrer Mechanismus der Migration von mesenchymalen um amoeboid anzupassen. Im Ergebnis sind Kleber Cues nicht so wichtig J774-Zellen, wie sie für HeLa-Zellen sind. Beide Zelltypen bevorzugt in die Richtung des löslichen Cue migriert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schema des Herstellungsprozesses einer mikrofluidischen Einrichtung, die die Abbildung von wandernden Zellen Reaktion auf entgegengesetzten Gradienten der Klebstoff gegenüber löslichen Signale ermöglicht. Ein. Glas-Deckgläschen mit passiviert biotinylierten PLL-PEG. B. Klebemuster mit fluoreszierenden Streptavidin werden auf das biotinylierte gedruckt Oberfläche entweder als Linien mit Mikrokontaktdrucken (b) oder Punkte mit Dip-Pen-Lithographie (b '). c. D. Zellen erzeugt und ein lösliches chemoattraktive Gradienten von 0-10% FBS in die Mikrofluidik-Vorrichtung geladen. Nachdem die Zellen auf der Oberfläche haften, leben Zellmigration über RGD Gradienten auf Streptavidin Spuren und in Gegenwart von FBS Gradienten können in dem Kanal, die die beiden Reservoirs abgebildet werden.

Abbildung 2
Abbildung 2. Zelladhäsiven Muster (Linien und Punkte) kann mit zwei verschiedenen Drucktechniken erzeugt werden a Fluorescent Bild Mikrokontakt gedruckt Streptavidin-AlexaFluor350 Spuren (Abs: 346 nm, Em: 442 nm; grau).. Auf PLL-PEG-beschichteten Deckgläschen. Die microcontract Druckmaske wurde als Linien, die 100 um breite mit 290 um Mitte-zu-ce waren gestaltennter Raum. b. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität Mikrokontaktstruktur Streptavidin Spuren, wie unter a dargestellt, aus fünf getrennten Oberflächen als Querschnitte von oben nach unten gedruckt. Die durchschnittliche Breite der Strecke beträgt 90 ± 6 Mikrometer und die durchschnittlichen Mitte-zu-Mitte-Abstand beträgt 293 ± 2 um. C. Ein Hellfeld Bild von Streptavidin-haltige Punkte mit Dip-Pen-Lithographie erzeugt. Die Durchmesser der Punkte betrug 6-9 um mit 15 um Mitte-zu-Mitte-Raum. Maßstabsbalken in a und c 100 um.

Abbildung 3
Abbildung 3. Biotin-4-Fluorescein-Gradienten (0 ug / ul - 0,03 ug / ul). Auf einem Glasoberflächen gleichmäßig beschichtet mit Streptavidin Biotin-4-Fluorescein und Biotin-RGD wurden entweder Reservoir der Mikrofluidvorrichtung (Slide-klebrigen Chemotaxis 3D beladen , Ibidi), dieverbunden durch eine 1 mm langen Kanal. Nach einer 1-stündigen Inkubation wurde das Gerät mit PBS gespült und erneut mit PBS. Ein. 60 Mosaikbilder wurden mit insgesamt Bildlänge 3072 um und b die Fluoreszenzintensität über die Länge des gesamten Mosaik gemessen wurde. Linearen Trend Linien wurden zur Fluoreszenzintensität versehen sind, die Gradienten in der RGD Kanals anzugeben.

Abbildung 4
Abbildung 4. Die Fluoreszenzintensität einer Fluorescein-Gradienten (0 pM - 1 uM) in dem mikrofluidischen Kanal eine unmittelbar nach der Einrichtung (T hr = 0) und b nach einer 16-stündigen Inkubation PBS ohne und mit 1 uM Fluorescein wurde von der linken und rechten geladen. Reservoir des Mikrofluidik-Vorrichtung (sticky-Slide Chemotaxis 3D Ibidi) sind. Der Mikrofluidkanal beträgt 1 mm in der Länge undan Position 50 bis 1.050 &mgr; gefunden. Der Gradient war für mindestens 16 Stunden stabil.

Abbildung 5
Abbildung 5. HeLa Zellmigration in einem Mikrofluidik Kammer (sticky-Slide Chemotaxis 3D, Ibidi) mit gegenüberliegenden Klebstoff-Gradienten (RGD immobilisiert auf Streptavidin tracks) und löslichen Gradienten (0-10% FBS). Ein. Ein repräsentatives Bild von Zellen in einem mikrofluidischen Kammer mit gegnerischen Steigungen. Maßstab ist 50 um. B Zeitraffer-Bilder von einer Zelle mit einem Epifluoreszenzmikroskop (Nikon Ti-E) übernommen. Die Bilder wurden bei 15 Minuten-Intervallen für 20 Stunden und Zell Bahn (blaue Linie) über Zell Schwerpunkt Positionierung (ImageJ manuelle Tracking Plugin) eingenommen. Maßstab ist 50 um. C. Zelle Trajektorie von Bildern, wie in b gezeigt. Zelle trajectories, die in Richtung der höheren Konzentration an löslichem FBS migriert sind rot (N Spuren = 36) dargestellt; Zelle Trajektorien zu höheren Konzentrationen von adhärenten RGD migriert werden schwarz (N Spuren = 14) dargestellt. Hier eine größere Zahl anzuzeigen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bei diesem Protokoll, verwendeten wir ein handelsübliches Mikrofluidvorrichtung (Slide-klebrigen Chemotaxis 3D von Ibidi), um die Effekte von chemisch modifizierten Oberflächen und chemoattraktive Gradienten auf Zellmigration studieren. Diese mikrofluidischen Einrichtung erfordert keine Strömung, da der Gradient durch Diffusion entlang der Länge des Kanals einstellt. Dies ist wichtig, weil Flow unterschiedlich beeinflussen könnte langsam wandernden Zellen wie Fibroblasten, die stabil fokalen Adhäsionen und schnell wandernden Zellen wie die meisten Leukozyten, die kleine fokale Komplexe und Synapsen 26 zu bilden. Scherbeanspruchung von laminarer kann die Stabilität der Zelladhäsion an Klebstoff Signale und-Chemotaxis in Richtung löslichen Cues 27,28 beeinflussen. Wir fanden Unterschiede in der Migrations-Verhalten zwischen langsam bewegenden HeLa-Zellen und schnelllebigen J774-Zellen somit zeigen, dass die mikrofluidischen Setup gilt für beide Anhänger und weniger haftend Zelltypen. Solche Vergleiche auch revealed interessanter Unterschied zwischen Zelltypen in Adhäsion und Migration Reaktionen auf Oberflächenmuster, das beide Kleber Cues (RGD-Peptide oder Fibronektin) und Anti-Fouling-Regionen (PEG Bereiche) enthalten ist.

Oberflächenstrukturen wurden mit Mikrokontaktdruck 29 und Dip-Pen-Lithographie 30,31 erstellt. Mikrokontaktdruck ist eine einfache und relativ schnelle, reproduzierbare Strukturierungsprozess. Jedoch ist die Konstruktion und Herstellung der PDMS-Stempel, der durch Photolithographie erreicht wird, komplizierter und zeitraubend. Es führt auch seine eigenen Beschränkungen gekennzeichnet, daß kleine Merkmale (<5 um) sind schwer zu erreichen und nach dem Seitenverhältnis des Musters abhängen. Kurz gesagt, ist Mikrokontaktdruck ideal für große Muster bis zu Hunderte von Mikron und in Experimenten, in denen die gleichen Muster müssen geschaffen viele Male. Auf der anderen Seite kann dip Stift Lithographie verwendet werden, um Mikrometer bis nanoskaligen Muster zu erzeugen. Es ist besser geeignet, um Druckpunkteals Linien können zwar Leitungen hergestellt werden. Dip Pin Lithographie bietet eine größere Freiheit in Muster-Designs, da es keine Notwendigkeit für vorgefertigte Masken, Meister oder Briefmarken. Allerdings ist die Geschwindigkeit des langsamen Strukturierungsprozesses, wodurch Drucken großer Flächen umständlich und Zugang zu einem speziellen Instrument ist wesentlich. Die beiden Strukturierungsverfahren sind relevant für Betracht, da die Größe und Form des Klebstoffs Cue Muster die Organisation und Verteilung der Maschinen, die biomechanischen Zellwanderung 32,33 regulieren beeinflussen. Zusätzlich ist die Begrenzung der kommerziellen Mikrofluidikvorrichtung hier eingesetzten, daß die Kanallänge (1 m) können nicht verändert werden und so kann man keine Kontrolle über die maximale Steilheit der Klebstoff und löslichen Gradienten. Wenn größere Steigungen notwendig sind, müsste man einen mikrofluidischen Vorrichtung mit einer kürzeren Kanal zwischen den zwei Reservoirs herzustellen. Ein wesentlicher Vorteil des hier beschriebene Protokoll ist der modulare Aufbau, so dass verschiedene surfaces, Oberflächenchemie, Strukturieren Ansätze und Mikrofluidvorrichtungen konnte für eine Vielzahl von lebenden Zellen Experimenten kombiniert werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Wir haben keine kommerziellen Interessen offen zu legen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Mittel aus dem Australian Research Council und National Health and Medical Research Council of Australia und auch möchte ich danke Australian National Fabrication Facility für die SU-8-Master für das Mikrokontaktdruck. SHN wird durch das Ministerium für Höhere Bildung Malaysia und Universiti Sains Malaysia unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass staining outfits Thomas Scientific 8542 E40 Coverslip rack
Oven Binder ED 53 series
Silicon wafer Silicon Quest 708-007 Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist Gersteltec Sarl
SU-8 developer Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%) SuSos AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) 1 mg/ml in PBS
Fluorescein Sigma 46955 1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249 1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein Invitrogen B-1370 0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD GenScript SC1208 0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red Invitrogen S-11346 1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D Ibidi 80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip Greiner Bio-One 739261
Vaseline Sigma 16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C Sigma 327204
Nano eNabler 10 μm cantilever BioForce SPT-S-C-10s
Image J software National Institute of Health rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin Fabrice Cordelières rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool Ibidi GmbH www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Tags

Bioengineering Mikrobiologie Zellbiologie Biochemie Molekularbiologie Biophysik Zellmigration Live Cell Imaging lösliche und Anhänger Steigungen Mikrokontaktdruck Dip-Pen-Lithographie Mikrofluidik RGD PEG Biotin Streptavidin Chemotaxis chemoattractant Bildgebung
Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., … More

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., Tønnesen, L., Fairjones, Z., Gooding, J. J., Böcking, T., Gaus, K. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (74), e50310, doi:10.3791/50310 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter