Summary
Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.
Abstract
Cellen kunnen voelen en migreren naar hogere concentraties lijm signalen zoals glycoproteïnen van de extracellulaire matrix en oplosbare signalen zoals groeifactoren. Hier beschrijven we een methode om tegengestelde hellingen van lijm en oplosbaar maken signalen in een microfluïdisch kamer, die verenigbaar is met live cell imaging. Een copolymeer van poly-L-lysine en polyethyleenglycol (PEG-PLL) wordt gebruikt om dekglaasjes passiveren en niet-specifieke adsorptie van biomoleculen en cellen voorkomen. Vervolgens microcontact printen of dip pen lithografie worden gebruikt om sporen van streptavidine de gepassiveerde oppervlakken creëren als verankeringspunten voor het gebiotinyleerde peptide arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) als lijm cue. Een microfluïdische inrichting is geplaatst op het gemodificeerde oppervlak en gebruikt om de helling van lijm signalen (100% tot 0% RGD RGD) op streptavidine sporen. Tenslotte wordt dezelfde microfluïdische inrichting waarmee een gradiënt van een chemoattractant suc creërenh zoals foetaal runderserum (FBS), als de oplosbare cue in tegengestelde richting van de gradiënt van lijm signalen.
Introduction
Gerichte cel migratie is een fundamentele eigenschap van vele cellen en is een belangrijk aspect van veel normale fysiologische processen, met inbegrip van de embryonale ontwikkeling, afweer tegen infecties en wondheling. Bovendien celmigratie speelt ook een belangrijke rol bij veel ziekten zoals vasculaire ziekten, tumorcel metastase en chronische ontsteking 1,2. Terwijl de klassieke toestanden van celmigratie - polarisatie, uitsteeksel uitbreiding, de vorming van de hechting, de troepenmacht en achter retractie - worden algemeen aanvaard 3,4 is de opheldering van spatio-temporele mechanismen waardoor signaal integratie wordt gecoördineerd zo uitdagend.
De extracellulaire matrix (ECM) dient als substraat voor celadhesie en door inherente chemische en fysische 5 6 diversiteit voorziet directionele signalen te navigeren door cellen 7,8. Naast deze signalen lijm 9, oplosbare factoren 10-12 </> Sup zoals chemokines en groeifactoren kunnen induceren gericht cel migratie door chemoattractant receptoren en hun downstream motogenic signalering. Momenteel is niet bekend of betrokkenheid en signalering door adhesie receptoren (bijvoorbeeld integrinen) of chemoattractantia zoals receptor tyrosine kinase (RTK), dominant zijn. Evenmin is bekend of hiërarchieën receptorsystemen zijn celtype specifiek.
Levende cellen microscopie geeft een schat aan informatie die niet toegankelijk is in bulk-assays en kan gecombineerd worden met microfluïdische apparaten om gradiënten van geïmmobiliseerd 13,14 en oplosbare signalen 15 16 genereren. De hier beschreven methode maakt gebruik van een reeks eenvoudige en bepaalde stappen voor de oppervlaktebehandeling in combinatie met een commercieel verkrijgbaar microfluïdische ruimte een beeldvormend assay maken voor celmigratie die gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in een laboratorium celbiologie (figuur 1). De geassembleerdemicrofluïdische apparaat optische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met glas 17 en de gradiënten van diffundeerbare moleculen stabiel gedurende tenminste 16 uur. Het systeem kan gebruikt worden voor epifluorescentie microscopie en geavanceerde technieken. In tegenstelling tot andere chemotaxis opstellingen 18, is dit systeem geschikt voor het opnemen langzaam migreren hechtende cellen. Belangrijk is het systeem modulair en eenvoudig kan de invoering van alternatieve kleefstof of oplosbare migratie signalen en onderzoek van verschillende celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Passivering van dekglaasjes met PLL-PEG-biotine
Deze stap is bedoeld om het oppervlak passiveren zodat cellen hechten en migreren naar specifieke gebieden op het dekglaasje bedekt die zijn gemaakt met microcontract afdrukken (Stap 2-3a) of dip pen lithografie (Stap 3b). Voor de passivering wordt een co-polymeer van poly-L-lysine (PLL) en polyethyleenglycol (PEG) gebruikt waarbij 20% van de PEG-moleculen worden geënt aan biotine (PLL-PEG-biotine).
- Om dekglaasjes (18 mm x 18 mm), onderdompelen in een rek in 100% ethanol schoongemaakt en plaats het rek in een bad sonicatie gedurende 30 minuten. Droog de dekglaasjes in lucht of onder een stikstofstroom.
- Vervolgens ultrasone trillingen de dekglaasjes gedurende 30 minuten in 1 M NaOH. Daarna spoel de glazen oppervlakken door voorzichtig te dompelen het rek in een bekerglas gevuld met 1,5 L Milli-Q H 2 O. Herhaal het spoelproces driemaal met verse Milli-Q H 2 O telkens. Droog het glas dekglaasjes ineen oven bij 60 ° C.
- Plaats helft van de schone dekglaasjes afzonderlijk in een vochtige kamer, die is gemaakt van een 24-well plaat gedeeltelijk gevuld met H 2 O. Drop 15 pi van PLL-PEG-biotine (1 mg / ml) in PBS aan elke dekglaasje bedekt. Neem de andere helft van de resterende schone glazen dekglaasjes en zorgvuldig sandwich van de PEG-oplossing. Laat de dekglaasjes gedurende 1 uur in de vochtige kamer. Schuif de kern dekglaasjes voorzichtig weg van elkaar zonder schrapen PEG-coating en spoelen met Milli-Q H 2 O. Het water moet gemakkelijk glijden over de PEG-behandelde zijde. Indien nodig drogen aan de lucht het glas dekglaasjes op papier handdoek met het behandelde oppervlak naar boven. Sla de dekglaasjes in een vacuümexsiccator tot verder gebruik.
2. Fabricage van stempels voor microcontact afdrukken
We beschrijven twee processen op patroon streptavidine tracks op de gepassiveerde dekglaasjes. De eerste, microfoonrocontact afdrukken vereist doorgaans het vervaardigen van een silicium meester waaruit een PDMS stempel wordt gegoten. In ons geval, het patroon op de PDMS stempel 100 urn brede lijnen 290 urn center op hart afstand zijn met een functie hoogte van 25 pm. Hieronder beschrijven we kort hoe een geschikte silicium master (Stap 2.1-2.3) en PDMS stempel (Stap 2.4) fabriceren. Er zijn echter meerdere protocollen voor microcontact afdrukken beschreven in de literatuur 19-23, die geschikt zijn voor het afdrukken van eiwitpatronen op dekglaasjes. Masters kunnen ook op maat worden gemaakt en gekocht uit commerciële bronnen.
- Eerste Reinig de silicium wafer (4 "in diameter) door incubatie in Piranha-oplossing (3:1 v: v zwavelzuur en 30% waterstofperoxide). Gedurende 20 min spoelen wafer 10 keer grondig met MilliQ H2O Droog de wafer in een oven bij 150 ° CO / N.
- Spoel de schone en gedroogde silicium wafer met 100% aceton, gevolgd door 100% isopropyl alcohol. Volgendespin-coat 2 ml GM1070 SU-8 fotolak (Gersteltec Sarl) op de wafer bij 3100 rpm gedurende 40 seconden in een 25 pm dikke laag. Het monster wordt vervolgens gebakken op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 5 min gevolgd door een verdere 5 minuten bij 95 ° C.
- Maak de SU-8 fotolak aan UV-licht gedurende 60 sec onder een fotomasker met het gewenste patroon (bijvoorbeeld met behulp van een Quintel Q6000 masker aligner) en herhaal het bakproces te beschrijven in 2.2. Dan wordt het monster ontwikkeld door onderdompeling van de wafer in SU-8 developer (Gersteltec Sarl) gedurende 4 min, gespoeld in 100% isopropyl alcohol en gedroogd onder een stikstofstroom. Het gebied van de SU-8 fotolak die niet blootgesteld aan UV licht wordt dus verwijderd, waardoor de inverse patroon van de PDMS stempel.
- De volgende stap is een PDMS stempel gegoten uit silicium master. Eerste meng 1 deel (w / w) van het uithardingsmiddel met 10 delen elastomeer prepolymeer (Sylgard 184). Om eventuele luchtbellen te verwijderen, ontgas de mengsel in een exsiccator met het vacuümsysteem verbonden lijngedurende 1 uur. Vervolgens giet het PDMS elastomeer op het silicium meester in een petrischaal tot ongeveer 1 cm hoog en genezen meester en PDMS mengsel in een oven bij 70 ° C gedurende 1 uur. Tenslotte wordt de PDMS stempel verwijderd uit het silicium master en op maat gesneden.
3. Patronen Streptavidine of Adhesive Cues op Gepassiveerd dekglaasjes
Na passiveren dekglaasjes, worden eiwitpatronen bedrukt met microcontact afdrukken (Stap 3a) of dip-pen lithografie (stap 3b). In ons geval wordt streptavidine gedrukt als lijnen die de basis voor de RGD hellingen (Stap 4) vormen. Dezelfde procedure kan ook worden gebruikt voor het afdrukken matrixeiwitten van lijm patronen.
Een alternatieve methode om microcontact afdrukken voor de patroonvorming van biomoleculen op oppervlakken dip pen lithografie. In dip pen lithografie wordt een cantilever gebruikt om een klein volume over te brengen op het oppervlak. De grootte van de cantilevers, viscosity van de oplossing, het tijdstip van de cantilever contacteren op het oppervlak hydrofobiciteit van het oppervlak en vochtigheid in de kamer drukken de grootte van de gedrukte functies. Het voordeel van deze werkwijze is dat verschillende patronen kunnen worden afgedrukt voor elke experiment, omdat er geen noodzaak om masters en stempels fabriceren. Het nadeel is dat het langer duurt om een bepaald patroon af te drukken en dat kroontjespen lithografie is een specialist instrument dat niet beschikbaar zijn in veel laboratoria. De dip pen lithografie instrument dat we gebruikten was de NanoeNabler van Bioforce Nanoscience. Hier is gedrukt kleine stippen die <10 urn in diameter, waarvoor wij SPT10 consoles gebruikt.
3a. Microcontact afdrukken (μCP) Techniek
- Te reinigen en maken PDMS stempel meer hydrofiele Behandel de bedrukte zijde van het PDMS stempels in een UV en ozon (bijvoorbeeld UV ozon Procleaner van Bioforce Nanoscience) gedurende 1,5 uur. U kunt ook een plasma-reiniger voor een kortere tijd voor hetzelfde doel. Dit proces creëert een geoxideerde PDMS oppervlak 24, waarop de drukkende verbetert.
- Onmiddellijk na de ozon of plasmabehandeling, plaats en verspreid 10 ul streptavidine (1 mg / ml in PBS) op de PDMS zegels en laat gedurende 1 uur in een vochtige kamer (zoals een gedeeltelijk gevulde 6-well plaat, zie Stap 1.3) . Als sporen zichtbaar moet onder de fluorescentiemicroscoop gebruikt streptavidine dat is geconjugeerd aan een fluorofoor zoals streptavidine-AlexaFluor350.
- Verwijder overtollig streptavidine van de stempel met tissue papier en lucht droog de stempel voor ongeveer 1 minuut. Druk lichtjes op de stempel op de PLL-PEG-biotine-gecoat glas dekglaasje aan.
- Als fluorescerende streptavidine werd gebruikt in stap 3.a2, onderzoeken het patroon met behulp van onder een epifluorescentiemicroscoop. Bewaar de bedrukte zijde in een exsiccator.
3b. Dip Pen Lithografie
- Eerste Meng 1 deel 1 mg / ml streptavidine of streptavidin-AlexaFluor350 met 10 delen glycerol (v / v) en belading 5 pi van het mengsel op de cantilever. Dan begint het drukproces, zoals beschreven in de gebruiksaanwijzing van de kroontjespen lithografie instrument. De vlekgrootte tot ongeveer 5 urn verminderen passen afdruksnelheid, contacttijd van de cantilever op het oppervlak of verticale afstand van de cantilever aan het oppervlak. In het voorbeeld van figuur 2c werden dots afgedrukt in een lijn met rijen en kolommen scheiding ingesteld tot 10-15 urn. Deze afstand is voldoende om dots voorkomen in elkaar over, maar maakt het observeren van meerdere punten in een gezichtsveld met de meeste microscoop instellingen.
- Bewaar de bedrukte zijde in een exsiccator.
4. Het creëren van Adhesive Verlopen op Streptavidine-patroon oppervlakken
We maken kleefstof gradiënten van biotine-RGD op dekglaasjes die zijn gecoat met streptavidine (Figuur 3) of contain streptavidine patronen op gepassiveerd dekglaasjes (Figuur 5). Om een oppervlak gradiënt te creëren, hebben we gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaat (de zogenaamde sticky-Slide Chemotaxis 3D uit Ibidi) die een stabiele oplossing gradiënt door passieve diffusie creëert. Concurreren om streptavidine bindingsplaatsen gebruikten we twee tegengestelde gradiënten van biotine-RGD en biotine dat was geconjugeerd aan RGD (zie figuur 1).
- Plak de streptavidine-gecoate of-patroon dekglaasjes op de kleverige kant van de sticky-Slide Chemotaxis 3D-apparaat. Opdat er geen lekkage enkele uren worden de randen van de inrichting afgesloten met een dunne laag Vaseline verwarmd en met een tweede laag van een mengsel van 1 deel Vaseline op 1 deel paraffinewas (w / w).
- Vul het kanaal van het apparaat met 6 pi PBS in het kanaal. Vul de twee reservoirs met 70 ul van 0,03 pg / pl biotine-4-fluoresceïne in PBS en 70 & mu, l van 0,03 pg / pl biotine-RGD in PBS, respectievelijk. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.
- Verwijder de biotine oplossingen en zorgvuldig naspoelen terwijl aan de microfluïdische apparaat tweemaal met PBS. Markeer de richting van de gradiënt en kleefmiddel indien nodig, de inrichting gevuld met PBS bij 4 ° C opgeslagen voor maar zorgen dat het apparaat niet uitdroogt. Desgewenst analyseren lijm verloop met een fluorescentiemicroscoop.
5. Etikettering van Cellen met fluoroforen voor live cell imaging
Cellen worden gelabeld met fluorescente kleurstoffen die cell tracking staan onder de fluorescentiemicroscoop. Gemeenschappelijke probes zijn fluorescerende markers organellen, zoals Syto 64 Red die de celkern aanbrengt. Hiertoe worden cellen eerst drie keer gewassen met PBS en vervolgens geïncubeerd met 1 uM Syto 64 Red in kweekmedia gedurende 45 min en tenslotte nog drie keer gewassen met PBS. Houd er rekening mee dat de cellen niet zou moeten zijnbewaard in PBS gedurende lange tijd.
Alternatieve kleurstoffen voor cell tracking zijn CellTracker serie die het cytoplasma vlekken en blijven tijdens cel migratie en verdeeldheid. Transfectie van cellen met fluorescent eiwit is bijzonder nuttig om de subcellulaire verdeling van een eiwit van interesse opnemen tijdens migratie. Echter, fluorescente eiwitten typisch foto-bleach sneller dan organische kleurstoffen, zodat op lange termijn waarnemingen niet mogelijk.
6. Laden van cellen met een oplosbare Gradient in de Microfluidics Device
- Tellen fluorescent gemerkte cellen gesplitst in twee buizen van gelijke celaantallen. Wassen en een tube van cellen te resuspenderen met media die de chemoattractant, zoals gemodificeerde Eagle laag glucose Dulbecco's Medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS). Wassen en resuspendeer de andere buis van cellen in media zonder chemoattractant, dwz DMEM met 0% FBS. De eindconcentratiecellen in elke buis moet 5 x 10 5 cellen / ml.
- Verwijder alle oplossingen van de microfluïdische apparaat (uit stap 4.3) en plaats het op de microscoop podium (zie stap 7). Belasting 70 pi cellen (5 x 10 5 cellen / ml in 0% FBS DMEM) in een reservoir en 70 pi HeLa-cellen (5 x 10 5 cellen / ml in DMEM 10% FBS) in een andere. Losjes plaats een tape over de reservoirs om verdamping te voorkomen. Als cellen op het oppervlak zijn gepreïncubeerd voorafgaand aan beeldvorming, is het wenselijk dat de cellen worden geladen in het apparaat in kweekmedium zonder gradiënt. De inrichting wordt dan geplaatst op de microscoop podium en het medium vervangen door gradient media zoals DMEM zonder FBS in een reservoir en DMEM met 10% FBS in de andere.
7. Live cell imaging en data-analyse
- Schakel de microscoop (Nikon Ti-E) schoonmaken en de fase tenminste 1 uur voordat het experiment.
- Zorg ervoor dat het kanaal van de microfluidic apparaat in het gezichtsveld en cellen in focus. Selecteer beeldacquisitie parameter zoals belichtingstijden en TL-filters, beeld opeenvolging van helderveld en fluorescentie dat cellen en sporen vangt en tijd punten en opnametijd (bijv. elke 15 min. gedurende 16 uur).
- Gegevens analyseren met geschikte software zoals ImageJ Handmatige sporing of Ibidi Chemotaxis en Migration Tool.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te begrijpen hoe cellen te integreren trekkende signalen 25, hebben we een methode ontwikkeld om de afbeelding cellen met fluorescentie microscopie die migreren in een omgeving met concurrerende lijm en oplosbare hellingen (figuur 1). Lijm tracks die fluorescerende streptavidine en gebiotinyleerde RGD die zijn gemaakt met microcontact gedrukte nummers en kroontjespen lithografie (figuur 2). Succesvol microcontact afdrukken is aangegeven door de lijn profiel van de fluorescentie-intensiteit in het spoor waar lijmresten en aangroeiwerende gebieden duidelijk te onderscheiden (figuur 2b). Dots bedrukt met kroontjespen lithografie verschijnen afgerond en niet gevormde scheuren, wat wijst op een succesvolle drukproces. Oppervlakte chemie en luchtvochtigheid beïnvloedt de uitkomst van het drukproces. Algemeen de meer hydrofobe het oppervlak is, hoe beter de resultaten afdrukken.
Een gradiënt van lijm signalenop het gedrukte circuit werd gemaakt met een eenvoudige inrichting door het laden microfluidics biotine-4-fluoresceïne en biotine-RGD in de andere zijde van een microfluïdische kamer (figuur 3). Omdat beide moleculen binden competitief aan de streptavidine spoor op het glasoppervlak wordt een geïmmobiliseerd gradiënt van RGD liganden gegenereerd. Na verwijdering van het biotine / biotine-RGD oplossing kan dezelfde kamer worden gebruikt om een oplosbaar verloop, dat stabiel is in het microfluïdisch kanaal tenminste 16 uur (Figuur 4) te voeren.
We HeLa cellen in de kamer gebracht met een chemoattractant gradiënt, waarbij FBS werd gebruikt. Bij lage dichtheden, HeLa cellen voorkeur gevolgd en migreerde op de streptavidine / RGD tracks (N cellen = 50) en voorkomen het aangroeiwerende PEG's (N = 19 cellen). De positie van individuele cellen werd opgenomen meer dan 16 uur en geanalyseerd met een cell tracking software. In een experiment waarbij lijm en oplossingenBLE gradiënten zijn tegen elkaar (Figuur 5), de banen van afzonderlijke cellen toonde aan dat meer HeLa cellen gemigreerd naar de bron van de chemoattractant (rode sporen in figuur 5c, N sporen = 36) dan naar hogere concentraties hechtende RGD (black sporen in Figuur 5c, N sporen = 14). De gemiddelde afstand die cellen gemigreerd tegen (zwarte sporen) of (rode sporen) de richting van de gradiënt FBS (x-component van de gemiddelde verplaatsing van elk traject) was 0,1700 ± 0,1172 en 0,2278 ± 0,1280 (p <0,0001, Student t-test) hoewel er geen statistisch significant verschil in gemiddelde verplaatsing tussen de zwarte sporen (56,18 ± 32,27 pm) en de rode sporen (72,86 ± 45,05 micrometer; P> 0,05, Student t-test). HeLa cellen migreren met een gemiddelde snelheid van 17,47 ± 4,72 pm / uur in aanwezigheid van zowel gradiënt van kleefstofcue (dwz RGD) en oplosbare cue (FBS). De gegevens suggereren derhalve dat HeLa-cellen, de helling FBS de trekrichting bepaalt terwijl de cellen behouden een intrinsieke migratiesnelheid de lijmresten.
Wij hebben tevens de migratie van de macrofaag cellijn J774. In afwezigheid van lijm en oplosbare verlopen, deze cellen migreren veel sneller (38,55 ± 17,88 pm / uur) dan HeLa cellen (16,47 ± 4,28 pm / uur) maar minder persistentie ie J774 cellen veranderen richting (richting in 0,059 ± 0,091 ), gemeten als de verhouding van verplaatsing op lengte houden meestal HeLa-cellen (0,57 ± 0,12) op microcontact afdrukken fibronectine tracks. J774-cellen zijn ook minder contact afhankelijk is dan HeLa-cellen. De verplaatsing van J774 cellen was hoger met de PEG's (102,20 ± 54,73 um) dan op fibronectine tracks (42,95 ± 39,90 pm). Bovendien J774 cellen eenppeared naar verschillende oppervlakte chemie aanpassen door het veranderen van hun mechanisme van migratie van mesenchymale naar amoeboïde. Concluderend lijm signalen niet zo belangrijk J774 cellen als voor HeLa cellen. Beide celtypen voorkeur gemigreerd in de richting van de oplosbare cue.
Figuur 1. Schematische voorstelling van het fabricageproces van een microfluïdische setup die het mogelijk maakt de beeldvorming van migrerende cellen reageren op tegengestelde hellingen van de lijm ten opzichte van oplosbare cues. Een. Glas dekglaasjes worden gepassiveerd met gebiotinyleerd PLL-PEG. B. Adhesive patronen met fluorescerende streptavidine worden afgedrukt op de gebiotinyleerde oppervlak hetzij als lijnen met microcontact afdrukken (b) of stippen met kroontjespen lithografie (b). c. D. Cellen en oplosbare chemoattractant gradiënt van 0-10% FBS worden geladen in de microfluïdische apparaat. Na cellen hechten aan het oppervlak, leven celmigratie meer RGD gradiënten op streptavidine tracks en in aanwezigheid van FBS gradiënten kunnen worden afgebeeld in het kanaal tussen de twee reservoirs.
Figuur 2. Cell lijm patronen (lijnen en punten) worden gegenereerd met twee verschillende druktechnieken een Fluorescent beeld van microcontact afdrukken streptavidine AlexaFluor350 tracks (Abs: 346 nm, Em: 442 nm; grijs).. On PLL-PEG beklede dekglaasjes. De microcontract afdrukken masker is gemaakt als lijnen 100 urn breed waren met 290 pm center naar center ruimte. b. de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van microcontact streptavidine tracks, zoals getoond in a, afgedrukt vijf afzonderlijke oppervlakken doorsneden van boven naar beneden. De gemiddelde breedte van de baan is 90 ± 6 pm en de gemiddelde hart-op-hart afstand is 293 ± 2 urn. C. Een helderveld beeld van streptavidine bevattende dots gemaakt met dip pen lithografie. De diameters van de punten varieerde 6-9 urn met 15 urn centrum tot centrum ruimte. Scale bars in een en c 100 urn.
Figuur 3. Biotine-4-fluoresceïne gradiënt (0 pg / pl - 0,03 pg / pl). Op glazen oppervlakken uniform gecoat met streptavidine biotine-4-fluoresceïne en biotine-RGD werden geladen in beide reservoir van de microfluïdische apparaat (sticky-Slide Chemotaxis 3D , Ibidi) dieverbonden door een 1 mm lang kanaal. Na 1 uur incubatie werd de inrichting gespoeld met PBS en opnieuw gevuld met PBS. Een. Mozaïek 60 beelden werden genomen met een totale lengte beeld 3072 pm en b de fluorescentie intensiteit werd gemeten over de lengte van het gehele mozaïek. Lineaire trendlijnen werden aangepast aan de fluorescentie-intensiteit van de RGD gradiënt in het kanaal geven.
Figuur 4. De fluorescentie intensiteit van een fluoresceïne gradiënt (0 uM - 1 uM) in de microfluïdische kanalen onmiddellijk na een setup (T = 0 uur) en b na 16 uur incubatie PBS met en zonder 1 uM fluoresceïne werd geladen links en rechts. reservoir van de microfluïdische apparaat (sticky-Slide Chemotaxis 3D, Ibidi), respectievelijk. De microfluïdische kanaal 1 mm in lengte enop positie 50 tot 1050 um. De gradiënt was stabiel gedurende tenminste 16 uur.
Figuur 5. HeLa celmigratie in een microfluïdisch kamer (Slide-sticky Chemotaxis 3D, Ibidi) met tegengestelde lijm gradiënt (RGD geïmmobiliseerd op streptavidine tracks) en oplosbare gradiënt (0-10% FBS). Een. Een representatief beeld van cellen in een kamer met microfluidics tegengestelde hellingen. Schaalbalk is 50 urn. B Time-lapse beelden van een cel die met een epifluorescentiemicroscoop (Nikon Ti-E). Beelden werden genomen op 15 min. intervallen voor 20 uur en cel traject (blauwe lijn) verkregen via de mobiele zwaartepunt positionering (ImageJ handleiding volgen plugin). Schaalbalk is 50 urn. C. Cell traject van zoals afgebeeld in b. Cel trajectories dat gemigreerd naar de hogere concentratie van oplosbare FBS zijn in rood weergegeven (N sporen = 36); cel trajecten die gemigreerd naar hogere concentraties van het aanklevende RGD worden getoond in zwart (N sporen = 14). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaat (sticky-Slide Chemotaxis 3D van Ibidi) om de effecten van chemisch gemodificeerde oppervlakken en chemoaantrekkende hellingen op celmigratie te bestuderen. Deze microfluïdische setup vereist geen stroom omdat de gradiënt wordt bepaald door diffusie langs de lengte van het kanaal. Dit is belangrijk omdat stroom kunnen verschillend beïnvloeden langzaam migrerende cellen zoals fibroblasten die stabiel focale adhesies en snelle migrerende cellen zoals de meeste leukocyten die kleine focale complexen en synapsen 26 te vormen. Shear stress van laminaire stroming kan invloed hebben op de stabiliteit van de cel adhesie aan lijm cues en cel-chemotaxis naar oplosbare signalen 27,28. We vonden verschillen in migratie gedrag tussen traag bewegende HeLa-cellen en snel bewegende J774 cellen zo laten zien dat de microfluïdische setup is van toepassing voor zowel de hechtende en minder adherente celtypes. Dergelijke vergelijkingen ook revealed interessant verschil tussen celtypes in adhesie en migratie reacties op oppervlaktepatronen dat zowel lijm cues (RGD peptiden of fibronectine) en aangroeiwerende gebieden (PEG gebieden) bevatten.
Oppervlakte patronen werden gemaakt met microcontact afdrukken 29 en dip-pen lithografie 30,31. Microcontact afdrukken is een eenvoudige en relatief snel, reproduceerbaar patroon proces. De ontwerp en fabricage van de PDMS stempel, hetgeen bereikt wordt door fotolithografie, is betrokken en tijdrovend. Het voert ook zijn eigen beperkingen hebben kleine elementen (<5 pm) moeilijk te bereiken en afhankelijk van de verhouding van het patroon. Kortom, microcontact afdrukken is ideaal voor grote patronen tot honderden micron grootte en in experimenten, waar dezelfde patronen moeten gemaakt vele malen. Anderzijds kan dip pin lithografie worden gebruikt micron tot nanoscaled figuren genereren. Het is meer geschikt voor het afdrukken dotsdan lijnen, kan hoewel lijnen worden vervaardigd. Dip pin lithografie maakt een grotere vrijheid in patroonvormen, aangezien er geen noodzaak voor prefab maskers, masters of stempels. De snelheid van de patroon verloopt traag, waardoor afdrukken van grote gebieden omslachtig en toegang tot een gespecialiseerd instrument cruciaal. De twee patronen methoden relevant te onderzoeken, omdat de grootte en vorm van kleefmiddel cue kan beïnvloeden de organisatie en de distributie van biomechanische mechaniek celmigratie 32,33 reguleren. Bovendien, de beperking van de commerciële microfluïdische apparaat hier toegepast is dat de kanaallengte (1 uM) niet kan worden veranderd en zodat men kan niet de maximale steilheid van de lijm en oplosbare gradiënten. Als steilere hellingen nodig zijn, zou men moeten een microfluïdische apparaat te fabriceren met een kortere kanaal tussen de twee reservoirs. Een belangrijk voordeel van het protocol hier beschreven is het modulair ontwerp, zodat de verschillende surfaces, oppervlakchemie, patronen benaderingen en microfluïdische inrichtingen kunnen worden gecombineerd voor een groot aantal levende cellen imaging experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben geen commerciële belangen openbaar te maken.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de financiering van de Australian Research Council en de National Health en Medical Research Council van Australië en ook graag de dank Australian National Fabrication faciliteit voor de SU-8 meester voor de microcontact afdrukken. SHN wordt ondersteund door het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië en Universiti Sains Maleisië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
