Summary
生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。
Abstract
細胞が感知し、そのような細胞外マトリックスや成長因子などの水溶性の手がかりの糖タンパク質などの接着手がかりの高い濃度に向かって移動することができます。ここでは、ライブセルイメージングと互換性のあるマイクロ流体チャンバー内に接着剤及び水溶性の手がかりの対向するグラデーションを作成する方法を概説しています。ポリ-L-リジンおよびポリエチレングリコール（PLL-PEG）の共重合体は、カバーガラスを不動態と生体分子と細胞の非特異的吸着を防止するために採用されている。次に、マイクロコンタクトプリンティングまたはディップペンリソグラフィーは、接着手がかりとしてビオチン化ペプチドアルギニン - グリシン - アスパラギン酸（RGD）のためのポイントをアンカーとして機能するように不動態化された表面にストレプトアビジンのトラックを作成するために使用されます。マイクロ流体デバイスは、修正された表面上に配置され、ストレプトアビジントラックに接着手がかり（100％、0％、RGDにRGD）の勾配を作成するために使用されます。最後に、同じマイクロ流体デバイスは、化学誘引成功のグラデーションを作成するために使用され接着剤手がかりの勾配の反対方向に可溶手がかりとしてウシ胎児血清（FBS）、hも付きます。
Introduction
監督細胞遊走は、多くの細胞の基本的な財産であり、胚発生、感染防御、創傷治癒を含む多くの正常な生理学的プロセスの重要な側面である。加えて、細胞遊走はまた、血管疾患、腫瘍細胞の転移および慢性炎症の1,2のような多くの疾患において重要な役割を果たしている。古典的な細胞移動の状態が-偏光、突起伸展性、接着性、力発生とリア撤回の形成は-一般的に3,4を受け入れており、信号の統合が調整されることによって時空のメカニズムを解明することは、より困難になっています。
細胞外マトリックス（ECM）は、細胞接着のための基質として機能し、固有の化学的および物理的な5 6多様性を通じて、セルナビゲーション7,8のための方向手がかりを提供しています。これらの接着剤の合図9、可溶性因子10月12日に加えて、</ sup>のようなケモカインおよび増殖因子としては、化学誘引物質受容体とその下流motogenicシグナリングを介して導か細胞遊走を誘導することができる。現在、このような受容体チロシンキナーゼ（RTK）などの関与と接着受容体（ すなわち、インテグリン）または化学誘引物質受容体を介したシグナル伝達、かどうかは知られていない、支配的である。また、それは受容体系の階層は特定の細胞型であるかどうか知られています。
生細胞顕微鏡、バルクアッセイではアクセスできませんし、固定化された13,14及び可溶性手がかり15 16の勾配を生成するマイクロ流体デバイスと組み合わせることができる豊富な情報を提供します。ここで説明する方法は簡単に細胞生物学研究室（ 図1）で実施可能であることを細胞遊走のイメージングアッセイを作成するには、市販のマイクロ流体室と連携して、表面改質のためのシンプルで確立された一連の手順を利用しています。組み立てマイクロ流体デバイスは、ガラス17に匹敵すると拡散性分子の勾配は少なくとも16時間安定している光学特性を持っています。システムは、落射蛍光顕微鏡と高度な技術を使用することができます。他の走化性のセットアップ18とは異なり、このシステムは徐々に移行し、接着細胞を記録するのに適しています。重要なのは、システムがモジュール化されており、簡単に代替接着剤や水溶性遊走の手がかりと様々な種類の細胞の検査の導入が可能です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。 PLL-PEG-ビオチンとカバーガラスのパッシベーション
このステップは、細胞がmicrocontract印刷（ステップ2-3a）またはディップペンリソグラフィー（ステップ3b）で作成されたガラスカバースリップ上の特定の領域上に付着し、移行するように、表面を不動態化するために設計されています。不動態化のために、ポリ-L-リジン（PLL）とポリエチレングリコール（PEG）との共重合体は、PEG分子の20％がビオチン（PLL-PEG-ビオチン）にグラフトされた使用されています。
- カバーガラス（18ミリメートル×18ミリメートル）、100％エタノールでラック内の水没、それらをきれいにし、30分間超音波処理浴中にラックを配置します。空気中または窒素気流下でカバーガラスを乾かします。
- 次に、1MのNaOHで30分間、カバーガラスを超音波洗浄します。その後慎重に1.5リットルのMilli-Q H 2 Oを入れたビーカーにラックを浸漬することにより、ガラス表面をすすぐすすぎ工程に新鮮なのMilli-Q H 2 Oの各時間を使って3回繰り返します。でカバーガラスを乾燥60℃のオーブン℃の
- きれいなガラスの場所の半分が部分的にH 2 Oに満ちた24ウェルプレートで作られている湿潤チャンバー内に個別にカバースリップ各ガラスカバースリップ上のPBS中のPLL-PEG-ビオチン（1 mg / ml）を15μlのドロップします。残りのきれいなガラスカバースリップの残りの半分を取り、慎重にサンドイッチPEG溶液を。湿潤チャンバーで1時間カバースリップのままにしておきます。 PEG-被覆表面をこすることなく、静かに互いから離れ挟まカバーガラスをスライドさせたMilli-Q H 2 Oでそれらを洗い流す水は、PEG処理面上で容易にスライドさせて外してください。必要であれば、処理された表面とペーパータオルの上で空気乾燥したカバーガラスは上向き。さらに使用するまで真空デシケーター中でカバーガラスを格納します。
2。マイクロコンタクトプリント用のスタンプの作製
我々は、不動態化されたカバーガラス上にパターンストレプトトラックに2つのプロセスについて説明します。最初のものは、マイクrocontact印刷は、一般的にPDMSスタンプが鋳造されているからシリコンマスターの製作が必要になります。我々のケースでは、PDMSスタンプ上のパターンは、25μmの特徴高さが290μmの中心から中心までを離間さ100μmの幅の線である。以下に、我々は適切なシリコンマスター（ステップ2.1から2.3まで）とPDMSスタンプ（ステップ2.4）を製造する方法を簡単に説明します。しかし、カバーガラス上にタンパク質パターンを印刷するのに適している文献19から23に記載のマイクロコンタクトプリンティングのための複数のプロトコルがあります。マスターズはまた、カスタムメイドや商業的供給源から購入することができます。
- ミリQ、H 2 Oで徹底的に10回、20分間ウェーハをすすぐ。：まず、ピラニア溶液（硫酸のvと30％過酸化水素3時01 v）中でインキュベートすることにより、シリコンウェハ（4 "直径）をきれいに150℃のオーブンでウェハを乾燥°CO / N
- 100％イソプロピルアルコールに続いて、100％アセトンできれいにし、乾燥させたシリコンウェーハを洗浄します。次のGM1070 SU-8フォトレジスト（Gersteltec Sarlは）3,100 rpmでウェハ上にスピンコート2ミリリットル40秒間は、25μmの厚さの層を作成することができます。次いで、試料を95℃でさらに5分間続く5分間℃における65℃のホットプレート上で焼かれる
- 所望のパターン（Quintel Q6000マスクアライナを使用するなどして）、フォトマスクの下で60秒間紫外線にSU-8フォトレジストを露出させ、ベーキング処理は2.2で説明する繰り返し。その後、サンプルを4分、100％のイソプロピルアルコールで洗浄し、窒素気流下で乾燥するため、SU-8の開発者（Gersteltec Sarlは）でウェーハを浸漬することにより開発されています。紫外線に露出していなかったSU-8フォトレジストの領域は、このようにPDMSスタンプの逆パターンを作成して、削除されます。
- 次のステップは、シリコンマスターからPDMSスタンプをキャストすることです。まず、徹底的にエラストマーポリマー10部（シルガード184）と硬化剤1部（w / w）を混ぜます。任意の気泡、脱気真空ラインに接続されたデシケーター中に混合物を削除するには1時間。次に、高さが約1cmにシャーレ内のシリコンマスター上にPDMSエラストマーを注ぎ、1時間で70℃のオーブンで、マスターとPDMSの混合物を硬化させる。最後に、PDMSスタンプを、シリコンマスターから削除され、大きさにカットされています。
3。非アクティブ化されたカバーガラス上にパターニングストレプトアビジンまたは接着手掛り
カバーガラスを不動態化した後、タンパク質パターンがマイクロコンタクトプリント（ステップ3a）またはディップペンナノリソグラフィー（ステップ3b）がプリントされています。我々のケースでは、ストレプトアビジンは、RGD勾配（ステップ4）の基礎を形成する線として印刷されます。同じ手順を、また、接着剤パターンを作成するためにマトリックスタンパク質を印刷するために使用することができます。
表面への生体分子のパターニングのためのマイクロコンタクトプリンティングに代わる方法は、ディップペンリソグラフィーです。ディップペンリソグラフィーでは、カンチレバーが表面に少量の溶液を転送するために使用されています。カンチレバーの大きさは、vソリューションのiscosityは、表面上にカンチレバーの接触時間、印刷室の表面や湿度の疎水性は、プリント機能のサイズを決定します。この方法の利点は、マスターと切手を製作する必要がないように、異なるパターンは、それぞれの実験のために印刷することができることである。欠点は、それが与えられたパターンをプリントし、ディップペンリソグラフィーは、多くの研究室では使用できない可能性が専門機器を必要とすることに時間を要することです。我々が使用したディップペンリソグラフィー機器はBioforceナノサイエンスからNanoeNablerだった。ここで、我々はSPT10カンチレバーを使用しているため、直径<10μmであった小さなドットを印刷した。
3A。マイクロコンタクトプリント（μCP）法
- きれいにし、PDMSスタンプをより親水性にし、1.5時間のための紫外線とオゾン（Bioforceナノサイエンスから例えば、UVオゾンProcleaner）のPDMSスタンプのパターン化された側を治療する。別の方法として、プラズマを使用同じ目的のために短い時間のためのクリーナー。このプロセスは、印刷プロセスを改善し酸化PDMS表面24を作成します 。
- ただちに、オゾンやプラズマ処理後、PDMSスタンプ上に10μlのストレプトアビジン（PBS中1 mg / ml）を広げ、湿潤チャンバーで1時間放置（そのような部分的に充填された6ウェルプレートのような、ステップ1.3を参照） 。トラックは、蛍光顕微鏡下で表示する必要がある場合、例えばストレプトアビジン-AlexaFluor350としてフルオロフォアにコンジュゲートしているストレプトアビジンを使用しています。
- ティッシュペーパーと空気で約1分のスタンプを乾かすとスタンプから過剰ストレプトアビジンを削除します。軽くPLL-PEG-ビオチンでコーティングされたガラスカバースリップ上にスタンプを押します。
- 蛍光ストレプトアビジンがステップ3.a2で使用された場合は、落射蛍光顕微鏡下で使用してパターンを調べます。デシケーターで印刷面を保管してください。
図3b。ディップペンリソグラフィー
- まず、1 mg / mlのストレプトアビジンまたはSTREの1部を混ぜてグリセリン10部（v / v）でptavidin-AlexaFluor350とカンチレバーに混合液5μlをロードします。ディップペンリソグラフィー装置の取扱説明書で説明されるように、印刷プロセスを開始します。印刷速度を調整し、約5μmのスポットサイズを小さくするには、表面への表面やカンチレバーの垂直距離でカンチレバーの時間にお問い合わせください。 図2cに示す例では、ドットは行10〜15μmに設定カラム分離に沿って印刷されました。この距離は、お互いに併合からドットを防止するのに十分であるが、ほとんどの顕微鏡設定でビューの1つのフィールドに複数のドットを表示することができます。
- デシケーターで印刷面を保管してください。
4。ストレプトアビジン - パターン表面上に接着剤グラデーションを作成する
我々は、ストレプトアビジン（ 図3）または共同で被覆されたカバーガラス上にビオチン-RGDの接着グラデーションを作成する不動態化されたカバーガラス上ntainストレプトパターン（ 図5）。表面のグラデーションを作成するために、我々は受動拡散によって安定したソリューションのグラデーションを作成し、市販のマイクロ流体デバイスを（Ibidiからスティッキスライド走3Dと呼ばれる）を使用しました。ストレプトアビジンの結合部位に対して競合するために、我々は（ 図1を参照）のRGDに共役ではありませんでしたビオチン-RGDとビオチンの対向する2つのグラデーションを採用。
- スティッキスライド走3Dデバイスの粘着面上にストレプトアビジン被覆またはパターン化されたカバーガラスを接着。数時間のために漏れがないことを確認するには、デバイスのエッジは温めワセリンの薄い層で、パラフィンワックス1部（w / w）であるワセリン1部の混合物の第2層で封止されている。
- チャンネル内の6μlのPBSで機器のチャンネルを埋める。その後PBSと70＆mの0.03μg/μLのビオチン-4-フルオレセインの70μlの2つのリザーバを埋めるU; 0.03μg/μLのそれぞれPBSにビオチン-RGDのリットル。 1時間暗所でRTでサンプルをインキュベートする。
- ビオチンソリューションを外し、まだPBSで二回マイクロ流体デバイスに接続されている間、慎重に表面をすすいでください。接着剤グラデーションの方向をマークし、必要に応じて、4℃でPBSで記入した装置を格納しますが、デバイスが乾燥しないようにしてください。必要に応じて、蛍光顕微鏡を用いて接着剤勾配を分析します。
5。ライブセルイメージングのための蛍光団を有する細胞のラベリング
細胞を蛍光顕微鏡下で細胞の追跡を支援する蛍光色素で標識されています。一般的なプローブは、蛍光オルガネラマーカー、細胞核にラベルを付けるようSYTO 64レッドです。そうするためには、細胞をまず45分間培養培地中の1μMのSYTO 64レッドと一緒にインキュベートし、PBSで3回洗浄し、最後にPBSでさらに3回洗浄する。細胞はすべきではないことに注意してください長時間のPBS中に維持した。
細胞追跡のための代替染料は細胞質を染色CellTrackerシリーズであり、細胞遊走と分裂の際に保持されます。蛍光融合タンパク質を用いた細胞のトランスフェクションは、移行時には、目的のタンパク質の細胞内分布を記録する場合に特に便利です。有機色素よりしかし、蛍光タンパク質は、典型的に、光漂白剤より速く、長期的な観測ができないことがありますので。
6。マイクロ流体デバイスに可溶性グラデーションを持つ細胞のロード
- 蛍光標識された細胞数を数えると等しいセルの数値の2管に分割。例えば、10％ウシ胎児血清（FBS）で、低血糖ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）等の化学誘引物質を含有する培地で細胞の一つのチューブを洗浄し、再懸濁します。 0パーセントFBSを含むDMEM すなわち 、化学誘引せずにメディア内のセルの他のチューブを洗浄し、再懸濁します。最終濃度各チューブ内の細胞の5×10 5細胞/ mlである必要があります。
- マイクロ流体デバイス（ステップ4.3）からのすべてのソリューションを外し、顕微鏡ステージ上に置きます（ステップ7を参照）。 1貯水池と別のものにHeLa細胞を70μlの（10％FBSを含むDMEM中に5×10 5細胞/ ml）に細胞の70μlを（0％FBSを含むDMEM中に5×10 5細胞/ ml）を読み込みます。緩く蒸発を避けるために、貯水池の上にテープを配置します。表面の細胞は事前イメージングにプレインキュベートされる場合、それは細胞が勾配ない増殖培地中のデバイスにロードされることをお勧めします。次に、このデバイスを顕微鏡のステージ上に配置され、メディアは他の中で、10％FBSを1リザーバーとDMEMでFBSを含まない勾配メディアすなわち DMEMに置き換えられます。
7。細胞イメージングとデータ解析を生きる
- 顕微鏡（ニコンのTi-E）をオンにして、実験を開始する前に、少なくとも1時間のステージを温める。
- MICRのそのチャンネルを確認してくださいofluidicデバイスが視野にあり、細胞がフォーカスされている。このような露光時間と蛍光フィルター、細胞やトラックをキャプチャ明視野と蛍光の画像シーケンスだけでなく、時間ポイントと記録の長さ（ 例えば 、16時間毎に15分間）として画像収集パラメータを選択します。
- そのようなImageJのマニュアルトラッキングまたはIbidi走化および移行ツールとして適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
セルは渡り鳥の信号25を統合する方法を理解するために、我々は競合する接着剤と水溶性の勾配（ 図1）を使用する環境で移行することを蛍光顕微鏡での画像セルにメソッドを開発しました。蛍光ストレプトアビジンとビオチン化RGDが含まれていた接着剤のトラックがマイクロプリントトラックとディップペンリソグラフィー（ 図2）で作成されました。成功したマイクロコンタクトプリントは、接着トラックと防汚領域がはっきりと（ 図2b）を区別することができるトラックにわたる蛍光強度のラインプロファイルで示されます。ディップペンリソグラフィーと印刷されたドットは、丸みを帯びた、成功した印刷工程を示す形破れないように見える。表面の化学的性質と湿度は、印刷処理の結果に影響を与えます。一般的に言えば、より疎水性の表面は、より良い印刷結果です。
接着剤手がかりの勾配印刷されたトラックにビオチン-4 -フルオレセインをロードすることによって、単純なマイクロ流体デバイスで作成されたマイクロ流体室（ 図3）の反対側にビオチン-RGD。両方の分子がガラス表面上のストレプトアビジントラックに競合的に結合するので、RGDリガンドの固定化された勾配が生成されます。ビオチン/ビオチン-RGD溶液を除去した後、同一のチャンバーは、少なくとも16時間（ 図4）のためのマイクロ流体チャネル内で安定している水溶性の勾配を、導入するために使用することができます。
我々は、FBSが使用されていたために化学誘引物質勾配とチャンバー内にHeLa細胞を導入しました。低密度で、HeLa細胞は、優先的に接着し、ストレプトアビジン/ RGDトラック（N個のセル = 50）に移行し、防汚、PEG領域（N個のセル = 19）は避ける。個々のセルの位置が16時間にわたって記録し、セルのトラッキングソフトウェアを用いて解析した。接着剤およびソリューションの実験でBLE勾配が（ 図5）を対向させ、個々の細胞の軌道はもっとHeLa細胞が走化性因子（ 図5cは、N 痕跡 = 36で赤のトレース）の源に向かって移行することを示した接着RGDの高濃度（黒に向かってより図5cのトレース、 トレース 、N = 14）。に対して（黒トレース）またはFBS勾配（各軌道の平均変位のx成分）の（赤のトレース）の方向に移動した細胞は0.1700±0.1172と0.2278±0.1280であった（P <0.0001、学生であったことの平均距離t検定）黒トレース（56.18±32.27μm）と赤のトレース（72.86±45.05μmの平均変位には統計的に有意な差はなかったが、P> 0.05、Studentのt検定）。 HeLa細胞は、17.47の平均速度±接着剤の両方の勾配の存在下で4.72ミクロン/ hrで移行キュー（ すなわち RGD）および可溶性キュー（ すなわち FBS）。データはそれゆえ、細胞が接着剤のトラックに本質的な移動速度を維持しながら、HeLa細胞に対して、FBS勾配は、移行の方向を決定することを示唆している。
我々はまた、マクロファージ細胞株J774の移行を評価している。接着剤および可溶性勾配が存在しない場合には、これらの細胞は、HeLa細胞（16.47±4.28ミクロン/時）よりはるかに高い速度（38.55±17.88ミクロン/時）でなく、0.059未満のJ774細胞変化の方向、すなわち持続性（方向性±0.091と移行）、マイクロコンタクトプリントフィブロネクチントラックでより頻繁に、HeLa細胞（0.57±0.12）よりも長さを追跡するために、変位の比として測定。 J774細胞はまた、HeLa細胞より依存接触少ない。 J774細胞の変位はフィブロネクチントラック（42.95±39.90μm）の上よりも、PEG領域（102.20±54.73μm）で高かった。さらに、J774細胞間葉からアメーバへの移行、そのメカニズムを変更することによって、異なる表面化学に適応するppeared。彼らは、HeLa細胞のためのものとして、結論としては、接着剤の手がかりは、J774細胞に同様に重要ではありません。両方の種類の細胞が優先的に可溶キューの方向に移行しました。
図1。蛍光ストレプトアビジンを含む移行細胞のイメージングは、接着剤対水溶性の手がかりの反対勾配に応答することができますマイクロ流体セットアップの製造プロセスの概略図。カバーガラスをビオチン化PLL-PEGで不動態化されますb。接着剤パターンは、ビオチン化に印字されてどちらディップペンリソグラフィーを（b '）を使用して、マイクロコンタクトプリンティング（b）を用いて線や点などの表面ますc。 d。細胞を介して作成されており、0〜10％の水溶性の化学誘引物質勾配はFBSはマイクロ流体デバイスにロードされます。細胞が表面に付着した後、ストレプトアビジントラックにRGD勾配上に細胞遊走を生きるとFBS勾配の存在下で、2つの容器を接続するチャネル内で撮像することができる。
図2。細胞接着パターン（線やドットが）は、2つの異なる印刷技術で生成することができるマイクロの蛍光画像は、ストレプトアビジン-AlexaFluor350トラック（ABS：346 nmであり、EM：442 nmで、灰色）がプリント。PLL-PEGコーティングされたカバーガラス上に。 microcontract印刷マスクは、290μmの中心からCEで100μm幅であったラインとして設計されましたに示すようNTERスペースがするb。マイクロコンタクトの平均蛍光強度は上から下に向かって断面として、5つの別々の面から、ストレプトアビジントラックを印刷した。トラックの幅の平均は90±6μmであり、平均の中心から中心までの間隔が293±2μmである。C。ディップペンリソグラフィーで生成されたストレプトアビジン含有ドットの明視野像。 15μmの中心から中心までの空間とは9μm - ドットの直径は6であった。でスケールバーと Cは100μmである。
図3。ビオチン-4 -フルオレセイン勾配（0μg/μLの- 0.03μg/μLの）均一にストレプトアビジンでコーティングされたガラス表面上のビオチン-4 -フルオレセインおよびビオチン-RGDは、マイクロ流体デバイス（スティッキスライド走3Dのどちらかのリザーバ内にロードされた、Ibidi）であること1ミリメートル長いチャネルで接続されています。 1時間インキュベーションした後、デバイスをPBSでリンスし、PBSで補充。60モザイク画像は画像全体の長さ3072μmおよびbで撮影された蛍光強度は全体モザイクの長さにわたって測定した。線形トレンドラインは、チャネル内のRGD勾配を示すために、蛍光強度に適合させた。
図4。フルオレセイン勾配（0μM - 1μM）の蛍光強度の微小流体チャネルで直ちに16時間培養した後、セットアップ（T = 0時間）とbをPBS 後がなく、1μMのフルオレセインは、左と右からロードされました。マイクロ流体デバイス（スティッキスライド走3D、Ibidi）、それぞれの貯水池。微小流体チャネルは、1の長さはmmである位置50〜1050μmので見出される。勾配は、少なくとも16時間安定であった。
図5。粘着勾配（ストレプトアビジントラックにRGD固定化）および可溶性勾配（0-10％FBS）を反対とマイクロフルイディクス室（スティッキスライド走3D、Ibidi）のHeLa細胞遊走。マイクロ流体チャンバー内の細胞の代表的なイメージを持つグラデーションに反対。スケールバーは50μmである。落射蛍光顕微鏡（ニコンのTi-E）で撮影した細胞の bタイムラプス画像。画像は20時間とセルの重心位置（ImageJのマニュアルトラッキングプラグイン）を介して得られた細胞の軌跡（青線）で15分間隔で撮影された。スケールバーは50μmである。C。携帯軌跡画像からBに示すように。セルTR可溶性のFBSの濃度が高い方に移行ajectories赤（N個のトレース = 36）で示されています。接着RGDの濃度が高い方に移行し、細胞の軌跡は、（N· トレース = 14）が黒色で表示されます。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルでは、化学的に修飾された表面および細胞遊走に対する誘引物質勾配の影響を調査するために、市販のマイクロ流体デバイス（Ibidiからスティッキスライド走3D）を使用しました 。勾配は、チャネルの長さに沿って拡散することによって確立されるので、この設定では、マイクロ流体の流れを必要としません。流れは差ような安定した接着斑と小焦点複合体とシナプス26を形成するほとんどの白血球のような高速の遊走細胞を形成する繊維芽細胞のようにゆっくりと移行する細胞に影響を与える可能性があるため、これは重要です。層流からせん断応力は、可溶性手がかり27,28に向かって接着手がかりと細胞走化性への細胞接着の安定性に影響を与える可能性があります。そこで、本稿では、低速移動HeLa細胞およびそれによってマイクロ流体セットアップは両方の付着が少なく、接着細胞のタイプに適用可能であることを示す動きの速いJ774細胞との間の移行挙動の違いを発見した。このような比較はまたreveale接着剤キュー（RGDペプチドまたはフィブロネクチン）と防汚領域（PEG領域）の両方が含まれて表面パターンへの接着と遊走応答における細胞タイプ間のd興味深い違い。
表面パターンは、マイクロコンタクトプリンティング29とディップペンリソグラフィー30,31で作成されました。マイクロコンタクトプリンティングはシンプルで比較的高速で再現性のパターニングプロセスである。しかし、フォトリソグラフィによって達成されたPDMSスタンプの設計および製造は、より複雑かつ時間がかかります。また、その小さな機能（<5μm）で独自の制限が導入されて達成し、パターンのアスペクト比に依存することは困難である。要するに、マイクロコンタクトプリントはミクロンサイズの何百ものと同じパターンを何度も作成する必要があります実験でアップ大パターンに最適です。一方、ディップピンリソグラフィは、ナノスケールのパターンにミクロンを生成するために使用することができます。それは印刷のドットに、より適しているとラインよりも、線が製造することができるが。プレハブマスク、マスターやスタンプの必要がないようにディップピンリソグラフィは、パターンの設計自由度を与える。しかし、パターニングプロセスの速度が煩雑で専門的な楽器へのアクセス大きな領域の印刷が不可欠であること、遅いです。接着剤キューパターンの大きさや形状は、細胞遊走を調節する32,33生体力学機械の組織と分布に影響を与えるため、2つのパターニング方法は、検討のために関連しています。さらに、ここで用いた商用マイクロ流体デバイスの制限は、チャネル長（1μm）は変更できないので、1は、接着剤と水溶性の勾配の最大の急峻性を制御することはできないからです。急峻な勾配が必要な場合は、1には2つの容器の間に短いチャネルとマイクロ流体デバイスを作製する必要があるでしょう。ここで説明されたプロトコルの主要な利点は、異なるので、suのモジュラー設計であるrfaces、表面化学、パターニングアプローチとマイクロ流体デバイスは、ライブセルイメージング実験の幅広い組み合わせることができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我々は、開示することは商業的な利害関係はありません。
Acknowledgments
著者らは、オーストラリアの研究評議会と国民健康オーストラリアの医学研究評議会から資金を認め、また感謝したい マイクロコンタクトプリント用のSU-8のマスターのためにオーストラリア国立加工施設。 SHNは、高等教育マレーシアとマレーシア科学大学省によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A.
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A.
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A.
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
