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Bioengineering

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग सेल प्रवासन के लिए चिपकने वाला और घुलनशील Gradients बनाना

Published: April 4, 2013 doi: 10.3791/50310
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 1
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

Summary

जीना सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक माइक्रोस्कोपी कक्ष में घुलनशील चिपकने वाला और gradients की विधानसभा के लिए एक विधि का वर्णन है. इंजीनियर पर्यावरण समाधान gradients के साथ antifouling सतहों और चिपकने वाला पटरियों को जोड़ती है और इसलिए एक मार्गदर्शन cues के रिश्तेदार महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है.

Abstract

कक्ष भावना और कोशिकी मैट्रिक्स और विकास कारकों जैसे घुलनशील संकेत के glycoproteins जैसे चिपकने वाला संकेत के उच्च सांद्रता की ओर पलायन कर सकते हैं. यहाँ, हम microfluidic एक कक्ष है, जो जीना सेल इमेजिंग के साथ संगत है में घुलनशील चिपकने वाला और संकेत के का विरोध gradients बनाने के लिए एक विधि की रूपरेखा. पाली एल lysine और polyethylene glycol (पीएलएल खूंटी) के एक copolymer गिलास coverslips passivate और गैर विशिष्ट biomolecules और कोशिकाओं के सोखना को रोकने के लिए कार्यरत है. अगला, microcontact मुद्रण या डुबकी कलम लिथोग्राफी streptavidin passivated सतहों पर पटरियों बनाने के लिए चिपकने वाला संकेत के रूप biotinylated पेप्टाइड arginine-glycine एसपारटिक एसिड (RGD) के लिए अंक के प्रस्तोता के रूप में सेवा करने के लिए किया जाता है. एक microfluidic युक्ति संशोधित सतह पर रखा जाता है और streptavidin पटरियों पर चिपकने के संकेत (100% 0% RGD RGD) की ढाल बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. अंत में, एक ही microfluidic डिवाइस एक chemoattractant सफलता की एक ढाल बनाने के लिए प्रयोग किया जाता हैभ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) चिपकने cues के ढाल के विपरीत दिशा में घुलनशील क्यू के रूप में, के रूप में ज.

Introduction

निर्देशित सेल प्रवास कई कोशिकाओं की एक मौलिक संपत्ति है और कई भ्रूण के विकास, संक्रमण के खिलाफ रक्षा और घाव भरने सहित सामान्य शारीरिक प्रक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण पहलू है. इसके अलावा, सेल प्रवास भी रोग, ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस और जीर्ण सूजन 1,2 के रूप में कई रोगों में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. जबकि सेल प्रवास के शास्त्रीय राज्यों ध्रुवीकरण, फलाव विस्तार, आसंजन, बल पीढ़ी और रियर त्याग के गठन 3,4 - आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं, spatiotemporal तंत्र है जिसके द्वारा संकेत एकीकरण समन्वित है की व्याख्या और अधिक चुनौतीपूर्ण हो गया है.

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोशिका आसंजन के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है, और 5 निहित रासायनिक और भौतिक 6 विविधता के माध्यम से, सेल 7,8 नेविगेशन के लिए दिशात्मक संकेत प्रदान करता है. इन चिपकने वाला 9 संकेत, घुलनशील कारकों 10-12 के अलावा </> Chemokines और वृद्धि कारकों के रूप में समर्थन chemoattractant रिसेप्टर्स और उनके नीचे की ओर motogenic सिगनल के माध्यम से निर्देशित सेल प्रवास के लिए प्रेरित कर सकते हैं. वर्तमान में, यह ज्ञात नहीं है कि क्या सगाई और आसंजन (यानी integrins) रिसेप्टर्स या chemoattractant रिसेप्टर्स, रिसेप्टर tyrosine kinase (RTK) के रूप में के माध्यम से संकेत, प्रमुख हैं. न ही यह जाना जाता है कि रिसेप्टर प्रणालियों के पदानुक्रम सेल प्रकार विशिष्ट हैं.

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी जानकारी का खजाना है कि थोक assays में सुलभ नहीं है और microfluidic उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है immobilized 13,14 और घुलनशील 16 15 cues के gradients उत्पन्न करने देता है. यहाँ वर्णित विधि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic सेल प्रवास है कि आसानी से एक कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशाला (1 चित्रा) में लागू किया जा सकता है के लिए एक इमेजिंग परख के लिए बनाने कक्ष के साथ संयोजन के रूप में सतह संशोधन के लिए सरल और स्थापित कदम की एक श्रृंखला का उपयोग किया जाता है. इकट्ठेयुक्ति microfluidic ऑप्टिकल गुण है कि 17 गिलास तुलना कर रहे हैं और कम से कम 16 घंटे के लिए diffusible अणुओं की gradients स्थिर रहे हैं. प्रणाली epifluorescence माइक्रोस्कोपी और उन्नत तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य chemotaxis setups 18 के विपरीत, इस सिस्टम धीरे धीरे पलायन, पक्षपाती कोशिकाओं रिकॉर्डिंग करने के लिए उपयुक्त है. महत्वपूर्ण बात यह प्रणाली है, मॉड्यूलर और आसानी से वैकल्पिक चिपकने वाला या घुलनशील प्रवास cues और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की परीक्षा की शुरूआत की अनुमति देता है.

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Protocol

1. PLL-खूंटी बायोटिन साथ ग्लास Coverslips Passivation

इस कदम के लिए सतह passivate ताकि कोशिकाओं का पालन करना और कांच coverslip पर विशिष्ट क्षेत्रों कि microcontract (चरण 2 3a) मुद्रण या डुबकी कलम लिथोग्राफी (3b चरण) के साथ बनाया जाता है पर विस्थापित करने के लिए बनाया गया है. Passivation के लिए, एक (पीएलएल) पाली एल lysine और polyethylene glycol (खूंटी) के सह बहुलक प्रयोग किया जाता है जिसमें खूंटी अणुओं की 20% (पीएलएल खूंटी बायोटिन) बायोटिन grafted कर रहे हैं.

  1. कांच coverslips (18 मिमी x 18 मिमी), उन्हें 100% इथेनॉल में एक रैक में डूब साफ करने के लिए और 30 मिनट के लिए एक sonicating स्नान में रैक जगह. हवा में नाइट्रोजन की एक धारा के तहत कांच या coverslips सूखी.
  2. अगला, 1 एम NaOH में 30 मिनट के लिए कांच coverslips sonicate. बाद में ध्यान से एक 1.5 एल मिल्ली क्यू एच 2 ओ के साथ भरा बीकर में रैक सूई से सतहों कांच कुल्ला Rinsing प्रक्रिया ताजा मिल्ली क्यू एच 2 हे हर बार का उपयोग तीन बार दोहराएँ. में कांच coverslips सूखी60 पर एक ओवन डिग्री सेल्सियस
  3. साफ कांच की जगह आधी एक नम चैम्बर, जो एक 24-अच्छी तरह से आंशिक रूप से एच 2 ओ के साथ भरा थाली से बना है में व्यक्तिगत coverslips प्रत्येक गिलास coverslip पर 15 μl पीबीएस में PLL खूंटी बायोटिन (1 मिलीग्राम / एमएल) की ड्रॉप. शेष साफ कांच coverslips के अन्य आधा लो और ध्यान से खूंटी समाधान सैंडविच. Coverslips उमस भरे कक्ष में 1 घंटे के लिए छोड़ दें. Sandwiched coverslips धीरे एक दूसरे से दूर और खूंटी में लिपटे सतह scraping बिना स्लाइड उन्हें मिल्ली क्यू एच 2 ओ के साथ कुल्ला पानी बंद खूंटी इलाज पक्ष पर आसानी से स्लाइड चाहिए. यदि आवश्यक हो, हवा सूखी कागज तौलिया पर इलाज की सतह के साथ कांच coverslips ऊपर का सामना करना पड़ रहा है. कांच coverslips आगे उपयोग तक एक निर्वात desiccator में स्टोर.

2. Microcontact मुद्रण के लिए टिकटों का निर्माण

हम passivated कांच coverslips पर पैटर्न streptavidin पटरियों दो प्रक्रियाओं का वर्णन. पहले एक, microcontact मुद्रण, आम तौर पर एक सिलिकॉन मास्टर जिसमें से एक PDMS स्टांप डाली है के निर्माण की आवश्यकता है. हमारे मामले में, PDMS टिकट पर पैटर्न 100 सुक्ष्ममापी चौड़ा लाइनों है कि 25 सुक्ष्ममापी की एक विशेषता ऊंचाई के साथ केंद्र के लिए केंद्र 290 सुक्ष्ममापी स्थान दिया गया है. नीचे, हम संक्षेप में वर्णन है कि कैसे एक उपयुक्त सिलिकॉन (2.1-2.3 चरण) मालिक और PDMS स्टांप (2.4 चरण) बनाना. हालांकि, वहाँ microcontact मुद्रण के लिए एकाधिक प्रोटोकॉल 19-23 साहित्य, जो कांच coverslips प्रोटीन पैटर्न पर मुद्रण के लिए उपयुक्त हैं में वर्णित हैं. मास्टर्स भी कस्टम बनाया जा सकता है और वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा है.

  1. सबसे पहले, पिरान्हा समाधान (3:1 ध्: सल्फ्यूरिक एसिड और 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के वी) में यह incubating सिलिकॉन वफ़र (4 "व्यास में) साफ 20 मिनट के लिए वफ़र कुल्ला MilliQ एच 2 ओ के साथ अच्छी तरह से 10 बार. 150 पर एक ओवन में वफ़र सूखी ° सीओ / एन
  2. 100% एसीटोन के साथ स्वच्छ और सूखे सिलिकॉन वफ़र, 100% isopropyl शराब से पीछा कुल्ला. अगलास्पिन कोट 3100 rpm पर वफ़र पर 2 GM1070 SU-8 photoresist (Gersteltec SARL) के 40 सेकंड के लिए मिली एक 25 मीटर मोटी परत बनाने के लिए. नमूना तो 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 95 पर एक और 5 मिनट के द्वारा पीछा मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म थाली पर पकाया
  3. पराबैंगनी प्रकाश में वांछित पैटर्न (एक Quintel Q6000 मुखौटा aligner का उपयोग कर उदाहरण के लिए) के साथ एक photomask के तहत 60 सेकंड के लिए सु 8-photoresist बेनकाब और फिर पाक प्रक्रिया 2.2 में वर्णन. तो नमूना SU-8 डेवलपर (Gersteltec SARL) में 4 मिनट, 100% isopropyl शराब में rinsed और नाइट्रोजन प्रवाह के तहत सूखे के लिए वफ़र immersing द्वारा विकसित की है. SU 8-photoresist कि पराबैंगनी प्रकाश में उजागर नहीं किया गया था, इस प्रकार क्षेत्र निकाल दिया जाता है PDMS टिकट के व्युत्क्रम पैटर्न बनाने.
  4. अगले कदम के लिए सिलिकॉन मास्टर से एक PDMS टिकट डाली है. सबसे पहले, elastomer prepolymer के 10 भागों (184 Sylgard) के साथ अच्छी तरह से इलाज के एजेंट के भाग 1 (w / w) मिश्रण. किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए, degas एक एक वैक्यूम लाइन जुड़ी desiccator में मिश्रण1 घंटा के लिए. अगले, एक पेट्री डिश के अंदर सिलिकॉन मास्टर पर ऊंचाई में 1 सेमी के बारे PDMS elastomer और 70 पर एक ओवन डिग्री सेल्सियस में 1 घंटे के लिए मास्टर और PDMS मिश्रण का इलाज के लिए डालना. अंत में, PDMS स्टांप सिलिकॉन मास्टर से निकाल दिया जाता है और आकार में कटौती.

3. Patterning या ग्लास Coverslips passivated पर streptavidin चिपकने वाला Cues

कांच coverslips passivating बाद, प्रोटीन पैटर्न microcontact मुद्रण (चरण 3a) या डुबकी कलम लिथोग्राफी (3b चरण) के साथ मुद्रित कर रहे हैं. हमारे मामले में, streptavidin लाइनों, जो RGD gradients (4 चरण) के लिए आधार के रूप में के रूप में मुद्रित किया जाता है. एक ही प्रक्रिया भी मैट्रिक्स प्रोटीन मुद्रण के लिए चिपकने वाला पैटर्न बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Microcontact मुद्रण सतहों पर biomolecules के patterning के लिए एक वैकल्पिक पद्धति डुबकी कलम लिथोग्राफी है. डुबकी कलम लिथोग्राफी में, एक ब्रैकट सतह पर समाधान की एक छोटी मात्रा में स्थानांतरित किया जाता है. cantilevers, वी के आकारसमाधान के iscosity ब्रैकट की सतह पर समय संपर्क, सतह और मुद्रण कक्ष में नमी की hydrophobicity मुद्रित सुविधाओं के आकार का निर्धारण. इस पद्धति का लाभ यह है कि प्रत्येक प्रयोग के लिए अलग पैटर्न मुद्रित किया जा सकता है, के रूप में कोई स्वामी और डाक टिकटों के निर्माण की जरूरत है. नुकसान यह है कि किसी दिए गए पैटर्न प्रिंट और डुबकी कलम लिथोग्राफी एक विशेषज्ञ उपकरण है कि कई प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हो सकता की आवश्यकता है कि यह अब लगता है. डुबकी कलम लिथोग्राफी साधन है कि हम इस्तेमाल BioForce नेनौसाइंस से NanoeNabler था. यहाँ, हम छोटे डॉट्स कि व्यास में <10 सुक्ष्ममापी थे, जिसके लिए हम SPT10 cantilevers छपी.

3a. Microcontact प्रिंटिंग तकनीक (μCP)

  1. स्वच्छ और PDMS स्टांप अधिक हाइड्रोफिलिक, एक और 1.5 घंटे के लिए ओजोन यूवी (उदाहरण के लिए, BioForce नेनौसाइंस से यूवी ओजोन Procleaner) में PDMS टिकटों के नमूनों की ओर का इलाज. वैकल्पिक रूप से, एक प्लाज्मा का उपयोग करेंक्लीनर एक ही उद्देश्य के लिए एक कम समय के लिए. इस प्रक्रिया में एक ऑक्सीकरण PDMS 24 सतह, जो मुद्रण प्रक्रिया में सुधार बनाता है.
  2. ओजोन या प्लाज्मा उपचार के तुरंत बाद, जगह और PDMS टिकटों पर 10 μl streptavidin (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर) पीबीएस में फैला है और एक नम चैम्बर (जैसे एक आंशिक रूप से भरा 6 अच्छी तरह से थाली के रूप में 1.3 चरण देखें) में 1 घंटे के लिए छोड़ दें . यदि पटरियों फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे दिखाई जानी चाहिए, streptavidin कि streptavidin के AlexaFluor350 के रूप में एक fluorophore संयुग्मित है का उपयोग करें.
  3. टिशू पेपर और लगभग 1 मिनट के लिए टिकट शुष्क हवा के साथ टिकट से अतिरिक्त streptavidin निकालें. हल्के गिलास PLL खूंटी बायोटिन लेपित coverslip पर स्टांप प्रेस.
  4. यदि फ्लोरोसेंट streptavidin चरण 3.a2 में इस्तेमाल किया गया था, epifluorescence खुर्दबीन के नीचे का उपयोग कर पैटर्न की जांच. एक desiccator में मुद्रित सतहों स्टोर.

3b. डुबकी पेन लिथोग्राफी

  1. सबसे पहले, 1 मिलीग्राम / एमएल streptavidin या stre के भाग 1 मिश्रणग्लिसरॉल के 10 भागों (v / v) के साथ ptavidin AlexaFluor350 और ब्रैकट पर मिश्रण के 5 μl लोड. तब मुद्रण प्रक्रिया शुरू डुबकी कलम लिथोग्राफी साधन के आपरेशन मैनुअल में वर्णित के रूप में. लगभग 5 सुक्ष्ममापी हाजिर आकार को कम मुद्रण गति को समायोजित, सतह के लिए ब्रैकट की सतह या ऊर्ध्वाधर दूरी पर ब्रैकट समय संपर्क करें. चित्रा 2c में दिखाए गए उदाहरण में, डॉट्स पंक्ति और स्तंभ जुदाई 10-15 सुक्ष्ममापी सेट के साथ एक पंक्ति में मुद्रित किया गया. इस दूरी के लिए एक दूसरे में विलय से डॉट्स को रोकने के लिए पर्याप्त है, लेकिन सबसे खुर्दबीन सेटिंग्स के साथ देखने के एक ही क्षेत्र में कई डॉट्स की देखने की अनुमति देता है.
  2. एक desiccator में मुद्रित सतहों स्टोर.

4. Streptavidin पैटर्न सतहों पर चिपकने वाला gradients बनाना

कांच coverslips कि streptavidin (3 चित्रा) या सह के साथ लेपित हैं पर बायोटिन RGD चिपकने वाला gradients बनानेntain passivated कांच coverslips पर streptavidin पैटर्न (5 चित्रा). एक सतह ढाल बनाने के लिए, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic (चिपचिपा स्लाइड chemotaxis 3D Ibidi से कहा जाता है) डिवाइस है कि निष्क्रिय प्रसार द्वारा एक स्थायी समाधान ढाल बनाता है इस्तेमाल किया. Streptavidin बाध्यकारी साइटों के लिए प्रतिस्पर्धा है, हम बायोटिन RGD और बायोटिन के दो परस्पर विरोधी gradients कि RGD संयुग्मित (चित्रा 1 देखें) नहीं था कार्यरत हैं.

  1. चिपचिपा स्लाइड chemotaxis 3 डी डिवाइस के चिपचिपा पक्ष पर streptavidin लेपित या नमूनों गिलास coverslips पालन करें. यह सुनिश्चित करने के लिए है कि वहाँ कई घंटे के लिए कोई रिसाव है, डिवाइस के किनारों गरम वेसिलीन की एक पतली परत के साथ और वेसिलीन का हिस्सा 1 का एक मिश्रण का एक दूसरा पैराफिन मोम के भाग 1 (w / w) परत के साथ सील कर रहे हैं.
  2. चैनल में 6 μl पीबीएस के साथ डिवाइस के चैनल भरें. फिर पीबीएस और 70 मीटर में 70 μl 0.03 / छ μl बायोटिन-4-fluorescein के साथ दो जलाशयों को भरनेयू, 0.03 ग्राम की एल / μl बायोटिन RGD पीबीएस में, क्रमशः. 1 घंटे के लिए अंधेरे में आरटी पर नमूने सेते हैं.
  3. बायोटिन समाधान निकालें और ध्यान से सतह कुल्ला, जबकि अभी भी पीबीएस के साथ जुड़ी युक्ति microfluidic दो बार. चिपकने वाला ढाल की दिशा में चिह्नित करें और यदि आवश्यक हो, के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के साथ भरा उपकरण की दुकान है, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि डिवाइस बाहर सूखा नहीं है. यदि आवश्यक हो, एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ चिपकने वाला ढाल का विश्लेषण.

5. लाइव सेल इमेजिंग के लिए fluorophores के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग

कोशिकाओं फ्लोरोसेंट रंजक है कि फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे सेल ट्रैकिंग की सहायता के साथ लेबल रहे हैं. आम जांच फ्लोरोसेंट organelle मार्करों, जैसे Syto 64 लाल, जो सेल नाभिक लेबल हैं. ऐसा करने के लिए, कोशिकाओं 1 पीबीएस के साथ तीन बार धोया, तो 1 Syto सुक्ष्ममापी संस्कृति मीडिया में 45 मिनट के लिए 64 लाल के साथ incubated और अंत में पीबीएस के साथ एक और तीन बार धोया. कृपया ध्यान दें कि कोशिकाओं नहीं होना चाहिएपीबीएस में समय की लंबी अवधि के लिए रखा.

सेल पर नज़र रखने के लिए वैकल्पिक रंगों CellTracker श्रृंखला कि cytoplasm दाग कर रहे हैं और सेल प्रवास और विभाजन के दौरान बनाए रखा. फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक माइग्रेशन के दौरान विशेष रूप से ब्याज की एक प्रोटीन के subcellular वितरण रिकॉर्ड करने के लिए उपयोगी है. हालांकि, आम तौर पर तस्वीर ब्लीच कार्बनिक रंजक की तुलना में तेजी से फ्लोरोसेंट प्रोटीन कि लंबी अवधि टिप्पणियों तो संभव नहीं हो सकता है.

6. Microfluidics डिवाइस में एक घुलनशील ढाल के साथ कोशिकाओं की लोडिंग

  1. बराबर सेल नंबर की दो नलियों में fluorescently लेबल कोशिकाओं और विभाजन की गणना. धोने और chemoattractant युक्त कम ग्लूकोज Dulbecco 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के रूप में मीडिया के साथ कोशिकाओं के एक ट्यूब resuspend. धोने और chemoattractant 0% FBS के साथ यानी DMEM बिना मीडिया में कोशिकाओं के अन्य ट्यूब resuspend. अंतिम एकाग्रताप्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं के 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल होना चाहिए.
  2. Microfluidic युक्ति (4.3 चरण से) से सभी समाधान निकालें और यह मंच खुर्दबीन जगह (चरण 7 देखें). HELA कोशिकाओं के एक जलाशय और दूसरे में 70 μl (5 x 10 5 10% FBS DMEM में कोशिकाओं / मिलीलीटर) में कोशिकाओं के 70 μl (5 x 10 5 0% FBS DMEM में कोशिकाओं / मिलीलीटर) लोड. शिथिल वाष्पीकरण से बचने के लिए जलाशयों पर एक टेप जगह. यदि सतह पर कोशिकाओं पूर्व incubated इमेजिंग के लिए पहले से कर रहे हैं, यह उचित है कि कोशिकाओं के विकास मीडिया में डिवाइस में ढाल के बिना लोड कर रहे हैं. डिवाइस तो खुर्दबीन मंच पर रखा गया है और मीडिया के एक जलाशय और DMEM में ढाल FBS बिना मीडिया यानी DMEM के साथ दूसरे में 10% FBS के साथ बदल दिया है.

7. लाइव सेल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण

  1. माइक्रोस्कोप (Nikon तिवारी ई) पर स्विच और प्रयोग शुरू करने से पहले चरण में कम से कम 1 घंटा गर्म.
  2. सुनिश्चित करें कि माइकर के चैनलofluidic युक्ति देखने के क्षेत्र में है और कोशिकाओं को ध्यान में हैं. छवि जोखिम बार और फ्लोरोसेंट फिल्टर, उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति कि कोशिकाओं और पटरियों कब्जा की छवि अनुक्रम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय अंक और रिकॉर्डिंग लंबाई (उदाहरण के लिए 16 घंटे के लिए हर 15 मिनट) के रूप में इस तरह के अधिग्रहण पैरामीटर का चयन करें.
  3. ImageJ मैनुअल ट्रैकिंग या Ibidi chemotaxis और प्रवासन उपकरण के रूप में उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण.

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Representative Results

समझ कैसे सेल प्रवासी संकेतों 25 एकीकृत करने के लिए, हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी है कि प्रतिस्पर्धा चिपकने वाला और घुलनशील gradients (1 चित्रा) के साथ एक वातावरण में पलायन के साथ एक विधि छवि कोशिकाओं को विकसित किया है. चिपकने वाला पटरियों है है कि फ्लोरोसेंट streptavidin और biotinylated RGD निहित microcontact मुद्रित पटरियों और डुबकी कलम लिथोग्राफी (2 चित्रा) के साथ बनाया गया था. सफल microcontact मुद्रण प्रतिदीप्ति तीव्रता की पटरियों जहां चिपकने वाला पटरियों और विरोधी fouling क्षेत्रों स्पष्ट रूप से (चित्रा 2b) प्रतिष्ठित किया जा सकता भर लाइन प्रोफाइल संकेत दिया है. डुबकी कलम लिथोग्राफी के साथ छपी डॉट्स गोल आंसू दिखाई देते हैं, नहीं आकार का एक सफल मुद्रण प्रक्रिया का संकेत है. सतह के रसायन शास्त्र और नमी मुद्रण प्रक्रिया के परिणाम को प्रभावित करती है. सामान्यतया अधिक hydrophobic सतह है, बेहतर मुद्रण परिणामों.

चिपकने वाला cues के ढालमुद्रित ट्रैक पर एक साधारण microfluidics डिवाइस के साथ बायोटिन-4-fluorescein लोड हो रहा है और एक microfluidic चैम्बर (चित्रा 3) के विपरीत पक्ष में बायोटिन RGD द्वारा बनाया गया था. चूंकि दोनों अणुओं कांच की सतह पर streptavidin ट्रैक competitively बाँध, RGD ligands के एक immobilized ढाल उत्पन्न होता है. / बायोटिन बायोटिन RGD समाधान को हटाने के बाद, एक ही कक्ष एक घुलनशील ढाल है, जो कम से कम 16 घंटे (4 चित्रा) के लिए microfluidic चैनल के भीतर स्थिर है शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

हम चेंबर में एक chemoattractant ढाल, जिसके लिए FBS इस्तेमाल किया गया था के साथ HELA कोशिकाओं की शुरुआत की. कम घनत्व, HELA कोशिकाओं preferentially पालन और streptavidin / RGD (एन कोशिकाओं 50 =) पटरियों पर चले और विरोधी fouling खूंटी क्षेत्र (19 एन कोशिकाओं =) से परहेज. व्यक्ति की कोशिकाओं की स्थिति 16 घंटा से अधिक दर्ज की गई थी और एक सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया. एक प्रयोग में जहां चिपकने वाला और समाधानble gradients एक दूसरे (5 चित्रा) का विरोध कर रहे हैं, व्यक्ति की कोशिकाओं के trajectories पता चला है कि अधिक HELA कोशिकाओं chemoattractant (चित्रा 5c, एन = 36 निशान में लाल निशान) के स्रोत की ओर चले पक्षपाती RGD के उच्च सांद्रता (काला की ओर से चित्रा 5c, N = 14 निशान में निशान). औसत दूरी है कि (काला निशान) के खिलाफ या (लाल निशान) FBS ढाल (प्रत्येक प्रक्षेपवक्र की औसत विस्थापन के एक्स घटक) की दिशा में चले कोशिकाओं 0.1700 ± .1172 .2278 और .१२८० ±, क्रमशः (0.0001 <पी, छात्र था पी 0.05>, छात्र टी परीक्षण), टी परीक्षण) हालांकि औसत विस्थापन में काला निशान (56.18 ± 32.27 सुक्ष्ममापी) और लाल निशान (72.86 ± 45.05 सुक्ष्ममापी के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर था. HELA कोशिकाओं 17.47 की औसत गति ± 4.72 / चिपकने के दोनों ढाल की उपस्थिति में सुक्ष्ममापी घंटा के साथ विस्थापित(यानी RGD) क्यू और घुलनशील (यानी FBS) क्यू. डेटा इसलिए यह सुझाव है कि HELA कोशिकाओं के लिए, FBS ढाल प्रवास की दिशा निर्धारित करता है, जबकि सेल चिपकने वाला पटरियों पर एक आंतरिक माइग्रेशन गति को बनाए रखने.

हम भी बृहतभक्षककोशिका सेल J774 लाइन के प्रवास का आकलन किया है. चिपकने वाला और घुलनशील gradients के अभाव में, इन कोशिकाओं HELA कोशिकाओं की तुलना में बहुत अधिक (38.55 ± 17.88 सुक्ष्ममापी / घंटा) की गति (16.47 ± 4.28 सुक्ष्ममापी / घंटा) लेकिन कम दृढता J774 कोशिकाओं परिवर्तन दिशा यानी (.059 की दिशात्मकता ± 0.091 के साथ विस्थापित ), HELA कोशिकाओं microcontact मुद्रित fibronectin पटरियों पर (0.57 ± 0.12) की तुलना में लंबाई अधिक अक्सर से ट्रैक विस्थापन के अनुपात के रूप में मापा जाता है. J774 कोशिकाओं HELA कोशिकाओं से निर्भर भी संपर्क कर रहे हैं कम. J774 कोशिकाओं के विस्थापन fibronectin पटरियों (42.95 ± 39.90 सुक्ष्ममापी) पर से खूंटी क्षेत्रों (102.20 ± 54.73 मीटर) पर अधिक था. , J774 कोशिकाओं एक अलावाppeared mesenchymal से अमीबाभ प्रवास के अपने तंत्र को बदलने के द्वारा अलग सतह के रसायन शास्त्र के लिए अनुकूल है. अंत में, चिपकने वाला संकेत के रूप J774 कोशिकाओं को महत्वपूर्ण रूप में वे HELA कोशिकाओं के लिए नहीं कर रहे हैं. दोनों प्रकार के सेल preferentially घुलनशील क्यू की दिशा की ओर चले गए.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक microfluidic सेटअप है कि पलायन कोशिकाओं की इमेजिंग चिपकने वाला बनाम घुलनशील cues के विपरीत gradients का जवाब देने की अनुमति देता है के निर्माण की प्रक्रिया के योजनाबद्ध एक कांच coverslips साथ passivated हैं. Biotinylated PLL खूंटी ख फ्लोरोसेंट streptavidin चिपकने वाले पैटर्न biotinylated पर मुद्रित कर रहे हैं सतह के रूप में या तो microcontact मुद्रण लाइनों का उपयोग (ख) या डॉट्स डुबकी कलम लिथोग्राफी का उपयोग (ख) ग. घ सेल. के माध्यम से बनाया जाता है और 0-10% की एक घुलनशील chemoattractant ढाल FBS microfluidic डिवाइस में लोड कर रहे हैं. बाद कोशिकाओं की सतह का पालन करने के लिए, RGD gradients पर streptavidin पटरियों पर सेल प्रवास और रहते हैं FBS gradients की उपस्थिति में दो जलाशयों को जोड़ने चैनल में imaged किया जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. सेल चिपकने वाला पैटर्न (लाइनों और डॉट्स) दो अलग अलग मुद्रण तकनीक के साथ उत्पन्न किया जा सकता है microcontact की एक फ्लोरोसेंट छवि मुद्रित streptavidin AlexaFluor350 पटरियों (Abs: 346 एनएम, एम: 442 एनएम, ग्रे) PLL खूंटी लेपित गिलास coverslips पर. microcontract मुद्रण मुखौटा लाइनों है कि 290 सुक्ष्ममापी के साथ केंद्र के लिए-CE 100 सुक्ष्ममापी व्यापक थे के रूप में डिजाइन किया गया थाnter अंतरिक्ष ख microcontact की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता streptavidin पटरियों, के रूप में दिखाया गया है, ऊपर से नीचे तक पार वर्गों के रूप में पांच अलग - अलग सतहों से मुद्रित. ट्रैक की औसत चौड़ाई 90 ± 6 सुक्ष्ममापी है और औसत रिक्ति केंद्र के लिए केंद्र 293 है ± 2 सुक्ष्ममापी ग. streptavidin युक्त डुबकी कलम लिथोग्राफी के साथ उत्पन्न डॉट्स की एक brightfield छवि. 15 सुक्ष्ममापी अंतरिक्ष केंद्र के लिए केंद्र के साथ 9 सुक्ष्ममापी डॉट्स के व्यास से लेकर 6. एक में स्केल सलाखों और ग 100 सुक्ष्ममापी हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. बायोटिन-4-fluorescein ढाल (0 ग्राम / μl 0.03 ग्राम / μl) एक गिलास सतहों पर समान रूप से streptavidin साथ लेपित बायोटिन 4 - fluorescein और बायोटिन RGD microfluidic डिवाइस (चिपचिपा स्लाइड chemotaxis 3 डी के दोनों जलाशय में भरी हुई थी , Ibidi) कर रहे हैं किएक 1 मिमी लंबी चैनल से जुड़ा हुआ है. एक 1 घंटा ऊष्मायन के बाद, उपकरण पीबीएस के साथ rinsed किया गया था और पीबीएस के साथ refilled 60 मोज़ेक छवियाँ. कुल छवि लंबाई 3072 मीटर और ख प्रतिदीप्ति तीव्रता पूरे मोज़ेक की लंबाई भर में मापा गया था के साथ ले जाया गया. रैखिक प्रवृत्ति लाइनों प्रतिदीप्ति तीव्रता चैनल में RGD ढाल का संकेत करने के लिए लगाया गया था.

चित्रा 4
चित्रा 4. एक fluorescein ढाल (0 सुक्ष्ममापी - 1 सुक्ष्ममापी) प्रतिदीप्ति तीव्रता microfluidic चैनल में बिना तुरंत बाद पीबीएस (टी = 0 घंटा) और एक 16 घंटा ऊष्मायन के बाद और सेटअप ख और fluorescein 1 सुक्ष्ममापी के साथ छोड़ दिया और सही से भरी हुई थी. microfluidic डिवाइस (चिपचिपा स्लाइड chemotaxis 3 डी, Ibidi), क्रमशः के जलाशय. microfluidic चैनल लंबाई में 1 मिमी और है50 के लिए 1050 मीटर की स्थिति में पाया है. ढाल कम से कम 16 घंटे के लिए स्थिर था.

चित्रा 5
चित्रा 5. HeLa सेल प्रवास एक microfluidics चैम्बर (चिपचिपा स्लाइड chemotaxis 3 डी, Ibidi) में चिपकने वाला (streptavidin पटरियों पर RGD immobilized) ढाल और घुलनशील ढाल (FBS 0-10%) का विरोध करने के साथ एक. एक microfluidics कक्ष में एक कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवि के साथ gradients विरोध. स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी ख epifluorescence खुर्दबीन (Nikon तिवारी ई) के साथ लिया सेल की छवियों समय चूक. छवियाँ 20 घंटा और सेल (नीली रेखा) प्रक्षेपवक्र सेल केन्द्रक स्थिति (ImageJ पुस्तिका ट्रैकिंग प्लगइन) के माध्यम से प्राप्त के लिए 15 मिनट के अंतराल पर ले जाया गया. स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी ग प्रक्षेपवक्र सेल. है. छवियों से के रूप में ख में दिखाया गया है. सेल trकि घुलनशील FBS के उच्च एकाग्रता की ओर चले गए ajectories लाल (एन निशान 36 =) में दिखाए जाते हैं, सेल trajectories कि पक्षपाती RGD के उच्च सांद्रता की ओर चले गए काला (एन निशान 14 =) में दिखाए जाते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic युक्ति का इस्तेमाल किया (Ibidi से चिपचिपा स्लाइड chemotaxis 3 डी) रासायनिक संशोधित सतहों और सेल प्रवास पर chemoattractant gradients के प्रभाव का अध्ययन. इस microfluidic सेटअप प्रवाह की आवश्यकता नहीं है क्योंकि ढाल चैनल की लंबाई के साथ प्रसार द्वारा स्थापित है. यह महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रवाह विभिन्न प्रकार से ऐसे fibroblasts कि स्थिर फोकल adhesions और ज्यादातर leukocytes है कि छोटे फोकल परिसरों और 26 synapses फार्म की तरह तेजी से पलायन कोशिकाओं के रूप में के रूप में धीरे पलायन कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है. लामिना का प्रवाह से कतरनी तनाव घुलनशील 27,28 cues की ओर चिपकने वाला और cues सेल chemotaxis कोशिका आसंजन की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है. हम धीमी गति से चलती HELA कोशिकाओं और तेजी से बढ़ J774 जिससे यह दिखा रहा है कि microfluidic सेटअप दोनों पक्षपाती और कम पक्षपाती सेल प्रकार के लिए लागू है कोशिकाओं के बीच प्रवास व्यवहार में अंतर पाया गया. इस तरह की तुलना को भी revealeदिलचस्प पैटर्न सतह कि दोनों चिपकने वाला (RGD पेप्टाइड्स या fibronectin) cues और विरोधी fouling (खूंटी क्षेत्रों) क्षेत्रों को समाहित करने के लिए आसंजन और प्रवास प्रतिक्रियाओं में सेल प्रकार के बीच अंतर है.

सतह पैटर्न 29 microcontact मुद्रण और डुबकी कलम लिथोग्राफी 30,31 के साथ बनाया गया था. Microcontact मुद्रण एक सरल और अपेक्षाकृत तेजी से, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य patterning प्रक्रिया है. हालांकि, और PDMS स्टांप, जो photolithography द्वारा हासिल की है, के डिजाइन, निर्माण और अधिक शामिल हैं और काफ़ी समय लगता है. यह भी है कि छोटे (<5 सुक्ष्ममापी) सुविधाओं को प्राप्त करने और पैटर्न के पहलू अनुपात पर निर्भर मुश्किल में अपनी सीमाओं का परिचय है. संक्षेप में, microcontact मुद्रण माइक्रोन आकार के सैकड़ों और प्रयोगों, जहां एक ही पैटर्न के लिए कई बार बनाया बड़े पैटर्न के लिए आदर्श है. दूसरी ओर, डुबकी पिन लिथोग्राफी nanoscaled पैटर्न के लिए माइक्रोन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह अधिक मुद्रण डॉट्स अनुकूल हैलाइनों की तुलना में, हालांकि लाइनों निर्मित किया जा सकता है. डुबकी पिन लिथोग्राफी पैटर्न डिजाइन में अधिक से अधिक स्वतंत्रता देता है, वहाँ के रूप में पूर्व निर्मित मास्क स्वामी, या टिकट के लिए कोई जरूरत नहीं है. हालांकि, patterning प्रक्रिया की गति धीमी है, जिससे बड़े बोझिल और एक विशेष उपकरण उपयोग क्षेत्रों के मुद्रण महत्वपूर्ण है. दो तरीकों patterning विचार के लिए प्रासंगिक हैं क्योंकि आकार और चिपकने वाला क्यू पैटर्न के आकार संगठन और biomechanical मशीनरी के वितरण के कि सेल 32,33 प्रवास को विनियमित प्रभावित. इसके अलावा, यहां कार्यरत वाणिज्यिक microfluidic डिवाइस की सीमा यह है कि चैनल लंबाई (1 सुक्ष्ममापी) और परिवर्तित नहीं किया तो एक घुलनशील चिपकने वाला और gradients की अधिकतम steepness नियंत्रित नहीं कर सकते कर सकते हैं. अगर steeper gradients के लिए आवश्यक हैं, एक से दो जलाशयों के बीच एक छोटी चैनल के साथ एक microfluidic युक्ति निर्माण की आवश्यकता होगी. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल की एक प्रमुख लाभ मॉड्यूलर डिजाइन है ताकि विभिन्न सुके rfaces, सतह chemistries, patterning दृष्टिकोण और microfluidic उपकरणों जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए जोड़ा जा सकता है है.

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Disclosures

हम वाणिज्यिक हितों का खुलासा करने के लिए नहीं है.

Acknowledgments

लेखक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद से धन स्वीकार करते हैं और यह भी शुक्रिया अदा करना SU-8 microcontact मुद्रण के लिए मास्टर के लिए आस्ट्रेलियन नेशनल निर्माण सुविधा. SHN हायर एजुकेशन और Universiti मलेशिया Sains मलेशिया के मंत्रालय द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass staining outfits Thomas Scientific 8542 E40 Coverslip rack
Oven Binder ED 53 series
Silicon wafer Silicon Quest 708-007 Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist Gersteltec Sarl
SU-8 developer Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%) SuSos AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) 1 mg/ml in PBS
Fluorescein Sigma 46955 1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249 1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein Invitrogen B-1370 0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD GenScript SC1208 0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red Invitrogen S-11346 1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D Ibidi 80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip Greiner Bio-One 739261
Vaseline Sigma 16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C Sigma 327204
Nano eNabler 10 μm cantilever BioForce SPT-S-C-10s
Image J software National Institute of Health rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin Fabrice Cordelières rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool Ibidi GmbH www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

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