Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy

Published: April 4, 2013 doi: 10.3791/50310
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 1
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

Summary

En fremgangsmåde til samling af lim og opløselige gradienter i en mikroskopi kammer til levende celler migrationsundersøgelser er beskrevet. Den konstruerede miljø kombinerer antifouling overflader og klæbende spor med løsning gradienter og derfor tillader en at bestemme den relative betydning af vejledning cues.

Abstract

Celler kan mærke og migrere mod højere koncentrationer af adhæsive signaler som glycoproteinerne i den ekstracellulære matrix og opløselige signaler som vækstfaktorer. Her har vi beskrive en fremgangsmåde til at skabe modstående gradienter af klæbemiddel og opløselige signaler i en mikrofluid kammer, som er kompatibel med levende celler. En copolymer af poly-L-lysin og polyethylenglycol (PLL-PEG) anvendes til at passivere dækglas og forhindre ikke-specifik adsorption af biomolekyler og celler. Dernæst microcontact trykning eller dip pen litografi anvendes til at skabe spor af streptavidin på de passiverede overflader for at tjene som forankringspunkter for det biotinylerede peptid arginin-glycin-asparaginsyre (RGD) som klæbemiddel stikord. En mikrofluid anordning anbringes på den modificerede overflade og anvendes til at skabe gradient af adhæsive signaler (100% RGD til 0% RGD) på de streptavidin-spor. Endelig er den samme mikrofluid anordning, der anvendes til at skabe en gradient af en kemoattraktant such som føtalt bovint serum (FBS), som det opløselige udgangspunkt i den modsatte retning af gradienten af ​​klæbende signaler.

Introduction

Instrueret cellemigration er en fundamental egenskab af mange celler og er et centralt element i mange normale fysiologiske processer, herunder fosterudvikling, forsvar mod infektioner og sårheling. Desuden cellemigration spiller en fremtrædende rolle i mange sygdomme, såsom vaskulær sygdom, tumorcellemetastase og kronisk inflammation 1,2. Mens de klassiske tilstande af cellemigrering - polarisering, fremspring forlængelse, dannelse af vedhæftning, force generation og bageste tilbagetrækning - generelt accepteres 3,4, har udredning af Spatiotemporal mekanismer, som signal integration er koordineret været mere udfordrende.

Den ekstracellulære matrix (ECM) tjener som et substrat for celleadhæsion, og gennem iboende kemiske 5 og fysiske 6 mangfoldighed, retningsbestemte signaler for celle navigation 7,8 tilvejebringer. Ud over disse adhæsive signaler 9, opløselige faktorer 10-12 </ Sup> såsom kemokiner og vækstfaktorer kan fremkalde rettet cellevandring gennem kemotiltrækkende receptorer og deres downstream motogenic signalsystemer. For øjeblikket vides det ikke, om engagement og signalering via adhæsionsreceptorer (dvs. integriner) eller kemotiltrækkende receptorer, såsom receptor (RTK), er dominerende. Det er heller ikke kendt, om hierarkier af receptor-systemer er celletypespecifik.

Live-celle mikroskopi giver et væld af oplysninger, som ikke er tilgængelig i bulk assays og kan kombineres med mikrofluidenheder at generere gradienter af immobiliserede 13,14 og opløselige signaler 15 16. Den her beskrevne metode anvender en række simple og etablerede fremgangsmåde til overflademodifikation sammen med et kommercielt tilgængeligt mikrofluid kammer til at skabe et billeddannende analyse for cellemigration, som nemt kan implementeres i en cellebiologi laboratorium (figur 1). Den samledemikrofluid anordning har optiske egenskaber, der er sammenlignelige med glas 17 og gradienter af diffunderbare molekyler er stabile i mindst 16 timer. Systemet kan anvendes til epifluorescens og avancerede mikroskopi teknikker. I modsætning til andre kemotaxi opsætninger 18, er dette system egnet til optagelse langsomt migrerer, adhærente celler. Vigtigt er det, at systemet er modulopbygget og let tillader indføringen af ​​alternative klæbemiddel eller opløselige migration køer og undersøgelse af forskellige celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Passivering af dækglas med PLL-PEG-biotin

Dette trin har til formål at passivere overfladen, således at celler klæber og migrere ind specifikke regioner på dækglas, der er oprettet med microcontract udskrivning (trin 2-3a) eller dip pen litografi (Step 3b). Til passivering, er en copolymer af poly-L-lysin (PLL) og polyethylenglycol (PEG), der anvendes, hvor 20% af PEG-molekyler er podet til biotin (PLL-PEG-biotin).

  1. At rense dækglas (18 mm x 18 mm), oversvømme dem i et stativ i 100% ethanol og placere hylden i et sonikerende vandbad i 30 min. Tørre dækglas i luft eller under en strøm af nitrogen.
  2. Next, sonikeres de dækglas i 30 minutter i 1 M NaOH. Bagefter skylles glasoverfladerne ved forsigtigt at dyppe rack i et bæger fyldt med 1,5 L Milli-Q H 2 O. Gentag skylleprocessen tre gange med friske Milli-Q H2O hver gang. Tør dækglas ien ovn ved 60 ° C.
  3. Sted halvdelen af det rene dækglas individuelt i et fugtigt kammer, som er fremstillet af en 24-brønds plade delvis fyldt med H 2 O. Drop 15 pi af PLL-PEG-biotin (1 mg / ml) i PBS på hvert dækglas. Tag den anden halvdel af de resterende rene dækglas og omhyggeligt sandwich PEG-opløsningen. Efterlad dækglassene i 1 time i fugtigt kammer. Skub klemt dækglas blidt væk fra hinanden uden at skrabe PEG-coatede overflade og skylle dem med Milli-Q H 2 O. Vandet skal glide let i PEG-behandlede side. Hvis det er nødvendigt, står lufttørre de dækglas på køkkenrulle med den behandlede overflade opad. Opbevar dækglas i en vakuumdesikkator indtil videre anvendelse.

2. Fremstilling af Frimærker til microcontact printing

Vi beskriver to processer til pattern streptavidin spor på de passiverede dækglas. Den første, microcontact trykning, kræver typisk fremstilling af en silicium mester hvorfra en PDMS stempel støbes. I vores tilfælde er mønsteret på PDMS stempel 100 pm hele linier, der er fordelt 290 um center-til-center med en funktion højde på 25 um. Nedenfor beskriver vi kort, hvordan at fabrikere en egnet silicium mester (Trin 2,1-2,3) og PDMS stempel (trin 2,4). Men der er flere protokoller for microcontact printing beskrevet i litteraturen 19-23, som er egnede til udskrivning af proteinmønstre på dækglas. Mastere kan også skræddersyet og købes fra kommercielle kilder.

  1. Dels rense siliciumskiven (4 "i diameter) ved at inkubere det i Piranha-opløsning (3:1 v: v svovlsyre og 30% hydrogenperoxid). I 20 minutter skylles wafer grundigt 10 gange med MilliQ H 2 O. Tør skiven i en ovn ved 150 ° CO / N.
  2. Skylle ren og tørret siliciumskive med 100% acetone, efterfulgt af 100% isopropylalkohol. Næstespin-coating 2 ml GM1070 SU-8 fotoresist (Gersteltec Sarl) på skiven ved 3100 rpm i 40 sek for at skabe et 25 um tykt lag. Prøven bliver derefter bagt på en varm plade ved 65 ° C i 5 minutter efterfulgt af yderligere 5 minutter ved 95 ° C.
  3. Udsætte SU-8 fotoresist for UV-lys i 60 sekunder under en fotomaske med det ønskede mønster (for eksempel ved anvendelse af en Quintel Q6000 maske aligner) og gentag bageprocessen beskriver i 2.2. Derefter prøven er udviklet ved nedsænkning af skiven i SU-8 fremkalder (Gersteltec Sarl) i 4 minutter, skyllet i 100% isopropylalkohol og tørret under en nitrogenstrøm. Det område af SU-8 fotoresist, der ikke var udsat for UV-lys således fjernes, hvilket skaber det omvendte mønster af PDMS stempel.
  4. Det næste skridt er at kaste en PDMS stempel fra silicium mester. Først, blandes grundigt 1 del (vægt / vægt) af hærdningsmidlet med 10 dele elastomer præpolymer (Sylgard 184). At fjerne eventuelle luftbobler, afgasses blandingen i en ekssikkator fastgjort til en vakuumledningi 1 time. Dernæst hældes PDMS elastomer på silicium masteren i en petriskål til cirka 1 cm i højden og hærde master og PDMS blandingen i en ovn ved 70 ° C i 1 time. Endelig er PDMS stempel fjernet fra silicium masteren og skæres til.

3. Mønstret Streptavidin eller Lim Cues på passiveret dækglas

Efter passiverende dækglas, er protein mønstre trykt med microcontact udskrivning (Trin 3a) eller dip-pen litografi (trin 3b). I vores tilfælde er streptavidin trykt som linier, som danner grundlag for RGD-gradienter (Trin 4). Den samme fremgangsmåde kan også anvendes til udskrivning af matrixproteiner at skabe adhæsive mønstre.

En alternativ fremgangsmåde til microcontact printing til mønsterdannelse af biomolekyler på overflader er dip pen litografi. I dip pen litografi, er en fritbærende bruges til at overføre et lille volumen af ​​opløsningen på overfladen. Størrelsen af ​​de udhæng, viscosity af opløsningen, kontakttid af cantilever på overfladen, hydrofobicitet af overfladen og fugtighed i trykkerier kammer bestemmer størrelsen af ​​de trykte kendetegn. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at forskellige mønstre kan trykkes for hvert forsøg, da der ikke er behov for at fremstille mastere og frimærker. Ulempen er, at det tager længere tid at udskrive et bestemt mønster, og at dip pen litografi kræver en specialist instrument, der måske ikke være tilgængelig i mange laboratorier. Dip pen litografi instrument, som vi brugte var NanoeNabler fra Bioforce Nanovidenskab. Her har vi trykt små prikker, der var <10 um i diameter, som vi brugte SPT10 køreledningsophæng.

3a. Microcontact Printing (μCP) Teknik

  1. At rengøre og gøre PDMS stempel mere hydrofil, behandle den mønstrede side af PDMS stempler i en UV og ozon (f.eks UV Ozone Procleaner fra Bioforce Nanoscience) i 1,5 timer. Alternativt kan du bruge en plasmarengøringsmiddel i kortere tid til samme formål. Denne proces skaber en oxideret PDMS overflade 24, hvilket forbedrer trykprocessen.
  2. Umiddelbart efter ozon eller plasmabehandling, sted og spreder 10 pi streptavidin (1 mg / ml i PBS) på de PDMS stempler og henstår i 1 time i et fugtigt kammer (såsom en delvist fyldt 6-brønds plade, se trin 1.3) . Hvis baner skal være synligt under fluorescensmikroskop, anvender streptavidin, der er konjugeret til en fluorofor, såsom streptavidin-AlexaFluor350.
  3. Fjern overskydende streptavidin fra frimærket med silkepapir og lufttørre det stempel i ca 1 min. Tryk let stemplet over på PLL-PEG-biotin-overtrukne dækglas.
  4. Hvis fluorescerende streptavidin blev anvendt i trin 3.a2 undersøge det mønster ved hjælp under et epifluorescensmikroskop. Opbevares trykte overflader i en ekssikkator.

3b. Dip Pen Litografi

  1. Først, blandes 1 del 1 mg / ml streptavidin eller streptavidin-AlexaFluor350 med 10 dele glycerol (v / v) og indlæse 5 pi af blandingen på cantilever. Derefter begynder trykkeprocessen som beskrevet i betjeningsvejledningen til dip pen litografi instrument. At reducere pletstørrelsen til cirka 5 um, justere udskrivningshastigheden, kontakttid af cantilever på overfladen eller lodrette afstand af cantilever til overfladen. I eksemplet vist i figur 2c blev prikker trykt i overensstemmelse med række og kolonne separation indstillet til 10-15 um. Denne afstand er tilstrækkelig til at forhindre prikker fra fusionere ind i hinanden, men tillader visning af flere prikker i et enkelt synsfelt med de fleste mikroskop indstillinger.
  2. Opbevares trykte overflader i en ekssikkator.

4. Oprettelse Selvklæbende Gradienter over på Streptavidin-mønster Overflader

Vi skaber klæbende gradienter af biotin-RGD på dækglas, der er belagt med streptavidin (fig. 3) eller contain streptavidin mønstre på passiverede dækglas (figur 5). Hvis du vil oprette en overflade gradient, brugte vi en kommercielt tilgængelig mikrofluid enhed (kaldet klæbrig-Slide Kemotaksi 3D fra Ibidi), der skaber en stabil løsning gradient ved passiv diffusion. At konkurrere om streptavidin-bindingssteder, anvendte vi to modstående gradienter af biotin-RGD og biotin som ikke var konjugeret til RGD (se figur 1).

  1. Overhold de streptavidin-coatede eller-mønstrede dækglas på den klæbende side af klæbrige-Slide Kemotaksi 3D enhed. For at sikre at der ikke er lækager i flere timer, er kanterne på indretningen forseglet med et tyndt lag af opvarmet vaseline og med et andet lag af en blanding af 1 del af vaseline til 1 del paraffin (vægt / vægt).
  2. Fyld kanal af anordningen med 6 pi PBS i kanalen. Derefter fylde de to reservoirer med 70 pi af 0,03 pg / pl biotin-4-fluorescein i PBS og 70 & mu, l på 0,03 pg / pl biotin-RGD i PBS, hhv. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i mørke i 1 time.
  3. Fjern biotin-løsninger og forsigtigt skylle overfladen mens den stadig er fastgjort til mikrofluid anordning to gange med PBS. Markerer retningen af ​​klæbemidlet gradient og om nødvendigt opbevares fyldt med PBS ved 4 ° C for men sikre, at enheden ikke tørrer ud. Om nødvendigt kan analysere den klæbende gradient med et fluorescensmikroskop.

5. Mærkning af celler med fluoroforer til Live Cell Imaging

Celler mærket med fluorescerende farvestoffer, der bistår cellesporing under fluorescensmikroskop. Almindelige prober er fluorescerende organel markører, såsom Syto 64 Red, hvilke etiketter cellekernen. Hertil kan celler først vasket tre gange med PBS og derefter inkuberet med 1 uM Syto 64 Red i kulturmedier i 45 min og til sidst vasket yderligere tre gange med PBS. Bemærk, at celler ikke bør væreopbevares i PBS i lange perioder.

Alternative farvestoffer til cellesporing er CellTracker serie, der plette cytoplasmaet og tilbageholdes under cellemigration og deling. Transfektion af celler med fluorescerende fusionsprotein er særlig anvendelig til at registrere de subcellulære fordelinger af et protein af interesse under migrering. Men fluorescerende proteiner typisk foto-blegemiddel hurtigere end organiske farvestoffer, således at langsigtede observationer måske ikke muligt.

6. Lastning af celler med en opløselig Gradient i Microfluidics Device

  1. Tæl fluorescensmærkede celler og opdelt i to rør af samme celletal. Vask og resuspender et rør af celler med medier indeholdende det kemotiltrækkende, såsom lav glucose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS). Vask og resuspender andet rør af celler i medier uden kemoattraktant, dvs DMEM med 0% FBS. Slutkoncentrationenaf celler i hvert rør bør være 5 x 10 5 celler / ml.
  2. Fjern alle løsninger fra mikrofluid enhed (fra trin 4,3) og placere den på mikroskopbordet (se trin 7). Load 70 pi celler (5 x 10 5 celler / ml i 0% FBS DMEM) i et reservoir og 70 pi af HeLa-celler (5 x 10 5 celler / ml i 10% FBS DMEM) til et andet. Løst placere en tape over reservoirerne for at undgå fordampning. Hvis celler på overfladen præinkuberes forud for billeddannelse, er det tilrådeligt, at cellerne fyldes i anordningen i vækstmediet uden gradient. Anordningen anbringes derefter på objektbordet og medierne erstattet med gradient media dvs. DMEM uden FBS i et reservoir og DMEM med 10% FBS i den anden.

7. Levende Cell Imaging og Data Analysis

  1. Tænd mikroskopet (Nikon Ti-E) og varme op på scenen mindst 1 time før start eksperimentet.
  2. Sørg for, at kanalen i microfluidic enhed er i synsfeltet og celler er i fokus. Vælg billede erhvervelse parameter såsom eksponeringstider og fluorescerende filtre, billede sekvens af lyse felt og fluorescens, der fanger celler og spor samt tidspunkter og optagelse længde (for eksempel hver 15 min i 16 timer).
  3. Analyser data med passende software såsom ImageJ Manuel sporing eller Ibidi Kemotaksi og Migration Tool.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at forstå hvordan celle integrere vandrende signaler 25, har vi udviklet en metode til at billedet celler med fluorescensmikroskopi at migrere i et miljø med konkurrerende klæbende og opløselige gradienter (figur 1). Selvklæbende spor, der indeholdt fluorescerende streptavidin og biotinyleret RGD blev skabt med microcontact trykte spor og dip pen litografi (figur 2). Vellykket microcontact trykning er angivet med linien profilen af fluorescensintensiteten på tværs af sporene, hvor klæbende baner og antifouling-regioner der adskiller sig klart (figur 2b). Dots trykt med dip pen litografi synes afrundet, ikke rive formet, hvilket indikerer en vellykket print proces. Overflade kemi og fugtighed påvirker resultatet af trykprocessen. Generelt den mere hydrofobe overflade er, desto bedre trykning resultater.

En gradient af klæbende tidskoderpå den trykte bane blev skabt med en simpel mikrofluidik enhed ved at indlæse biotin-4-fluorescein og biotin-RGD til den modsatte side af en mikrofluid kammer (fig. 3). Da begge molekyler binder kompetitivt til den streptavidin spor på glasoverfladen, er en immobiliseret gradient af RGD-ligander genereres. Efter fjernelse af biotin / biotin-RGD opløsning, kan det samme kammer anvendes til at indføre en opløselig gradient, som er stabil i mikrofluid kanal i mindst 16 timer (figur 4).

Introducerede vi HeLa-celler i kammeret med en kemoattraktant gradient, som FBS blev anvendt. Ved lave tætheder, HeLa-celler fortrinsvis overholdt og migrerede på streptavidin / RGD spor (N-celler = 50) og undgået de anti-fouling PEG regioner (N-celler = 19). Positionen af ​​individuelle celler blev optaget over 16 timer og analyseres med en celle tracking software. I et eksperiment, hvor klæbemiddel og løsble gradienter er imod hinanden (fig. 5), banerne i individuelle celler viste, at flere HeLa-celler migreret mod kilden til de kemotiltrækkende (røde spor i figur 5c, N spor = 36) end mod højere koncentrationer af adhærerende RGD (black spor i figur 5c, N spor = 14). Den gennemsnitlige afstand, at celler migreret mod (sorte spor) eller (røde spor) retningen af den FBS gradient (x-komponenten af gennemsnitlige forskydning af hver bane) var 0,1700 ± 0,1172 og 0,2278 ± 0,1280 (p <0,0001, Student t-test) selv om der var nogen statistisk signifikant forskel i det gennemsnitlige forskydning mellem de sorte spor (56,18 ± 32,27 um) og de ​​røde spor (72,86 ± 45,05 um, P> 0,05, Student t-test). HeLa-celler migrerer med en gennemsnitlig hastighed på 17,47 ± 4,72 um / time i nærvær af både gradient af klæbemiddelcue (dvs. RGD) og opløselig cue (dvs. FBS). Dataene foreslår derfor, at for HeLa-celler, det FBS gradient bestemmer retningen af ​​migration medens cellerne opretholder en indre migration hastighed på de adhæsive baner.

Vi har også vurderet vandring af makrofag cellelinie J774. I fravær af klæbende og opløselige gradienter, vandrer disse celler ved meget højere hastigheder (38,55 ± 17,88 um / time) end HeLa-celler (16,47 ± 4,28 um / time), men med mindre persistens dvs J774-celler ændrer retning (retningsbestemthed af 0,059 ± 0,091 ), målt som forholdet mellem forskydningen at registrere længden oftere end HeLa-celler (0,57 ± 0,12) på microcontact trykte fibronectin spor. J774-celler er også mindre kontaktafhængig end HeLa-celler. Forskydningen af ​​J774 celler var højere på PEG regioner (102,20 ± 54,73 um) end på fibronectin spor (42,95 ± 39,90 um). Desuden, J774-celler enppeared til at tilpasse sig forskellige overfladekemi ved at ændre deres mekanisme af migrationen fra mesenkymale til amoeboid. Konklusionen er, adhæsive signaler ikke så vigtig for J774-celler som de er for HeLa-celler. Begge celletyper fortrinsvis vandret i retning af retningen af ​​den opløselige stikord.

Figur 1
Figur 1. Skematisk af fremstillingsprocessen af en mikrofluid setup, der tillader billeder af migrerende celler reagerer på modsatte gradienter af klæbende versus opløselige signaler. En. Dækglas er passiveret med biotinyleret PLL-PEG. B. Selvklæbende mønstre, som indeholder fluorescerende streptavidin er trykt på den biotinylerede overflade enten som linjer ved hjælp microcontact udskrivning (b) eller prikker ved hjælp af dip pen litografi (b '). c.. D. Celler og en opløselig kemoattraktant gradient på 0-10% FBS fyldes i mikrofluid enhed. Efter celler klæber til overfladen, live cell migration over RGD-gradienter på streptavidin-spor, og i nærvær af FBS gradienter kan afbildes i kanalen forbinder de to reservoirer.

Figur 2
Figur 2. Celleadhæsive mønstre (linjer og punkter) kan tilvejebringes med to forskellige trykketeknikker en fluorescerende billede af microcontact trykt streptavidin-AlexaFluor350 spor (Abs: 346 nm, Em: 442 nm, grå).. På PLL-PEG-belagte dækglas. Den microcontract udskrivning maske blev designet som linier, der var 100 um bred med 290 um center-til-ceadministration af inter space. b. Den gennemsnitlige fluorescerende intensitet af microcontact trykte streptavidin spor, som vist i en, fra fem forskellige overflader som tværsnit fra top til bund. Den gennemsnitlige bredde af banen er 90 ± 6 um, og den gennemsnitlige center-til-center er 293 ± 2 um. Ca. En brightfield billede af streptavidin-holdige prikker genereret med dip pen litografi. Diametrene af prikker varierede 6-9 um med 15 um center-til-center plads. Skala barer i et og c er 100 um.

Figur 3
Figur 3. Biotin-4-fluorescein-gradient (0 pg / pl - 0,03 pg / pl). På et glasoverflader ensartet coatet med streptavidin Biotin-4-fluorescein og biotin-RGD blev fyldt i enten reservoir mikrofluid enhed (klæbrig-Slide Kemotaksi 3D , Ibidi), som erforbundet med et 1 mm lang kanal. Efter 1 times inkubation blev indretningen skyllet med PBS og fyldes igen med PBS. En. Mosaik 60 billeder blev taget med et samlet billede længde 3072 um og b fluorescensintensiteten blev målt på tværs af længden af hele mosaik. Lineær tendens linjer blev monteret på fluorescensintensiteten at angive RGD gradient i kanalen.

Figur 4
Figur 4. Fluorescensintensiteten af et fluorescein-gradient (0 uM - 1 pM) i mikrofluid kanal en umiddelbart efter opsætningen (T = 0 timer) og b efter en 16 timers inkubation PBS uden og med 1 uM fluorescein blev fyldt fra venstre og højre. reservoir mikrofluid enhed (klæbrig-Slide Kemotaksi 3D, Ibidi) hhv. Den mikrofluid kanal er 1 mm lange ogfindes i position 50 til 1050 um. Gradienten var stabil i mindst 16 timer.

Figur 5
Figur 5. HeLa cellemigration i en mikrofluidik kammer (klæbrig-Slide Kemotaksi 3D, Ibidi) med modstående klæbende gradient (immobiliseret RGD på streptavidin-spor) og opløselig gradient (0-10% FBS). En. Et repræsentativt billede af celler i en mikrofluidik kammer med modsatrettede gradienter. Scale bar er 50 um. B Time-lapse billeder af en celle taget med et epifluorescensmikroskop (Nikon Ti-E). Billeder blev taget ved 15 minutters intervaller i 20 timer og celle bane (blå linie) opnået via celle centroid positionering (ImageJ manuel tracking plugin). Scale bar er 50 um. Ca. Cell bane fra billeder, som vist i b.. Cell trajectories der migrerede mod højere koncentration af opløselig FBS er vist i rød (N spor = 36), celle baner, der migrerede mod højere koncentrationer af klæbende RGD er vist i sort (N spor = 14). Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol, brugte vi en kommercielt tilgængelig mikrofluid enhed (klæbrig-Slide Kemotaksi 3D fra Ibidi) til at undersøge virkningerne af kemisk modificerede overflader og kemotiltrækkende gradienter på cellemigrering. Denne mikrofluid opsætning kræver ikke strømning, fordi gradienten etableres ved diffusion langs længden af ​​kanalen. Dette er vigtigt, fordi flow differentielt kunne påvirke langsomt migrerende celler såsom fibroblaster, som danner stabile fokale adhæsioner og hurtigt migrerende celler som de fleste leukocytter, der danner små fokale komplekser og synapser 26. Shear stress fra laminar strømning kan påvirke stabiliteten af celleadhæsion til klæbende køer og celle kemotaxi mod opløselige tidskoder 27,28. Vi fandt forskelle i migration adfærd mellem langsomme HeLa celler og hurtige bevægelser J774-celler og derved viser, at mikrofluid opsætningen er gældende for både vedhæftende og mindre klæbende celletyper. Sådanne sammenligninger også revealed interessant forskel mellem celletyper i adhæsion og migration reaktioner på overflademønstre, der indeholdt både adhæsive signaler (RGD-peptider eller fibronectin) og antifouling-regioner (PEG områder).

Overflade mønstre blev skabt med microcontact udskrivning 29 og dip-pen litografi 30,31. Microcontact trykning er en enkel og relativt hurtigt, reproducerbar mønsterdannelse proces. Imidlertid er udformningen og fremstillingen af ​​PDMS stempel, som opnås ved fotolitografi, er mere involveret og tidskrævende. Det indfører også sine egne begrænsninger i, at små features (<5 m) er vanskelige at opnå og afhænger af skærmformat af mønstret. Kort sagt, er microcontact udskrivning ideel til store mønstre op til hundredvis af micron størrelse og i forsøg, hvor de samme mønstre skal skabt mange gange. På den anden side kan dip pin litografi anvendes til at frembringe mikron til nanoscaled mønstre. Det er mere velegnet til udskrivning prikkerend linjer, kan selv linjer fremstilles. Dip pin litografi giver større frihed i mønstre, da der ikke er behov for præfabrikerede masker, master eller frimærker. Imidlertid er hastigheden af ​​mønstret er langsom, hvilket gør trykning af store områder tunge og adgang til en specialiseret instrument er afgørende. De to mønsterdannende metoder er relevante at fordi størrelsen og formen af klæbende cue mønstre påvirke organisationen og distribution af biomekaniske machineries, der regulerer cellemigrering 32,33. Desuden begrænsning af den kommercielle mikrofluid anordning anvendt her er, at kanalens længde (1 um) ikke kan ændres, og så man kan ikke styre den maksimale stejlhed af klæbemidlet og opløselige gradienter. Hvis stejlere gradienter er nødvendig, ville man nødt til at fabrikere en mikrofluid enhed med en kortere kanal mellem de to reservoirer. En væsentlig fordel ved protokollen beskrevet her er det modulære design, således at forskellige surfaces, overflade kemier, mønster fremgangsmåder og mikrofluidenheder kan kombineres til en bred vifte af levende celler eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen kommercielle interesser at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender støtte fra Australian Research Council og National Health og Medical Research Council i Australien, og også gerne takke Australian National Fabrication facilitet for SU-8 mester for microcontact udskrivning. SHN er støttet af Ministeriet for Videregående Uddannelser Malaysia og Universiti Sains Malaysia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass staining outfits Thomas Scientific 8542 E40 Coverslip rack
Oven Binder ED 53 series
Silicon wafer Silicon Quest 708-007 Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist Gersteltec Sarl
SU-8 developer Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%) SuSos AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) 1 mg/ml in PBS
Fluorescein Sigma 46955 1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249 1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein Invitrogen B-1370 0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD GenScript SC1208 0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red Invitrogen S-11346 1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D Ibidi 80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip Greiner Bio-One 739261
Vaseline Sigma 16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C Sigma 327204
Nano eNabler 10 μm cantilever BioForce SPT-S-C-10s
Image J software National Institute of Health rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin Fabrice Cordelières rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool Ibidi GmbH www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Tags

Bioengineering Mikrobiologi Cellular Biology biokemi molekylærbiologi biofysik Cell migration live cell imaging opløselige og vedhængende gradienter microcontact udskrivning dip pen litografi MicroFluidics RGD PEG biotin streptavidin kemotaksi kemoattraktant imaging
Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., … More

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., Tønnesen, L., Fairjones, Z., Gooding, J. J., Böcking, T., Gaus, K. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (74), e50310, doi:10.3791/50310 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter