Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Published: April 4, 2013 doi: 10.3791/50310
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 1
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

Summary

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

Abstract

תאים יכולים לחוש ולהעביר לריכוזים גבוהים יותר של רמזים דבקים כגון גליקופרוטאינים של מטריקס ורמזים מסיסים כגון גורמי גדילה. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת שיפועים מנוגדים של רמזים דבקים ומסיסים בתא microfluidic, אשר תואם עם הדמית תא חייה. קופולימר של פולי-L-ליזין ופוליאתילן גליקול (PLL-PEG) הוא מועסק passivate coverslips זכוכית ולמנוע ספיחה הלא ספציפית של ביומולקולות ותאים. , הדפסת microcontact הבאה או לטבול יתוגרפיה עט המשמשת ליצירת רצועות של streptavidin על משטחי פסיבציה לשמש כעיגון נקודות לפפטיד החומצה ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD) biotinylated כמקל דבק. מכשיר microfluidic ממוקם על פני השטח השונים ומשמש ליצירה הדרגתית של רמזים דבקים (100% RGD לRGD 0%) על מסילות streptavidin. לבסוף, באותו המכשיר microfluidic משמש ליצירת שיפוע suc chemoattractantח כסרום עוברי שור (FBS), כאות המסיסה בכיוון ההפוך של השיפוע של רמזים דבקים.

Introduction

נדידת תאי בימוי היא מאפיין בסיסי של תאים רבים והיא היבט מרכזי של תהליכים פיסיולוגיים רבים נורמלים, כולל התפתחות עוברית, הגנה מפני זיהומים וריפוי פצעים. בנוסף, נדידת תאים גם ממלאת תפקיד מרכזי במחלות רבות כגון מחלות לב וכלי דם, גרורות של תאים סרטניים ו1,2 דלקת כרונית. בעוד המדינות הקלסיות של נדידת תאים - הקיטוב, מאריך בליטה, היווצרות הידבקות, דור כוח והנסיגה אחורית - מתקבלות בדרך 3,4, הבהרת מנגנוני חלל ובזמן שבו שילוב האות תואם כבר יותר מאתגר.

מטריקס (ECM) משמש כמצע להדבקת תא, ובכימי גלומים 5 ו 6 גיוון פיזי, מספק רמזים כיוונית לתא ניווט 7,8. בנוסף לרמזים האלה דבקים 9, גורמים מסיסים 10-12 </ Sup> כגון כמוקינים וגורמי גדילה יכולה לגרום לנדידת תאים נוהל באמצעות קולטנים chemoattractant ואיתות motogenic מורד הזרם שלהם. נכון לעכשיו, לא ידוע האם התקשרות ואיתות דרך הקולטנים הידבקות (כלומר integrins) או קולטנים chemoattractant, כגון טירוזין קינאז רצפטור (RTK), הן דומיננטית. זה גם לא ידוע אם היררכיות של מערכות רצפטור הן ספציפיות סוג תא.

מיקרוסקופיה תא חייה מעניקה שפע של מידע שאינו נגיש במבחנים בתפזורת וניתן בשילוב עם מכשירי microfluidic לייצר גרדיאנטים של רמזים משותקים 13,14 ומסיסים 15 16. השיטה המתוארת כאן מנצלת סדרה של צעדים פשוטים ומקובלים לשינוי פני שטח בשיתוף עם קאמרי microfluidic זמינה מסחרי כדי ליצור assay הדמיה לנדידת תאים שיכול בקלות להיות מיושמים במעבדת ביולוגיה של תא (איור 1). התאסףמכשיר microfluidic יש איכויות אופטיות הניתנות להשוואה לזכוכית 17 והשיפועים של מולקולות diffusible הם יציבים במשך לפחות 16 שעות. המערכת יכולה לשמש לשיטות מיקרוסקופיה epifluorescence ומתקדמות. בניגוד setups Chemotaxis האחר 18, מערכת זו היא מתאימה להקלטה נודדת לאט תאים, נדבק. חשוב לציין, המערכת היא מודולרית, ומאפשרת בקלות את ההקדמה של דבק חלופי או רמזי הגירה מסיסים ובחינה של סוגי תאים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פסיבציה של Coverslips זכוכית עם PLL-PEG-ביוטין

צעד זה נועד passivate פני השטח כך שתאים לדבוק ונודדים אל אזורים ספציפיים על coverslip הזכוכית שנוצרים עם הדפסת microcontract (שלב 2-3 א) או לטבול יתוגרפיה העט (שלב 3 ב). לפסיבציה, שיתוף פולימר של פולי-L-ליזין (PLL) ופוליאתילן גליקול (PEG) משמש בו 20% ממולקולות PEG הם השתילו לביוטין (PLL-PEG-יוטין).

  1. כדי לנקות coverslips הזכוכית (18 מ"מ x 18 מ"מ), משקיע אותם במדף באתנול 100% ולהציב את המדף באמבטית sonicating למשך 30 דקות. ייבש את coverslips הזכוכית באוויר או מתחת לזרם של חנקן.
  2. בשלב הבא, sonicate את coverslips הזכוכית עבור 30 דקות בM NaOH 1. לאחר מכן יש לשטוף את משטחי זכוכית על ידי טבילת המדף בזהירות בכוס מלאה ב1.5 הליטר מילי-Q H 2 O. חזור על תהליך שטיפת שלוש פעמים באמצעות טרי מילי-Q H 2 O בכל פעם. ייבש את הזכוכית בcoverslipsתנור ב 60 ° C.
  3. מניח מחצית הזכוכית הנקיה coverslips בנפרד בתא לח, שעשוי מצלחת 24 גם מלאה חלקית עם H 2 O. ירידה של 15 μl של PLL-PEG-ביוטין (1 מ"ג / מ"ל) ב PBS על כל coverslip זכוכית. קח את החצי השני של coverslips הזכוכית הנקיה שנותר ובזהירות כריך פתרון PEG. השאר את coverslips לשעה 1 בתא הלח. הסט את coverslips הדחוק בעדינות אחד מהשני ללא מגרד את פני השטח PEG המצופים ולשטוף אותם עם מילי-Q H 2 O. המים צריכים להחליק בקלות בצד PEG-טופל. במידת צורך, את coverslips אוויר היבש במגבת נייר הזכוכית עם פני שטח המטופלים פונה כלפי מעלה. אחסן את coverslips הזכוכית בתא ייבוש ואקום עד לשימוש נוסף.

2. המצאה של חותמות להדפסת microcontact

אנו מתארים שני תהליכים למסלולי streptavidin דפוס על גבי זכוכית coverslips פסיבציה. הראשון, כניסת המיקרופוןהדפסת rocontact, בדרך כלל דורשת ייצור של אדון סיליקון שממנו חותמת PDMS נפלה. במקרה שלנו, הדפוס על בול PDMS הם 100 קווי רוחב מיקרומטר שהם מרווחים 290 מיקרומטר מרכז למרכז בגובה תכונה של 25 מיקרומטר. בהמשך, נתאר בקצרה כיצד לפברק אדון מתאים סיליקון (שלב 2.1-2.3) וחותמת PDMS (שלב 2.4). עם זאת, קיימים פרוטוקולים מרובים עבור הדפסת microcontact תוארו בספרות 19-23, אשר מתאימות להדפסת תבניות חלבון על coverslips זכוכית. מאסטרס יכול גם להיות מותאם אישית עשה ונרכש ממקורות מסחריים.

  1. ראשית, לנקות את פרוסות סיליקון (4 "בקוטר) על ידי הדגרתו בפתרון Piranha (03:01 v: v של חומצה גופרתית ומי חמצן 30%). במשך 20 דקות יש לשטוף ביסודיות הרקיק 10 פעמים עם MilliQ H 2 O. ייבש את הפרוסות בתנור בחום של 150 מעלות CO / נ
  2. שוטף את הפרוסות נקיות ויבשות סיליקון עם אצטון 100%, ואחריו באלכוהול רפואי 100%. הבא2 מיליליטר ספין מעייל של GM1070 SU-8 photoresist (Gersteltec Sarl) על גבי פרוסות סיליקון ב3100 סל"ד ל 40 שניות כדי ליצור שכבה עבה מיקרומטר 25. אז המדגם אפה על צלחת חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחרי 5 דקות נוספות ב 95 ° C.
  3. לחשוף את SU-8 photoresist לאור UV במשך 60 שניות תחת photomask עם התבנית הרצויה (לדוגמה באמצעות Quintel Q6000 מסכת aligner) וחזור על תהליך האפייה לתאר ב2.2. אז המדגם הוא פותח על ידי טבילה ברקיק SU-8 מפתח (Gersteltec Sarl) במשך 4 דקות, נשטפו באלכוהול רפואי 100% והתייבשו תחת זרימת חנקן. האזור של photoresist SU-8 שלא נחשף לקרינת UV ובכך הוסר, יצירת התבנית ההפוכה של בול PDMS.
  4. השלב הבא הוא להטיל חותמת PDMS מן אדון סיליקון. ראשית, ביסודיות לערבב חלק 1 (w / w) של סוכן הריפוי עם 10 חלקי prepolymer אלסטומר (Sylgard 184). כדי להסיר כל בועות אוויר, דגת התערובת בתא ייבוש המצורף לקו ואקוםלשעה 1. בשלב הבא, שופך אלסטומר PDMS על אדון סיליקון בתוך צלחת הפטר לכ 1 סנטימטר בגובה ולרפא את התערובת ואדון PDMS בתנור בחום של 70 מעלות צלזיוס במשך השעה 1. לבסוף, חותמת PDMS יוסרה מאדון סיליקון ולחתוך לגודל.

3. Streptavidin דפוסים או רמזים דבקים על Coverslips הזכוכית פסיבציה

לאחר passivating coverslips זכוכית, דפוסי חלבון מודפסים עם הדפסת microcontact (3a סטפ) או ליתוגרפיה מטבל עט (שלב 3 ב). במקרה שלנו, streptavidin מודפס כקווים, המהווים את הבסיס לשיפועי RGD (שלב 4). אותו הנוהל יכול לשמש גם להדפסת חלבוני מטריצה ​​ליצור דפוסים דבקים.

שיטה חלופית להדפסת microcontact לדפוסים של ביומולקולות על משטחים היא לטבול יתוגרפיה עט. בטבילת יתוגרפיה העט, שלוחה משמשת להעברת נפח קטן של פתרון על פני השטח. גודל cantilevers, viscosity מהפתרון, פנה זמן של השלוחה על פני השטח, hydrophobicity של פני השטח והלחות בתא הדפוס לקבוע את הגודל של התכונות המודפסות. יתרונה של שיטה זו הוא שדפוסים שונים ניתן להדפיס עבור כל ניסוי, שכן אין צורך לפברק אדונים ובולים. החסרון הוא שזה לוקח יותר זמן להדפיס דפוס נתון ושטבילת יתוגרפיה העט דורשת מכשיר מומחה שלא יהיה זמין במעבדות רבות. מכשיר יתוגרפיה בעט שהשתמשנו היה NanoeNabler מBioforce הנם. כאן, אנו מודפסים נקודות קטנות שהיו <10 מיקרומטר בקוטר, שעבורו השתמש SPT10 cantilevers.

3 א. Microcontact הדפסת טכניקה (μCP)

  1. לנקות ולהפוך את חותמת PDMS הידרופילי יותר, לטפל בצד הדוגמת מבולי PDMS בUV ואוזון (לדוגמא Procleaner, UV אוזון מBioforce הנני) עבור 1.5 שעות. לחלופין, השתמש בפלזמהמנקה לזמן קצר יותר לאותה המטרה. תהליך זה יוצר חמצון PDMS 24 פני שטח, אשר משפר את תהליך ההדפסה.
  2. מייד לאחר הטיפול באוזון או פלזמה, המקום והתפשטו 10 streptavidin μl (1 מ"ג / מ"ל ​​ב PBS) על גבי בולי PDMS ולהשאיר לשעה 1 בתא לח (כגון צלחת 6-גם מלאה חלקית, ראה שלב 1.3) . אם רצועות צריכות להיות גלויות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי, השתמש streptavidin שהוא מצומדת לfluorophore כגון streptavidin-AlexaFluor350.
  3. הסר streptavidin העודף מהבול ​​בממחטות נייר ואוויר ייבש את החותמת לכ 1 דקות. לחץ קל על חותמת coverslip הזכוכית PLL-ביוטין המצופה PEG.
  4. אם ניאון streptavidin שמש ב3.a2 השלב, לבחון את דפוס שימוש תחת מיקרוסקופ epifluorescence. אחסן משטחים מודפסים בייבוש.

ב 3. טובלי יתוגרפיה העט

  1. ראשית, לערבב חלק 1 של 1 מ"ג / מ"ל ​​או streptavidin streptavidin-AlexaFluor350 עם 10 חלקים של גליצרול (v / v) ולטעון 5 μl של התערובת על השלוחה. ואז להתחיל בתהליך ההדפסה, כמתואר במדריך לפעולת מכשיר יתוגרפיה בעט. כדי להקטין את גודל המקום לכ 5 מיקרומטר, להתאים את מהירות הדפסה, לפנות זמן של השלוחה על פני שטח או אנכי המרחק של השלוחה אל פני השטח. בדוגמא שמוצגת באיור 2 ג, נקודות הודפסו בקנה אחד עם שורה ועמודת הפרדה המוגדרת 10-15 מיקרומטר. מרחק זה הוא מספיק כדי למנוע נקודות ממתמזגות זה בזה, אך מאפשר צפייה בנקודות מרובות בשדה אחד של נוף עם רוב ההגדרות המיקרוסקופ.
  2. אחסן משטחים מודפסים בייבוש.

4. יצירת Gradients דבק על משטחי streptavidin-דפוס

אנו יוצרים גרדיאנטים דבקים של ביוטין RGD-coverslips על הזכוכית כי הם מצופים בstreptavidin (3 איור) או שיתוףדפוסי ntain streptavidin על coverslips הזכוכית פסיבציה (איור 5). כדי ליצור שיפוע פני שטח, השתמש מכשיר microfluidic זמין מסחרי (הנקרא דביקה שקופיות Chemotaxis 3D מIbidi) שיוצר שיפוע פתרון יציב על ידי דיפוזיה פסיבית. להתחרות על אתרי הקישור streptavidin העסקנו 2 שיפועים מנוגדים של ביוטין-RGD וביוטין שלא היו מוצמד לRGD (ראה תרשים 1).

  1. צייה את coverslips הדוגמת או זכוכית streptavidin המצופים אל הצד הדביק של מכשיר 3D-Slide הדביק Chemotaxis. כדי לוודא שאין דליפה לכמה שעות, את הקצוות של המכשיר אטומים בשכבה דקה של וזלין התחמם ועם שכבה שנייה של תערובת של חלק 1 של וזלין לחלק 1 של שעוות פרפין (w / w).
  2. מלא הערוץ של המכשיר עם 6 PBS μl בערוץ. ואז למלא את שני מאגרים עם 70 μl של 0.03 מיקרוגרם / μl ביוטין-4-fluorescein ב PBS ו70 & mu; הליטר של 0.03 מיקרוגרם / μl ביוטין-RGD ב PBS, בהתאמה. דגירת הדגימות בRT בחושך לשעה 1.
  3. הסר את פתרוני ביוטין ולשטוף את המשטח בזהירות תוך עדיין מחובר למכשיר microfluidic פעמים עם PBS. סמן את כיוון שיפוע הדבק ואם יש צורך, לאחסן את המכשיר מלא PBS ב 4 ° C לאך יש לוודא שהמכשיר לא יתייבש. במידת צורך, לנתח את שיפוע הדבק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. Labelling של תאים עם fluorophores להדמית תא חייה

תאים מסומנים עם צבעי ניאון המסייעים מעקב תא מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדיקות נפוצות הן סמני אברון ניאון, כגון Syto 64 אדום, שמתייג את גרעין התא. לשם כך, תאים נשטפים 1 שלוש פעמים עם PBS, אז מודגרות עם 64 מיקרומטר אדומים 1 Syto בתקשורת התרבות עבור 45 דקות ולבסוף שטפו שלוש פעמים נוספות עם PBS. שים לב שתאים לא צריכים להיותהמשיך בPBS לתקופות זמן ארוכים.

צבעים חלופיים למעקב תא הם סדרת CellTracker שכתם ציטופלסמה ונשמרים במהלך נדידת תאים וחטיבה. Transfection של תאים עם חלבון היתוך ניאון שימושי במיוחד כדי להקליט את הפצות subcellular של חלבון של עניין במהלך נדידה. עם זאת, בדרך כלל חלבוני ניאון צילום אקונומיקה מהר יותר מאשר צבעים אורגניים, כך שתצפיות ארוכות הטווח עשויים להיות בלתי אפשריים.

6. טעינה של תאים בצבע מסיס להתקני מיקרופלואידיקה

  1. ספירת תאי fluorescently הכותרת והתפצל לשני צינורות של מספרים סלולריים שווים. שטוף וresuspend שפופרת אחת של תאים עם מדיה המכילה chemoattractant, כגון הנשר השתנה בינוני הנמוך של גלוקוז Dulbecco (DMEM) עם סרום שור עוברי (10% FBS). שטוף וresuspend צינור האחר של תאים בתקשורת בלי chemoattractant, כלומר DMEM עם 0% FBS. הריכוז הסופישל תאים בכל צינור צריך להיות 5 x 10 5 תאים / מ"ל.
  2. הסר את כל הפתרונים ממכשיר microfluidic (משלב 4.3) ומניח אותו על במת מיקרוסקופ (ראה שלב 7). טען 70 μl של תאים (5 10 5 תאים / מ"ל x ב 0% DMEM FBS) לתוך מאגר אחד ו70 μl של תאי הלה (5 ​​10 5 תאים / מ"ל בx 10% DMEM FBS) לתוך אחר. רופף למקם סרט על המאגרים, כדי למנוע אידוי. אם תאים על פני השטח הם מראש מודגרות לפני ההדמיה, רצוי שהתאים נטענים למכשיר בתקשורת צמיחה ללא שיפוע. אז המכשיר מונח על במת מיקרוסקופ והתקשורת הוחלפה בשיפוע התקשורת כלומר ללא DMEM FBS באחד מאגרים וDMEM עם 10% FBS ביד השנייה.

7. חי הדמית תא וניתוח נתונים

  1. הפעל את המיקרוסקופ (ניקון TI-E) ולחמם את שלב שעות לפחות 1 לפני תחילת הניסוי.
  2. ודא שהערוץ של micrמכשיר ofluidic הוא בשדה הראייה ותאים נמצאים בפוקוס. בחר פרמטר רכישת תמונה כגון זמני חשיפה ומסנני ניאון, רצף תמונות של שדה ופלואורסצנטי הבהיר שלוכד תאים ומסלולים כמו גם נקודתי זמן ואורך הקלטה (למשל כל 15 דקות במשך 16 שעות).
  3. נתח את הנתונים עם תוכנות מתאימות, כגון מעקב ImageJ הידני או Ibidi Chemotaxis וכלי להעברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להבין כיצד תא לשלב אותות נודדים 25, פתח שיטה לתמונת תאים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי שנודדים בסביבה עם שיפועים דבקים ומסיסים מתחרים (איור 1). רצועות דבקות שהכילו streptavidin ניאון וRGD biotinylated נוצרו עם רצועות microcontact המודפסות ולטבול יתוגרפיה העט (איור 2). הדפסת microcontact מוצלחת מצוינת על ידי קו הפרופיל של עוצמת הקרינה שבו חוצה את מסילת פסי דבק ואזורים אנטי עכירות יכולים בבירור ניתן להבדיל (האיור 2b). הנקודות מודפסות עם מטבל יתוגרפיה העט להיראות עגול, לא לקרוע צורה, המציין תהליך הדפסה מוצלחת. כימיה של פני שטח ולחות משפיעות על התוצאות של תהליך ההדפסה. באופן כללי, יותר הידרופובי על פני השטח הם, טוב יותר את תוצאות ההדפסה.

שיפוע של רמזים דבקיםעל המסלול המודפס נוצרו עם מכשיר מיקרופלואידיקה פשוטה על ידי טעינת ביוטין-4-fluorescein וביוטין RGD-לצד השני של תא microfluidic (3 איור). מכיוון ששתי המולקולות נקשרות תחרותית למסלול streptavidin על משטח הזכוכית, שיפוע משותק של ligands RGD שנוצר. לאחר הסרת פתרון RGD יוטין ביוטין /, באותו חדר יכול לשמש כדי להציג את שיפוע מסיס, שהוא יציב בתוך ערוץ microfluidic עבור לפחות 16 שעות (איור 4).

אנחנו הצגנו תאי הלה לקאמרי עם שיפוע chemoattractant, שעבורו FBS היה בשימוש. בצפיפויות נמוכות, תאי הלה דבקו מעדיפים ולנדדו על פסי streptavidin / RGD (תאי N = 50) ונמנעו מאזורי PEG אנטי העכירות (תאי N = 19). העמדה של תאים בודדים נרשמה מעל 16 שעות ונתחה עם תוכנת מעקב סלולרי. בניסוי שבו דבק וsoluשיפועי ble מתנגדים זה לזה (איור 5), את המסלולים של תאים בודדים הראו כי יותר תאי הלה נדדו לכיוון המקור של (העקבות האדומות באיור 5c, N = עקבות 36) chemoattractant מכיוון ריכוזים גבוהים יותר של RGD חסיד (שחור עקבות באיור 5c, N = 14) עקבות. המרחק הממוצע שתאים נדדו נגד (עקבות שחורות) או ב( עקבות אדומות) לכיוון שיפוע FBS (x-מרכיב של עקירה ממוצעת של כל מסלול) היו 0.1700 ± 0.1172 0.2278 ו± 0.1280, בהתאמה (p <0.0001, סטודנטים מבחן t) למרות שלא היה הבדל משמעותי סטטיסטי בתזוזה ממוצעת בין העקבות השחורות (56.18 ± 32.27 מיקרומטר) ואת העקבות האדומות (72.86 ± 45.05 מיקרומטר, P> 0.05, סטודנטי מבחן t). תאי הלה נודדים עם מהירות ממוצעת של 17.47 ± 4.72 מיקרומטר / שעה בנוכחות שניהם השיפוע של דבקרמז רמז (כלומר RGD) ומסיס (כלומר FBS). הנתונים מצביעים על כך שכן לתאי הלה, שיפוע FBS מקובע את הכיוון של הגירה ואילו תאים לשמור על מהירות הגירה פנימית על פסי הדבק.

גם הערכנו את ההגירה של שורת תאי macrophage J774. בהעדר שיפועים דבקים ומסיסים, תאים אלו נודדים במהירות גבוהה בהרבה (38.55 ± 17.88 מיקרומטר / שעה) מאשר תאי הלה (16.47 ± 4.28 מיקרומטר / שעה) אבל עם התמדה פחות כלומר כיוון שינוי התאים J774 (הכיווניות של 0.059 ± 0.091 ), נמדד כיחס של עקירה כדי לעקוב אחר אורך לעתים קרובות יותר מאשר תאי הלה (0.57 ± 0.12) על פסי פיברונקטין microcontact מודפסת. J774 תאים גם פחות תלוי קשר מתאי הלה. התזוזה של J774 תאים הייתה גבוהה יותר באזורי PEG (102.20 ± 54.73 מיקרומטר) מאשר במסלולי פיברונקטין (42.95 ± 39.90 מיקרומטר). בנוסף, תאים של J774ppeared להסתגל לכימיה של פני שטח שונה על ידי שינוי המנגנון של הגירה מmesenchymal לamoeboid. לסיכום, רמזים דבקים הם לא חשובים כמו לJ774 תאים כפי שהם עבור תאי הלה. שני סוגי התאים נדדו מעדיפים לכיוון של המקל המסיס.

איור 1
איור 1. סכמטי של תהליך הייצור של התקנת microfluidic המאפשר הדמיה של תאים נודדים להגיב לשיפועים מנוגדים של רמזים דבקים לעומת מסיסים.. Coverslips מזכוכית עם פסיבציה biotinylated PLL-PEG. ב. דפוסי דבקים המכילים streptavidin ניאון מודפסים על biotinylated משטח או כשורות באמצעות הדפסת microcontact (ב) או נקודות באמצעות טבילת יתוגרפיה העט (ב '). ג. ד. תאים ושיפוע chemoattractant מסיס של 0-10% FBS נטען לתוך מכשיר microfluidic. לאחר תאים לדבוק פני השטח, לחיות נדידת תאים מעל שיפועי RGD על פסי streptavidin ובנוכחות הדרגתית FBS ניתן הדמיה בערוץ המחבר בין שני מאגרים.

איור 2
איור 2. דפוסים דבקים סלולריים (קווים ונקודות) יכולים להיות שנוצרו עם שתי טכניקות הדפסה שונות תמונה של פלורסנט microcontact מודפסת AlexaFluor350 streptavidin מסלולים (ABS: 346 ננומטר, ארן: 442 ננומטר, אפור).. על coverslips זכוכית-PEG המצופה PLL. מסכת הדפסת microcontract תוכננה כקווים שהיו ברוחב של 100 מיקרומטר עם 290 מיקרומטר מרכז ללסה"נnter חלל. ב. עוצמת הניאון הממוצעת של microcontact מודפסת מסלולי streptavidin, כפי שמוצגים ב, מחמישה משטחים נפרדים כחתכים מלמעלה עד למטה. רוחבו הממוצע של המסלול הוא 90 ± 6 מיקרומטר ואת המרווח הממוצע מרכז למרכז הוא 293 ± 2 מיקרומטר. ג. תמונת brightfield של נקודתי streptavidin המכילים נוצרו עם מטבל יתוגרפיה העט. בקטרים ​​של הנקודות נעים 6-9 מיקרומטר עם 15 מיקרומטר חלל מרכז למרכז. ברי היקף וב ג הם 100 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. ביוטין-4-fluorescein שיפוע (0 מיקרוגרם / μl - 0.03 מיקרוגרם / μl). חברה במשטחי זכוכית מצופים באופן אחיד עם streptavidin ביוטין-4-fluorescein וביוטין-RGD הועמסו בשני המאגר של מכשיר microfluidic (-Slide הדביק Chemotaxis 3D , Ibidi) שהםמחובר בתעלה ארוכה 1 מ"מ. לאחר דגירת 1 שעות, המכשיר נשטף עם PBS ומילא עם PBS.. 60 תמונות פסיפס נלקחו באורך כולל תמונה 3072 מיקרומטר וב עוצמת הקרינה נמדדה על פני האורך של כל הפסיפס. קווי מגמה לינארית הותאמו לעוצמת קרינה כדי לציין את שיפוע RGD בערוץ.

איור 4
איור 4. עוצמת הקרינה של fluorescein שיפוע (0 - 1 מיקרומטר מיקרומטר) בערוץ microfluidic מייד לאחר התקנה (ט = 0 שעות) ולאחר דגירה ב 16 שעות PBS בלי ועם 1 מיקרומטר fluorescein נטען מימין ומהשמאל. מאגר של מכשיר microfluidic (דביקת שקופיות Chemotaxis 3D, Ibidi), בהתאמה. ערוץ microfluidic הוא 1 מ"מ באורך ובהוא נמצא בעמדה 50 עד 1050 מיקרומטר. השיפוע היה יציב במשך לפחות 16 שעות.

איור 5
איור 5. הגירת הלה תא במיקרופלואידיקה קאמרית (דביקה שקופיות Chemotaxis 3D, Ibidi) עם התנגדות שיפוע דבק (משותק RGD על פסי streptavidin) ושיפוע מסיס (0-10% FBS).. תמונה מייצגת של תאים בתא עם מיקרופלואידיקה התנגדות הדרגתית. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. b תמונות זמן לשגות של תא נלקח עם מיקרוסקופ epifluorescence (ניקון TI-E). תמונות צולמו במרווחים של 15 דקות ל20 שעות ומסלול תא (קו כחול) שהושג באמצעות מיצוב centroid תא (תוסף מעקב הידני ImageJ). סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. ג מסלול. סלולרי מתמונות כפי שמוצג בב. התא trajectories שהגר לריכוז הגבוה יותר של FBS המסיס מוצגים באדום (עקבות N = 36); מסלולים סלולריים שהגרו לריכוזים גבוהים יותר של RGD חסיד מוצגים בשחור (עקבות n = 14). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו משמשים מכשיר microfluidic זמין מסחרי (דביקת שקופיות Chemotaxis 3D מIbidi) כדי לחקור את ההשפעות של משטחי שינוי כימי והדרגות chemoattractant על ​​נדידת תאים. התקנת microfluidic זה אינה דורשת זרימה בגלל השיפוע הוא הוקם על ידי דיפוזיה לאורך הערוץ. זה חשוב כי תזרים יכול להשפיע באופן דיפרנציאלי תאים נודדים לאט כגון פיברובלסטים שיוצרים הידבקויות מוקד יציבות ותאים נודדים מהירים כמו רוב leukocytes שיוצרים מתחמי מוקד קטנים וסינפסות 26. מאמץ גזירה מהזרימה למינרית עשוי להשפיע על היציבות של הידבקות תא לרמזים דבקים וChemotaxis הסלולרי כלפי רמזים מסיסים 27,28. מצאנו הבדלים בהתנהגות נדידה בין תאי אטי הלה וJ774 תאים שנעים במהירות ובכך שהראו כי התקנת microfluidic היא ישימה עבור שני סוגי תאי החסיד וחסיד פחות. השוואות כאלה גם ביהבדל מעניין בין סוגי התאים ד בתגובות הידבקות והגירה לדפוסי משטח שהכילו שני רמזים דבקים (פפטידים או פיברונקטין RGD) ואזורים אנטי עכירות (אזורי PEG).

דפוסי משטח נוצרו עם הדפסת microcontact 29 ויתוגרפיה מטבל עט 30,31. הדפסת microcontact היא תהליך פשוט ומהיר יחסית, לשעתק דפוסים. עם זאת, העיצוב והייצור של חותמת PDMS, אשר מושגים על ידי photolithography, הוא יותר מעורב וזמן רב. הוא גם מציג מגבלות משלו בכך שתכונות הקטנות (<5 מיקרומטר) קשה להשיג ותלוי ביחסו של הדפוס. בקיצור, הדפסת microcontact היא אידיאלית עבור דפוסים גדולים עד מאה גודל מיקרון ובניסויים, שבו אותם דפוסים צריכים נוצרו פעמים רבות. מצד השני, לטבול יתוגרפיה הסיכה יכולה לשמש כדי ליצור מיקרון לדפוסי nanoscaled. זה מתאים יותר לנקודתי דפוסמקווים, אם כי קווים יכולים להיות מפוברקים. טובלי יתוגרפיה הסיכה מעניקה חופש גדול יותר בעיצובי דפוס, שכן אין צורך במראש מפוברקים-מסכות, אדונים או בולים. עם זאת, המהירות של תהליך הדפוסים היא איטית, מה שהופך את הדפסתם של אזורים מסורבלים וגישה למכשיר מיוחד גדולים היא קריטית. שתי שיטות הדפוסים רלוונטיות לשיקול בגלל הגודל והצורה של דפוסי קיו דבקים להשפיע על הארגון וההפצה של machineries יומכניים המווסת את נדידת תאים 32,33. בנוסף, ההגבלה של מכשיר microfluidic המסחרי מועסק כאן היא שאורך הערוץ (1 מיקרומטר) אינו ניתן לשינוי ולכן לא ניתן לשלוט בתלילות המרבית של השיפועים הדבקים ומסיסים. אם שיפועים תלולים יותר נחוצים, אחד היה צריך להמציא מכשיר microfluidic עם ערוץ קצר בין שני המאגרים. יתרון מרכזי של הפרוטוקול המתואר כאן הוא עיצוב מודולרי, כך שsu השונהrfaces, chemistries משטח, גישות ודפוסי מכשירי microfluidic יכולים להיות משולב עבור מגוון רחב של ניסויי הדמית תא חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו אינטרסים מסחריים כדי לגלות.

Acknowledgments

החוקרים מכירים במימון מהמועצה למחקר האוסטרלית והבריאות הלאומיות ומועצה למחקר הרפואי של אוסטרליה וגם רוצים להודות המתקן הלאומי באוסטרליה ייצור עבור SU-8 האב להדפסת microcontact. SHN נתמך על ידי משרד חינוך הגבוהה למלזיה וUniversiti Sains מלזיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass staining outfits Thomas Scientific 8542 E40 Coverslip rack
Oven Binder ED 53 series
Silicon wafer Silicon Quest 708-007 Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist Gersteltec Sarl
SU-8 developer Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%) SuSos AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) 1 mg/ml in PBS
Fluorescein Sigma 46955 1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249 1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein Invitrogen B-1370 0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD GenScript SC1208 0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red Invitrogen S-11346 1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D Ibidi 80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip Greiner Bio-One 739261
Vaseline Sigma 16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C Sigma 327204
Nano eNabler 10 μm cantilever BioForce SPT-S-C-10s
Image J software National Institute of Health rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin Fabrice Cordelières rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool Ibidi GmbH www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Tags

Bioengineering גיליון 74 מיקרוביולוגיה ביולוגיה תאית ביוכימיה ביולוגיה מולקולרית ביופיסיקה נדידת תאים הדמית תא חייה שיפועים מסיסים ונדבק הדפסת microcontact לטבול יתוגרפיה עט מיקרופלואידיקה RGD PEG ביוטין streptavidin chemotaxis chemoattractant הדמיה
יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., … More

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., Tønnesen, L., Fairjones, Z., Gooding, J. J., Böcking, T., Gaus, K. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (74), e50310, doi:10.3791/50310 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter