Summary
इस वीडियो में, हम जटिल तंत्रिका सर्किट को बरकरार रखता है जो एक पूरे मस्तिष्क तैयारी में पहचान की एकल न्यूरॉन्स से बिजली की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए प्रदर्शन करेंगे. हम जननग्रंथिपोषी रिहा हार्मोन (GnRH) न्यूरॉन्स आनुवंशिक रूप से बरकरार मस्तिष्क तैयारी में पहचान के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग कर रहे हैं, जिनमें ट्रांसजेनिक मछली का उपयोग करें.
Abstract
जटिल व्यवहार को विनियमित कि तंत्रिका परिपथों की सेल शरीर क्रिया विज्ञान को समझना यह काम सीएनएस के तंत्रिका circuitry बरकरार है जहां एक अक्षुण्ण मस्तिष्क तैयार करने में किया जा सकता है, जिसमें मॉडल प्रणाली का उपयोग करके बहुत बढ़ाया है. हम जननग्रंथिपोषी रिहा हार्मोन (GnRH) न्यूरॉन्स आनुवंशिक रूप से बरकरार मस्तिष्क में पहचान के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग कर रहे हैं, जिनमें ट्रांसजेनिक मछली का उपयोग करें. मछली GnRH न्यूरॉन्स के कई आबादी है, और उनके कार्यों को अपने मस्तिष्क में स्थान और वे 1 व्यक्त कि GnRH जीन पर निर्भर हैं. हम ट्रांसजेनिक Medaka मछली के बरकरार मस्तिष्क (चित्रा 1 बी और सी) का उपयोग घ्राण बल्ब के साथ जुड़े टर्मिनल तंत्रिकाओं (तमिलनाडु) में स्थित GnRH3 न्यूरॉन्स पर हमारे प्रदर्शन ध्यान केंद्रित किया है. अध्ययन Medaka तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए बाहरी वातावरण से जानकारी की एक ट्रांसमीटर के रूप में अभिनय, neuromodulatory बताते हैं कि, tहे के रूप में प्रसिद्ध हाइपोथैलेमस GnRH1 न्यूरॉन्स 2, 3. तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स की सहज कार्रवाई संभावित गोलीबारी के टॉनिक पैटर्न एक आंतरिक संपत्ति 4-6, आवृत्ति है, पीयूषिका-gonadal कार्यों को विनियमित करने में एक प्रत्यक्ष भूमिका निभा नहीं है जिनमें से conspecifics 2 और neuropeptide kisspeptin 1 5 से दृश्य cues द्वारा संग्राहक है. इस वीडियो में, हम तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स कैसे न्यूरॉन्स की पहचान और पूरे दिमाग में उनकी बिजली की गतिविधि पर नजर रखने के लिए आप को दिखाने के लिए बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 7 से जुड़ा हुआ Gnrh3 के प्रमोटर क्षेत्र युक्त एक transgene व्यक्त जिसमें ट्रांसजेनिक Medaka की एक स्थिर लाइन का उपयोग तैयारी 6.
Protocol
1. वयस्क Medaka से दिमाग के विच्छेदन
- में डुबो कर (चित्रा 1 ए) पुरुष या महिला वयस्क चतनाशून्य 5 मिलीलीटर एमएस-222 (150 मिलीग्राम / एल, 7.4 पीएच), गहरे नाले आंदोलनों मारने का इरादा बनाया से पहले बंद कर दिया गया है के बाद कुछ मिनट प्रतीक्षा करें. सभी प्रक्रियाओं कैलिफोर्निया लॉस एंजिल्स के विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
- एक 60 मिमी व्यास पेट्री डिश में कैंची से operculum की दुम अंत में मछली खारा में मछली सिर काटना.
- एक 35 मिमी व्यास पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण मछली सिर, आधा नमकीन मछली से भरा है और मस्तिष्क विच्छेदन के लिए सिर की स्थिति और सुरक्षित करने के लिए यह एक अवसाद है कि Sylgard के साथ खड़े हैं. स्थिति और कीट पिन के साथ सिर पृष्ठीय साइड सुरक्षित.
- ध्यान से ठीक कैंची के साथ अपनी परिधि के आसपास खोपड़ी के पृष्ठीय हिस्सा काट कर धीरे पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी के पूर्वकाल भाग सहित मस्तिष्क के पृष्ठीय भाग उजागर संदंश के साथ इसे हटा दें. <ली> ठीक टिप संदंश के साथ धीरे रीढ़ की हड्डी उठाकर ठीक इत्तला दे दी कैंची के साथ द्विपक्षीय संयोजी नसों तोड़: मस्तिष्क के उदर पक्ष पर कपाल नसों, रीढ़ की हड्डी में तंत्रिकाओं, और ऑप्टिक नसों, और के पूर्वकाल भाग में घ्राण नसों मस्तिष्क.
- मछली खारा से भरा एक ताजा पेट्री डिश में पूरी तरह से विच्छेदित मस्तिष्क, जगह और पूरे दिमाग किसी भी कटौती या punctures के बिना (पिट्यूटरी ग्रंथि सहित) बरकरार है यह सुनिश्चित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे ध्यान से जाँच करें. क्षतिग्रस्त दिमाग के प्रयोग के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं.
2. एक रिकॉर्डिंग चैंबर में ब्रेन बढ़ते
- Cyanoacrylate की एक छोटी सी बूंद या रिकॉर्डिंग कक्ष के केन्द्र में एक सुई के साथ कुछ अन्य तेजी से अभिनय गोंद प्लेस और 1 सेमी 2 के बारे में गोंद फैल गया.
- जल्दी से एक उदर की ओर ऊपर की स्थिति में मस्तिष्क और गोंद यह नीचे हस्तांतरण.
- यह रिकॉर्डिंग कक्ष भरता है और मस्तिष्क को शामिल किया गया है ताकि मछली खारा के 1 मिलीलीटर जोड़ें. लगातार छिड़कनाकम से कम 200 μl / मिनट की दर से वातित मछली नमक के साथ मस्तिष्क.
- ठीक टिप का उपयोग सावधानी से मस्तिष्क की रिकॉर्डिंग क्षेत्र की सतह पर तानिका हटाने संदंश.
3. विद्युतशरक्रिया विज्ञान
- कार्रवाई संभावित गोलीबारी के ढीले पैच रिकॉर्डिंग
- ग्लास microelectrodes (MΩ 6-10) एक इलेक्ट्रोड खींचने (जैसे Sutter P-87) का उपयोग borosilicate ग्लास pipettes (1B150F -4, विश्व परिशुद्धता उपकरण) से निर्माण, और वापस आधे रास्ते को ढीले पैच रिकॉर्डिंग समाधान के साथ भर रहे हैं इलेक्ट्रोड.
- एक ठंडा प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा के साथ एक ईमानदार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का प्रयोग, GFP-व्यक्त 10x के माध्यम से तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स (चित्रा 1 बी), तो 40x पानी विसर्जन उद्देश्यों (चित्रा 1C) हैं. वे telencephalon को सिर्फ पूर्वकाल घ्राण बल्ब, के उदर की सतह पर या उसके निकट स्थित हैं.
- प्रदान कर रहा है कि एक वीडियो की निगरानी के लिए स्विचमाइक्रोस्कोप से वास्तविक समय छवियों तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन क्लस्टर (चित्रा 1C) का पता लगाने के लिए.
- इलेक्ट्रोड की नोक न्यूरॉन लक्ष्य से ऊपर है ताकि स्नान में microelectrode स्थिति. यह बन भरा हुआ है, और धीरे इलेक्ट्रोड की नोक के साथ लक्ष्य न्यूरॉन दृष्टिकोण नहीं है कि इतनी microelectrode के लिए निरंतर मामूली सकारात्मक दबाव लागू करें.
- AxoGraph सॉफ्टवेयर और Axograph सॉफ्टवेयर (एक्जॉन उपकरण) के साथ एम्पलीफायर Axoclamp 200B उपयोग कर वोल्टेज दबाना मोड में इलेक्ट्रोड प्रतिरोध की जाँच करें और निगरानी. आप इलेक्ट्रोड की नोक न्यूरॉन की सतह पर और प्रतिरोध थोड़ा परिवर्तन कि AxoGraph प्रदर्शन से है कि वीडियो की निगरानी से देख सकते हैं, पर एक कम प्रतिरोध मुहर बनाने के लिए सकारात्मक दबाव जारी है और यदि आवश्यक हो तो थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू न्यूरॉन (<100 MΩ).
- वर्तमान दबाना मोड में स्विच करें, और बड़े पैमाने समायोजन, किसी भी वर्तमान इनपुट के बिना लगातार झिल्ली वोल्टेज रिकॉर्डवोल्टेज और रिकॉर्डिंग यदि आवश्यक हो की दर से. डाटा Powerlab सॉफ्टवेयर (ADInstruments Inc) द्वारा एकत्र की है और विश्लेषण किया जाता है.
- किसी भी उपचार (2A चित्रा) से पहले के बारे में 5 मिनट के लिए सामान्य मछली खारा में रिकार्ड आधारभूत बिजली की गतिविधि. दवाओं, हार्मोन, पेप्टाइड्स, आदि के स्नान छिड़काव. मछली खारा में जोड़ा सामान्य मछली खारा 5, 6, 11 में एक वार्शआउट अवधि के बाद 200 μl / मिनट की दर से जारी है.
- झिल्ली क्षमता के पूरे सेल रिकॉर्डिंग
3.1.4 - पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रक्रिया कदम 3.1.1 से, ऊपर वर्णित कोशिकी ढीले पैच रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के रूप में ही है. तब प्रक्रियाओं के हिसाब से हटना:- वोल्टेज दबाना मोड में इलेक्ट्रोड प्रतिरोध की जाँच करें और निगरानी. आप प्रतिरोध परिवर्तन थोड़ा सकारात्मक जारी है कि इलेक्ट्रोड की नोक न्यूरॉन की सतह पर और आस्टसीलस्कप से है कि वीडियो की निगरानी से देख सकते हैंदबाव और न्यूरॉन (~ 3 गीगा Ω) पर एक उच्च प्रतिरोध सील करने के लिए एक छोटे से नकारात्मक दबाव लागू होते हैं. टूटना समझौता झिल्ली को मुंह से कोमल चूषण लागू करें, आप MΩ बारे में 120-250 के प्रतिरोध के अचानक गिरावट देखेंगे.
- वर्तमान दबाना मोड में स्विच करें, और रिकॉर्डिंग यदि आवश्यक की वोल्टेज और दर के पैमाने पर समायोजन, किसी भी वर्तमान इनपुट के बिना लगातार झिल्ली वोल्टेज रिकॉर्ड.
- किसी भी उपचार से पहले के बारे में 5 मिनट के लिए सामान्य मछली खारा में रिकार्ड आधारभूत बिजली की गतिविधि, के रूप में 3.1.7 (चित्रा 2 बी) में वर्णित है.
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Representative Results
Medaka मछली के excised मस्तिष्क से GFP लेबल तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स की द्विपक्षीय समूहों का एक उदाहरण आंकड़े 1 बी और 1 सी में दिखाए जाते हैं. प्रत्येक क्लस्टर के बारे में 8-10 GnRH न्यूरॉन्स होते हैं. लक्ष्य तमिलनाडु GnRH3 की सहज neuronal गतिविधियों 0.5-6 हर्ट्ज के विशिष्ट फायरिंग दरों के साथ वर्तमान दबाना मोड (मैं = 0) में दर्ज किए गए. कार्रवाई संभावित गोलीबारी के पैटर्न काफी नियमित interspike अंतराल के साथ, आम तौर पर एक टॉनिक या पिटाई पैटर्न है. नमूना निशान चित्रा 2 (:;: पूरे सेल 2 बी ढीले पैच 2A) में दिखाया गया है.
इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण वयस्क zebrafish (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के अग्रमस्तिष्क में स्थित GFP लेबल GnRH न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग में भी सफल रहा है. ढीले पैच (चित्रा -3 सी) और पूरे सेल रिकॉर्डिंग (द्वारा Medaka में ऊपर वर्णित के रूप में excised, बरकरार मस्तिष्क में न्यूरॉन विद्युत गतिविधि समान तरीके से दर्ज की गई थी 
चित्रा 1. इस वीडियो में तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन अध्ययन के लिए इस्तेमाल पशु मॉडल एक: वयस्क Medaka GnRH3: GFP ट्रांसजेनिक मछली, छोड़ दिया: पुरुष, सही:.. महिला बी: अग्रमस्तिष्क के उदर देखने के Confocal छवि. ओबी: घ्राण बल्ब, तमिलनाडु: टर्मिनल तंत्रिका GnRH3 न्यूरॉन्स, टेली: telencephalon; पर:. ऑप्टिक तंत्रिका सी: पैनल बी की सफेद बॉक्स (स्केल पट्टी में दिखाया तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स के उच्च बढ़ाई: एक: 5 मिमी, बी: 100 माइक्रोन, सी: 20 माइक्रोन). 
चित्रा 2. एसपीओवर्तमान दबाना मोड (मैं = 0) में तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स से दर्ज ntaneous कार्रवाई क्षमता एक: ढीले पैच रिकॉर्डिंग से नमूना ट्रेस, बी. पूरे सेल रिकॉर्डिंग से नमूना ट्रेस. 
चित्रा 3. GnRH3 की रिकॉर्डिंग: ईएमडी (पन्ना हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) Medaka मस्तिष्क तैयारी के लिए वर्णित के रूप में एक ही प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर वयस्क ट्रांसजेनिक zebrafish 9 से बरकरार मस्तिष्क तैयारी से न्यूरॉन गतिविधि एक:. GnRH3: उदर telencephalon (वीटी) और preoptic में स्थित ईएमडी न्यूरॉन्स . वयस्क zebrafish के अग्रमस्तिष्क में क्षेत्र (पीओए) बी: GnRH3: हाइपोथैलेमस (hypo) में स्थित ईएमडी न्यूरॉन्स. स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन सी:. GnRH3 से ढीले पैच रिकॉर्डिंग का नमूना ट्रेस: ईएमडी न्यूरॉन मेंवीटी डी:. वीटी से पूरे सेल पैच रिकॉर्डिंग का नमूना ट्रेस.
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Discussion
GnRH 3: GFP ट्रांसजेनिक मछलियों न्यूरोनल एकीकरण और सीधे और परोक्ष रूप से प्रजनन 3, 8-10 में शामिल रहे हैं कि दोनों के व्यवहार के केंद्रीय नियंत्रण में विनियमन अंतर्निहित neurophysiological तंत्र का अध्ययन करने के लिए अनूठा मॉडल उपलब्ध कराते हैं. इस मॉडल प्रणाली के महत्वपूर्ण लाभ में से एक GFP व्यक्त कई GnRH3 न्यूरॉन्स तंत्रिका सर्किट 6, 9, 11, 12 (आंकड़े में खलल न डालें बिना electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए न्यूरॉन्स के लिए अपेक्षाकृत आसान पहुँच के लिए अनुमति देता है, मस्तिष्क के उदर की सतह के करीब हैं कि है 1B और 1C, आंकड़े 3 ए और 3 बी). इस वीडियो में, हम Medaka मछली की अक्षुण्ण वयस्क मस्तिष्क में तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स से दोनों ढीले पैच और पूरे सेल रिकॉर्डिंग से पता चला है. सहज फायरिंग में कोई detectable सेक्स मतभेदों तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स एक टॉनिक या 0.5 6Hz.There की एक आवृत्ति के साथ फायरिंग सहज संभावित कार्रवाई की पिटाई पैटर्न दिखा रहे थेदर 5, लेकिन GnRH3 न्यूरॉन बिजली की गतिविधियों में नाटकीय विकासात्मक परिवर्तन embryogenesis 9 के दौरान वहाँ थे. ढीले पैच और पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अलग पद्धति के फायदे और नुकसान है. ढीले पैच पूरे सेल रिकॉर्डिंग की तुलना में तकनीकी रूप से आसान है, लेकिन केवल न्यूरॉन फायरिंग पैटर्न और आवृत्ति से पता चलता है. आराम झिल्ली क्षमता, फायरिंग पैटर्न और आवृत्ति, कार्रवाई संभावित विश्लेषण, झिल्ली समाई और प्रतिरोध: दूसरी ओर, पूरे सेल रिकॉर्डिंग और अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं. ढीले पैच रिकॉर्डिंग कोशिका झिल्ली को तोड़ने और intracellular आयन और दूसरा दूत सांद्रता को बाधित नहीं है, क्योंकि यह neuronal गतिविधि के दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श है. पूरे सेल रिकॉर्डिंग टूटना कोशिका झिल्ली और अंततः जिससे संभावित अधिक लंबे समय तक रिकॉर्डिंग के साथ न्यूरॉन गुण फेरबदल, इंट्रासेल्युलर अणुओं की डायलिसिस के लिए ले जाते हैं. क्योंकि electrophysi दोनों के फायदे और नुकसान कीological तरीकों, यह दोनों तकनीकों का उपयोग न्यूरॉन गुणों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. पीएच और परासारिता दोनों न्यूरॉन अस्तित्व और समारोह के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि प्रयोग में सब समाधान ठीक से समायोजित करने की आवश्यकता है.
दर्ज न्यूरॉन की पहचान की पुष्टि करने के लिए, नकारात्मक दबाव रिकॉर्डिंग के पूरा होने के बाद लागू किया जाता है, और इलेक्ट्रोड की नोक पर तो प्रतिदीप्ति सूक्ष्म प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करने की पुष्टि की है. छोटे आणविक रंगों या जांच (जैसे एलेक्सा Fluor 568 डाई या biocytin) के रूप में आगे रूपात्मक विश्लेषण के लिए दर्ज न्यूरॉन चिह्नित करने के लिए पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए intracellular समाधान में शामिल किया जा सकता है.
बरकरार मस्तिष्क में लक्ष्य न्यूरॉन्स से सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करने के लिए, न्यूरॉन्स के स्थान का गहराई से महत्वपूर्ण है - गहरी न्यूरॉन्स, पैच (ढीले पैच और पूरे सेल दोनों) के लिए कठिन. आम तौर पर, सफल पट्टी के लिए संभव गहराई सतह से 5-6 के बारे में सेल परतों है. मेडzebrafish हाइपोथैलेमस GnRH3 न्यूरॉन्स ऊपर सतह से 6 सेल परतों के लिए किया जा सकता है, जबकि उर्फ तमिलनाडु GnRH3 न्यूरॉन्स, मस्तिष्क के उदर सतह पर आम तौर पर कर रहे हैं. सकारात्मक दबाव कोशिकाओं आ जबकि clogging से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को रोकने के लिए बहुत उपयोगी है. प्रयोगात्मक दृष्टिकोण इस प्रकार आनुवंशिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल है कि किसी भी न्यूरॉन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वयस्क मस्तिष्क में GnRH न्यूरॉन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए, हम नियमित तौर पर उम्र के 4-6 महीने के Medaka मछली और zebrafish का उपयोग करें. छोटे दिमाग या अधिक calcified खोपड़ी के साथ बड़ी मछली के साथ छोटी मछली विच्छेदन अधिक चुनौतीपूर्ण बना देगा. तमिलनाडु: GnRH3 न्यूरॉन्स एक कठिन संयोजी म्यान में encased हैं: GnRH3 न्यूरॉन्स वयस्क Medaka मस्तिष्क से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए आसानी से उपलब्ध हैं, लेकिन इस वयस्क zebrafish के लिए ऐसा नहीं है जो तमिलनाडु में. दूसरी ओर, GnRH3 पीओए, वीटी में न्यूरॉन्स, और हाइपोथैलेमस और अधिक आसानी से सुलभ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए वयस्क zebrafish मस्तिष्क में Medaka से तुलना कर रहे हैं. सेक्स नहीं कर रहे हैंविच्छेदन और प्रजातियों या तो की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग की कठिनाइयों के आधार पर मतभेद.
इस विवो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में एक नहीं है, कम से कम नुकसान के साथ अपेक्षाकृत बरकरार neuronal सर्किट से रिकॉर्डिंग शारीरिक समारोह और ब्याज के neuronal प्रणाली के नियमन का पता लगाने के लिए एक आकर्षक तरीका है. बरकरार मस्तिष्क तैयारी घंटे के लिए रहता है, और एक अच्छा रिकॉर्डिंग में एक घंटे से अधिक 6 के लिए पिछले कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल पहले से ही बुनियादी ज्ञान और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक 13 के साथ अनुभव है, और साथ ही साथ काम करने के लिए आवश्यक विशेष उपकरण है, जो शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए डॉ. मेंग-चिन लिन और सुश्री युआन दांग धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य HD053767 के राष्ट्रीय संस्थान (एनएलडब्ल्यू उपपट्टा) से अनुदान द्वारा और कैलिफोर्निया लॉस एंजिल्स के अनुसंधान, विश्वविद्यालय (एनएलडब्ल्यू) के वाइस चांसलर के फिजियोलॉजी और कार्यालय के विभाग से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
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