Summary

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

בסרטון הזה, נדגים כיצד להקליט פעילות חשמלית מתא עצב בודד שזוהה בכל הכנת מוח, השומרת על מעגלים עצביים מורכבים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי בחלבון פלואורסצנטי לזיהוי בהכנת המוח השלמה.

Abstract

הבנת הפיסיולוגיה של התא של מעגלים עצביים המווסתים את ההתנהגויות מורכבות היא מאוד משופרת באמצעות מערכות מודל שבו ניתן לבצע את העבודה הזאת בהכנת מוח שלמה שבו המעגלים העצביים של מערכת העצבים המרכזית נשארים שלמים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי במוח שלם. יש דגי אוכלוסיות מרובות של נוירונים GnRH, והפונקציות שלהם הן ​​תלויות במיקומם במוח ובגן GnRH שהם מביעים 1. יש לנו התמקדנו בהפגנה שלנו GnRH3 נוירונים הממוקמים בעצבי המסוף (TN) בקשר לנורות חוש הריח באמצעות המוח שלם של דגי medaka מהונדס (איור 1B ו-C). מחקרים מראים שנוירונים TN-GnRH3 Medaka הם neuromodulatory, מתנהגים כמו משדר של מידע מהסביבה החיצונית למערכת העצבים המרכזית; לאהיי לא משחק תפקיד ישיר בויסות תפקודי יותרת המוח, האשכים, כפי שעושה נוירונים ההיפותלמוס GnRH1 הידועים 2, 3. דפוס טוניק של ירי פוטנציאל פעולה הספונטני של תאי עצב TN-GnRH3 הוא מאפיין מהותי 4-6, התדירות מתוכם הוא מווסת על ידי רמזים חזותיים מקונספציפים 2 ו kisspeptin 1 5 נוירופפטידים. בסרטון הזה, אנו משתמשים בקו יציב של מהונדס medaka בי נוירונים TN-GnRH3 להביע transgene המכיל את האזור המקדם של Gnrh3 קשור לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר 7 להראות לך איך לזהות ולעקוב אחר פעילות נוירונים החשמלית שלהם במוח כולו הכנת 6.

Protocol

1. נתיחה של מוח מהמבוגרים Medaka הרדימי מבוגר זכר או נקבה (איור 1 א) על ידי טבילה ב5 מיליליטר MS-222 (150 מ"ג / ל ', pH 7.4); לחכות כמה דקות אחרי תנועות זימים הפסיקו לפני עריפת הראש. כל ההליכים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החי…

Representative Results

דוגמה של אשכולות בין שתי המדינות של ה-GFP שכותרתו GnRH3-TN נוירונים מהמוח של דגים נכרת medaka מוצגת ב1B 1C ודמויות. כל אשכול מכיל כ 8-10 נוירונים GnRH. את הפעילות העצבית הספונטנית של יעד TN-GnRH3 נרשמה במצב נוכחי מהדק (אני = 0) עם שיעורי ירי טיפוסיים של 0.5-6 הרץ. הדפוס של ירי פוטנצי?…

Discussion

GnRH 3: דגים מהונדסים GFP לספק מודלים ייחודיים כדי לחקור את המנגנונים שבבסיס neurophysiological אינטגרציה ורגולציה בשליטה מרכזית של התנהגויות שהן גם ישירות ובעקיפין מעורבות ב3 רבייה, 8-10 עצביים. אחד היתרונות המשמעותיים של מערכת מודל זה הוא שהרבה GnRH3 נוירונים להביע GFP קר?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר מנג-צ'ין לין וגב 'דונג יואן לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות HD053767 (קבלנות משנה לNLW), ועל ידי קרנות מהמחלקה לפיסיולוגיה ומשרד המשנה לנגיד למחקר, אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (NLW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX50W (Upright)
Amplifier Axon Instruments Axoclamp 200B
A-D converter Computer Interference Corp. Digidata ITC-18
Cooled CCD camera PCO Computer Optics Sensicam
Xenon lamp Sutter Instruments Co.
GFP filter set Chroma Technologies
Imaging Software Intelligent Imaging Innovations Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software Axon Instruments Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software AD Instruments Inc. PowerLab
Headstage for electrophysiology Axon Instruments CV 203BU
Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-285
Recording Chamber Platform Warner Instrument Corp. P1
Recording Chamber Warner Instrument Corp. RC-26G
Electrode Puller Sutter instruments P87
Filament for electrode puller Sutter Instruments FB330B 3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 Microelectrode for recording
Syringe Becton Dickinson 309586 3 ml
MS-222 Sigma E10521-10G Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch) mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch) mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine

References

  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).

Play Video

Cite This Article
Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. J. Vis. Exp. (74), e50312, doi:10.3791/50312 (2013).

View Video