Summary
Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment enregistrer l'activité électrique de neurones isolés identifiés dans une préparation de tout le cerveau, ce qui préserve les circuits neuronaux complexes. Nous utilisons des poissons transgéniques dans lesquelles la gonadolibérine (GnRH neurones) sont génétiquement marquées avec une protéine fluorescente pour l'identification dans la préparation du cerveau intact.
Abstract
Comprendre la physiologie cellulaire des circuits neuronaux qui régissent les comportements complexes est grandement améliorée par l'utilisation de systèmes modèles dans lesquels ce travail peut être effectué dans une préparation de cerveau intact où les circuits neuronaux du système nerveux central reste intact. Nous utilisons des poissons transgéniques dans lesquelles la gonadolibérine (GnRH neurones) sont génétiquement marquées avec une protéine fluorescente verte pour l'identification dans le cerveau intact. Les poissons ont de multiples populations de neurones à GnRH, et leurs fonctions dépendent de leur emplacement dans le cerveau et le gène de la GnRH qu'ils expriment 1. Nous avons concentré notre démonstration sur GnRH3 neurones situés dans les nerfs terminaux (TN) associés aux bulbes olfactifs en utilisant le cerveau intact de poisson transgénique médakas (figure 1B et C). Des études suggèrent que medaka neurones TN-GnRH3 sont neuromodulateur, agissant comme un émetteur d'informations provenant de l'environnement extérieur au système nerveux central; they ne jouent pas un rôle direct dans la régulation des fonctions hypophyso-gonadique, tout comme le bien connu hypothalamique GNRH1 neurones 2, 3. Le modèle tonique de potentiel d'action spontanée des neurones TN-GnRH3 est une propriété intrinsèque 4-6, la fréquence est modulée par des signaux visuels de leurs congénères 2 et la kisspeptine neuropeptide 1 5. Dans cette vidéo, nous utilisons une ligne stable d'transgénique médakas dans lequel les neurones TN-GnRH3 expriment un transgène contenant la région promotrice du Gnrh3 lié à la protéine fluorescente verte 7 pour vous montrer comment identifier les neurones et surveiller leur activité électrique dans le cerveau entier préparation 6.
Protocol
1. Dissection de cerveaux de l'adulte Medaka
- Anesthésier adulte mâle ou femelle (figure 1A) par immersion dans 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4); attendre quelques minutes après les mouvements de branchies ont cessé avant le décapiter. Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel de l'utilisation de l'Université de Californie-Los Angeles.
- Décapiter le poisson dans une solution saline de poisson à l'extrémité caudale de l'opercule avec des ciseaux dans une boîte de Pétri diamètre 60 mm.
- la tête de poisson de transfert à une boîte de Petri de diamètre 35 mm, à moitié rempli d'une solution saline poissons et bordée de Sylgard qui présente un renfoncement en elle pour positionner et fixer la tête pour la dissection des cerveaux. Positionner et fixer la tête dorso-latérale avec des épingles insectes.
- Découpez soigneusement la partie dorsale du crâne autour de son périmètre avec des ciseaux fins et retirez-le délicatement avec une pince, exposant la partie dorsale du cerveau, y compris complètement la partie antérieure de la moelle épinière. <li> Soulever la moelle épinière délicatement avec une pince à pointe fine et couper les nerfs conjonctifs bilatéraux avec des ciseaux à pointe fine: les nerfs crâniens, les nerfs spinaux et des nerfs optiques sur la face ventrale du cerveau et les nerfs olfactifs à la partie antérieure de le cerveau.
- Placez le cerveau entièrement disséqué dans un plat frais Petri remplie de sérum physiologique des poissons, et vérifiez soigneusement sous le microscope afin d'assurer la totalité du cerveau est intact (y compris la glande pituitaire), sans coupures ou perforations. Cerveaux endommagés ne sont pas utilisés pour l'expérimentation.
2. Montage du cerveau dans une chambre d'enregistrement
- Placer une petite goutte de cyanoacrylate ou une autre colle à action rapide avec une aiguille dans le centre de la chambre d'enregistrement et étaler la colle d'environ 1 cm 2.
- Transférer rapidement le cerveau et le coller dans une position ventrale vers le haut.
- Ajouter 1 ml d'une solution saline de poisson afin qu'il remplisse la chambre d'enregistrement et couvre le cerveau. Perfuser en continule cerveau avec une solution saline de poisson aérée à un débit d'au moins 200 pl / min.
- Utilisation de la pointe fine Pince retirer soigneusement les méninges sur la surface de la zone d'enregistrement du cerveau.
3. Électrophysiologie
- Lâche enregistrement de patch de potentiel d'action tir
- microélectrodes de verre (6-10 MQ) sont construits à partir des pipettes en verre borosilicate (1B150F-4, World Precision Instruments) à l'aide d'un extracteur d'électrode (par exemple Sutter P-87), et le dos remplis avec la solution d'enregistrement libre-patch mi-chemin de l' électrode.
- En utilisant un microscope à fluorescence verticale avec un dispositif à couplage de charge refroidi (CCD), trouver la GFP exprimant TN-GnRH3 neurones à travers 10x (figure 1B), puis des objectifs à immersion d'eau 40x (figure 1C). Ils sont situés à la surface ventrale des bulbes olfactifs, juste en avant du télencéphale ou à proximité.
- Basculer vers un moniteur vidéo qui fournitimages en temps réel de la microscope pour localiser le neurone groupe TN-GnRH3 (figure 1C).
- Positionner le micro-électrodes dans le bain de sorte que la pointe de l'électrode est au-dessus du neurone cible. Appliquer une légère pression constante positive à la micro-électrode de sorte qu'elle ne soit pas obstruée, et une approche en douceur le neurone cible avec la pointe de l'électrode.
- Contrôler et surveiller la résistance de l'électrode en mode voltage-clamp en utilisant un logiciel de AxoGraph et amplificateur Axoclamp 200B avec le logiciel Axograph (Axon Instruments). Lorsque vous pouvez le voir sur le moniteur vidéo que la pointe de l'électrode est à la surface du neurone et de l'affichage de AxoGraph que la résistance change légèrement, relâchez la pression positive et appliquer une légère pression négative si nécessaire pour faire un joint à faible résistance sur le neurone (<100 MQ).
- Passez en mode courant-clamp, et enregistrer la tension de la membrane en continu sans aucun courant d'entrée, le réglage de l'échellede la tension et la vitesse de l'enregistrement si nécessaire. Les données sont recueillies et analysées par le logiciel Powerlab (ADInstruments Inc.).
- Fiche de référence activité électrique dans une solution saline de poisson normale pendant environ 5 min avant tout traitement (figure 2A). perfusion de bain de médicaments, hormones, peptides, etc. ajoutée à la solution saline de poissons se poursuit au rythme de 200 pi / min, suivie d'une période de sevrage chez les poissons solution saline normale 5, 6, 11.
- Enregistrement de cellules entières du potentiel de membrane
L'ensemble du patch clamp procédure d'électrophysiologie de la cellule est le même que celui de la procédure d'enregistrement mobiles extracellulaire correction décrite ci-dessus, à partir des étapes 3.1.1 - 3.1.4. Ensuite, les procédures diffèrent en conséquence:- Contrôler et surveiller la résistance de l'électrode en mode voltage-clamp. Lorsque vous pouvez le voir sur le moniteur vidéo que la pointe de l'électrode est à la surface du neurone et de l'oscilloscope que les changements de résistance légèrement, relâchez le positifpression et appliquer un peu de pression négative pour faire un joint haute résistance sur le neurone (~ 3 Giga Ω). Appliquer aspiration douce par la bouche à une rupture de la membrane patché, vous verrez une chute soudaine de la résistance à environ 120-250 MQ.
- Passez en mode courant-clamp, et enregistrer la tension de la membrane en continu sans aucun courant d'entrée, en ajustant l'échelle de la tension et la fréquence de l'enregistrement si nécessaire.
- Fiche de référence activité électrique dans une solution saline de poisson normale pendant environ 5 min avant tout traitement, tel que décrit ci-dessus en 3.1.7 (figure 2B).
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Representative Results
Un exemple de groupes bilatéraux de GFP marqués TN-GnRH3 neurones du cerveau excisé du poisson medaka sont présentés dans les figures 1B et 1C. Chaque cluster contient environ 8-10 neurones à GnRH. Les activités neuronales spontanées de la cible TN-GnRH3 ont été enregistrées en mode courant-clamp (I = 0) avec des taux de cuisson typiques de 0,5-6 Hz. Le modèle de potentiel d'action tir est typiquement un modèle de tonic ou battant, avec un intervalle entre pics assez régulière. traces d'exemples sont présentés dans la figure 2 (2A: loose-patch; 2B: cellules entières).
Cette approche expérimentale est également réussie dans l'enregistrement de la GFP marqués neurones à GnRH situés dans le cerveau antérieur des adultes poisson zèbre (figures 3A et 3B). Neuron activité électrique dans le excisée, le cerveau intact a été enregistré dans la manière similaire à celle décrite ci-dessus dans médakas par loose-patch (figure 3C) et l'enregistrement de cellule entière ( 
Figure 1. modèle animal utilisé pour l'étude TN-GnRH3 neurone dans cette vidéo A: Adult médakas GnRH3: GFP transgénique poisson, à gauche: hommes; droite:.. femelle B: Image confocale de la face ventrale du cerveau antérieur. OB: bulbe olfactif; TN: nerf terminal GnRH3 neurones; TELE: télencéphale; ON:. Nerf optique C: Fort grossissement des TN-GnRH3 neurones figurent à la case blanche de panneau B. (barre d'échelle: A: 5 mm, B: 100 um; C: 20 pm). 
Figure 2. Spodes potentiels d'action ntaneous enregistrées à partir TN-GnRH3 neurones en mode courant-clamp (I = 0) A: trace de l'échantillon à partir de mobiles correction enregistrement; B: Exemple de trace. enregistrement de cellule entière. 
Figure 3. Enregistrement des GnRH3: EMD (protéine fluorescente verte vert) l'activité des neurones de la préparation du cerveau intact de l'adulte poisson zèbre transgénique 9 en utilisant la même approche expérimentale que celle décrite pour la préparation du cerveau médakas A:. GnRH3: les neurones EMD situés dans télencéphale ventral (VT) et préoptique . zone (POA) dans le cerveau antérieur du poisson zèbre adulte B: GnRH3: EMD neurones situés dans l'hypothalamus (HYPO). barres d'échelle: 100 um C:. Exemple traces de l'enregistrement lâche-patch de GnRH3: EMD neurones dansVT D:. Exemple de trace de l'enregistrement de patch de cellule entière de VT.
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Discussion
GnRH 3: GFP transgéniques poissons fournissent des modèles uniques pour étudier les mécanismes neurophysiologiques qui sous-tendent l'intégration neuronale et de la réglementation dans le contrôle central de comportements qui sont à la fois directement et indirectement impliqués dans la reproduction 3, 8-10. L'un des avantages importants de ce système modèle, c'est que beaucoup GnRH3 neurones exprimant la GFP sont proches de la surface ventrale du cerveau, permettant un accès relativement facile aux neurones pour l'enregistrement électrophysiologique sans perturber les circuits neuronaux 6, 9, 11, 12 (figures 1B et 1C; figures 3A et 3B). Dans cette vidéo, nous avons montré deux enregistrements loose-patch et de cellules entières de TN-GnRH3 neurones dans le cerveau adulte intact de poisson medaka. TN-GnRH3 neurones présentent un tonique ou un motif battant de potentiel d'action spontanée de tir avec une fréquence de 0,5 6Hz.There avait pas de différences entre les sexes détectables dans la décharge spontanéetaux de 5, mais il y avait des changements dans le développement spectaculaire des activités électriques des neurones GnRH3 cours de l'embryogenèse 9. Loose-patch et l'électrophysiologie à cellules entières ont des avantages et des inconvénients méthodologiques. Loose-patch est techniquement plus facile que l'enregistrement de cellule entière, mais seulement montre le motif de tir des neurones et de la fréquence. D'autre part, l'enregistrement de cellule entière peut fournir des informations beaucoup plus: un potentiel de repos de la membrane, le motif de tir et de la fréquence, de l'action analyse du potentiel, la capacité de la membrane et de la résistance. Parce enregistrement lâche-patch ne rompt pas la membrane cellulaire et de perturber la ion intracellulaire et deuxième concentrations de messagerie, il est idéal pour l'enregistrement à long terme de l'activité neuronale. Ensemble des enregistrements rupture des cellules de la membrane cellulaire et éventuellement conduire à la dialyse de molécules intracellulaires, ce qui pourrait altérer les propriétés des neurones avec des enregistrements plus longs. En raison des avantages et des inconvénients des deux electrophysiméthodes méthodologiques, il peut être important d'étudier les propriétés des neurones à l'aide de deux techniques. Parce que le pH et l'osmolarité sont très importants pour la survie des neurones et la fonction, toutes les solutions en cours d'utilisation doivent être ajustés correctement.
Pour confirmer l'identité du neurone nominal, la pression négative est appliquée après achèvement de l'enregistrement, puis la fluorescence à la pointe de l'électrode est confirmé en utilisant l'imagerie de fluorescence microscopique. Petit colorants ou des sondes (comme Alexa Fluor 568 ou colorant biocytine) moléculaires peuvent être inclus dans la solution intracellulaire pour l'enregistrement de cellules entières pour marquer le neurone enregistrée pour une analyse morphologique.
Pour enregistrer avec succès des neurones cibles dans le cerveau intact, la profondeur de l'emplacement des neurones est crucial - le plus profond des neurones, plus de patch (à la fois lâche-patch et la cellule entière). En général, la profondeur possible de patcher succès est d'environ 5-6 couches de cellules de la surface. Medaka TN-GnRH3 neurones sont généralement à la surface ventrale du cerveau, tandis poisson zèbre hypothalamiques neurones GnRH3 peuvent être jusqu'à 6 couches de cellules de la surface. La pression positive est très utile pour prévenir l'électrode d'enregistrement de colmatage tout en se rapprochant des cellules. Ce type d'approche expérimentale peut être utilisée pour n'importe quel neurone qui est génétiquement marqué avec la protéine fluorescente. Pour étudier l'activité des neurones GnRH dans le cerveau adulte, nous utilisons systématiquement médakas poisson et le poisson zèbre de 4-6 mois d'âge. Le jeune poisson avec des cerveaux plus petits ou des poissons plus âgés avec des crânes plus calcifiées, fera la dissection plus difficile. Le TN: GnRH3 neurones sont facilement accessibles pour l'électrophysiologie du cerveau adulte médakas, mais ce n'est pas le cas pour le poisson zèbre adulte dans lequel TN: GnRH3 neurones sont enfermés dans une gaine conjonctif dur. D'autre part, GnRH3 neurones dans POA, VT, et l'hypothalamus sont plus facilement accessibles pour l'électrophysiologie dans le cerveau du poisson zèbre adulte que de médakas. Il n'y a pas de sexedifférences fondées sur les difficultés de dissection et l'enregistrement électrophysiologique de ces deux espèces.
Même si ce n'est pas une approche expérimentale in vivo, l'enregistrement des circuits neuronaux relativement intactes avec un minimum de dommages est un moyen attrayant d'explorer la fonction physiologique et la régulation du système neuronal d'intérêt. La préparation du cerveau intact dure pendant des heures, et une bonne qualité d'enregistrement peut durer plus d'une heure 6. Ce protocole est adapté pour les chercheurs qui ont déjà des connaissances de base et une expérience des techniques d'électrophysiologie 13, et ainsi que l'équipement spécialisé nécessaire pour faire le travail.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Meng-Chin Lin et Mme Yuan Dong pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health HD053767 (sous-traitance à ANL), et par des fonds provenant du département de physiologie et le Bureau du vice-chancelier de la recherche, de l'Université de Californie-Los Angeles (ANL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
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