Summary
이 비디오에서는, 우리는 복잡한 신경 회로를 유지하는 뇌 전체 준비에서 확인 된 하나의 뉴런에서 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성선 자극 호르몬 분비 호르몬 (GnRH의) 신경 세포가 유전자 손상 뇌의 준비 식별을위한 형광 단백질로 태그 된 유전자 변형 물고기를 사용합니다.
Abstract
복잡한 행동을 조절하는 신경 회로의 세포 생리학을 이해하는 것은이 작품은 CNS의 신경 회로가 그대로 남아 그대로 뇌의 준비에서 수행 할 수있는 모델 시스템을 사용하여 크게 향상됩니다. 우리는 성선 자극 호르몬 분비 호르몬 (GnRH의) 신경 세포가 유전자 손상 뇌의 식별을 위해 녹색 형광 단백질로 태그 된 유전자 변형 물고기를 사용합니다. 물고기 GnRH의 뉴런의 여러 인구를 가지고 있고, 그 기능은 뇌의 위치와 그들이 1을 표현하는 GnRH의 유전자에 따라 달라집니다. 우리는 유전자 변형 송사리의 손상 뇌 (그림 1B 및 C)를 사용하여 후각 전구에 연결된 터미널 신경 (TN)에 위치한 GnRH3 신경에 우리의 시범 초점을 맞추고있다. 연구는 송사리 TN-GnRH3 뉴런은 중추 신경계에 외부 환경으로부터 정보를 송신기 역할을 neuromodulatory 것을 제안, 티셔츠헤이로 잘 알려진 시상 하부 GnRH1 신경 세포 2, 3을 수행합니다. TN-GnRH3 뉴런의 자발적인 활동 전위 사격 토닉 패턴이 고유의 속성을 4-6, 주파수, 뇌하수체 - 생식선 기능 조절에 직접적인 역할을하지 않는다 어느 것이 conspecifics 2 신경 펩타이드 kisspeptin 5에서 시각적으로 변조된다. 이 비디오에서는, 우리는 TN-GnRH3 뉴런이 어떻게 뉴런을 식별하고 뇌 전체에 자신의 전기 활동을 모니터링하는 방법을 보여 강화 된 녹색 형광 단백질 7에 연결 Gnrh3의 프로모터 부위를 포함하는 유전자를 표현하는 형질 전환 송사리의 안정적인 회선을 사용 준비 6.
Protocol
1. 성인 송사리의 두뇌의 해부
- 에 침지하여 (그림 1A) 남성 또는 여성 성인 마취 5 ML MS-222 (150 ㎎ / L, 산도 7.4), 아가미의 움직임이 해고되기 전에 중지 한 후 몇 분을 기다립니다. 모든 절차는 캘리포니아 대학교 로스 앤젤레스 캠퍼스의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
- 60 mm 직경 페트리 접시에 가위로 아가미의 꼬리 끝에 물고기 식염수에있는 물고기의 목을 베십시오.
- 35 mm 직경 페트리 접시에 전송 생선 머리는 반 염수 물고기로 가득 뇌 해부에 대한 머리의 위치 및 보안에있는 우울증이 실 가드와 함께 늘어서있다. 위치 및 곤충 핀으로 머리 등쪽면이 위로를 고정합니다.
- 신중하게 잘 가위로 그 주위에 두개골의 지느러미 부분을 잘라 조심스럽게 완전히 척수의 앞쪽 부분을 포함한 뇌의 등쪽 부분을 노출, 집게로 제거합니다. <리> 미세 팁 집게로 조심스럽게 척수를 들어 올리고 뾰족한 가위로 상호 결합 신경을 절단 : 두뇌의 복부 측면에 뇌신경, 척수 신경, 그리고 시신경, 그리고 앞쪽 부분에있는 후각 신경 뇌.
- 물고기 식염수로 가득 신선한 페트리 접시에 완전 해부 두뇌를 배치, 전체 뇌가 어떤 상처 나 구멍없는 (뇌하수체 포함) 그대로 확인하기 위해 현미경으로주의 깊게 확인합니다. 손상된 두뇌가 실험에 사용되지 않습니다.
2. 녹음 회의소 뇌 장착
- 시아 노 아크릴 레이트의 작은 방울 또는 녹음 챔버의 중앙에 바늘로 다른 속효성 접착제를 놓고 1cm 약 2 접착제를 확산.
- 빠르게 복부면이 위치에 뇌와 접착제 아래로 전송할 수 있습니다.
- 이 기록 챔버를 채우고 머리를 덮을 수 있도록 물고기 식염수 1 ML을 추가합니다. 지속적으로 붓는다최소 200 μL / 분의 속도로 통기 물고기 식염수 뇌.
- 좋은 팁을 사용하여 조심스럽게 뇌의 녹화 영역의 표면에 수막을 제거 포셉.
3. 전기 생리학
- 활동 전위 사격 느슨한 패치 기록
- 유리 미세 전극 (MΩ 6-10)은 전극 풀러 (예를 들어 셔터 P-87)를 사용하여 붕규산 유리 피펫 (1B150F-4, 세계 정밀 계측기)에서 생성, 다시 절반 방법까지 느슨한 - 패치 녹음 용액으로 채워져 전극.
- 냉각 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 똑바로 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현 배를 통해 TN-GnRH3 뉴런 (그림 1B), 다음 40X 물 침지 목표 (그림 1C)를 찾을 수 있습니다. 그들은 telencephalon 바로 앞쪽에 후각 전구의 복부 표면 또는 근처에 위치하고 있습니다.
- 제공하는 비디오 모니터로 전환현미경 실시간 영상 TN-GnRH3 신경 세포 클러스터 (그림 1C)를 찾습니다.
- 전극의 끝이 신경 세포 표적 위에 있도록 욕조에 미세 전극을 배치합니다. 가가 막혀, 부드럽게 전극의 끝 표적 신경 세포에 접근하지 않도록 미세 상수 약간의 양압을 적용합니다.
- AxoGraph 소프트웨어 및 Axograph 소프트웨어 (액슨 악기)와 앰프 Axoclamp 200B를 사용하여 전압 클램프 모드에서 전극의 저항을 점검하고 모니터링 할 수 있습니다. 당신은 전극의 끝이 신경 세포의 표면과 저항이 약간 변경하는 AxoGraph 디스플레이에서인지 비디오 모니터에서 볼 수있는 경우에 낮은 저항 씰을 만들기 위해 긍정적 인 압력을 해제하고 필요한 경우 약간의 부정적인 압력을 적용 신경 세포 (<100 MΩ).
- 전류 클램프 모드로 전환하고 규모를 조정하는 현재의 입력없이 지속적으로 막 전압을 기록전압 및 녹음 필요한 경우의 비율. 데이터가 PowerLab의 소프트웨어 (ADInstruments 주식 회사)에 의해 수집되고 분석됩니다.
- 어떤 처리 (그림 2A) 전에 약 5 분 동안 정상 물고기 식염수에 기록 기준선 전기 활동. 약물, 호르몬, 펩타이드 등의 목욕 관류. 물고기 식염수에 추가하는 것은 보통 물고기 식염수 5, 6, 11 유실 뒤에 마침표 200 μL / 분의 속도로 계속됩니다.
- 막 잠재력의 전체 세포 녹음
3.1.4 - 전체 세포 패치 클램프 전기 생리학 절차는 단계 3.1.1에서 설명한 세포 느슨한 - 패치 녹음 절차와 동일합니다. 다음 절차에 따라 편차 :- 전압 클램프 모드에서 전극의 저항을 점검하고 모니터링 할 수 있습니다. 당신은 저항 변화가 약간 긍정적 풀어 전극의 끝이 신경 세포의 표면에와 오실로스코프에서인지 비디오 모니터에서 볼 수있는 경우압력과 신경 (2 ~ 3 기가 Ω)에 높은 저항 인감을 만들기 위해 약간의 부정적인 압력을 적용합니다. 파열 패치 막 입으로 부드러운 흡입을 적용, 당신은 MΩ 약 120-250에 대한 저항의 급격한 저하를 볼 수 있습니다.
- 전류 클램프 모드로 전환, 녹화 필요한 경우의 전압과 속도의 규모를 조정하는 현재의 입력없이 지속적으로 막 전압을 기록한다.
- 어떤 치료를하기 전에 약 5 분 동안 정상 물고기 식염수에 기록 기준선 전기 활동이 아니라 3.1.7 (그림 2B)에서 설명한.
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Representative Results
송사리의 절제 뇌에서 GFP - 라벨 TN-GnRH3 신경의 양측 클러스터의 예는 그림의 1B 및 1C에 표시됩니다. 각 클러스터는 8-10 GnRH의 뉴런을 포함하고 있습니다. 대상 TN-GnRH3의 자발적인 신경 활동은 0.5-6 Hz의 전형적인 발사 속도와 전류 클램프 모드 (I = 0)에 기록 하였다. 활동 전위 사격 패턴은 매우 일반적인 interspike 간격으로, 일반적 토닉이나 구타 패턴이다. 샘플 트레이스는 그림 2 (:; 전체 세포 2B 느슨한 패치 2A)에 표시됩니다.
이 실험 방법은 성인 zebrafish의 (그림 3A 및 3B)의 전뇌에있는 GFP - 라벨 GnRH의 신경 세포에서 녹음도 성공합니다. 느슨한 패치 (그림 3C) 및 전체 세포 녹음 (가 송사리에서 설명한대로 절제 그대로 뇌에있는 신경 세포의 전기적 활동은 유사한 방식으로 기록 된 
그림 1. 이 비디오 TN-GnRH3 신경 세포의 연구에 사용되는 동물 모델 : 성인 송사리 GnRH3 : GFP 유전자 변형 물고기, 왼쪽 : 남자, 오른쪽 :.. 여성 B : 전뇌의 복부 뷰의 공 초점 이미지. OB : 후각 망울, TN : 터미널 신경 GnRH3 신경, TELE : telencephalon; ON :. 시신경 C : 패널 B의 백색 상자 (스케일 표시 줄에 표시 TN-GnRH3 뉴런의 높은 배율 : 5 mm의 B : 100 μm의, C : 20 μm의). 
그림 2. SPO전류 클램프 모드 (I = 0)의 TN-GnRH3 뉴런에서 기록 ntaneous 활동 전위 : 느슨한 - 패치 녹음의 샘플 추적, B :. 전체 셀 녹음의 샘플 추적. 
그림 3. GnRH3의 기록 : EMD (에메랄드 녹색 형광 단백질) 송사리 뇌 준비에 설명한 것과 같은 실험 방법을 사용하여 성인 형질 전환 제브라 피쉬 9 그대로 뇌의 준비에서 신경 세포의 활동 :. GnRH3 : 복부 telencephalon (VT)과 preoptic에 위치한 EMD 신경 . 성인 제브라 피쉬의 전뇌에있는 지역 (POA) B : GnRH3 : 시상 하부 (HYPO)에 위치한 EMD 신경. 스케일 바 : 100 μm의 C :. GnRH3의 느슨한 패치 녹화 샘플 추적 : EMD 신경 세포의VT D :. VT에서 전체 세포 패치 기록 샘플 추적.
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Discussion
GnRH의 3 GFP 유전자 변형 물고기는 신경 세포의 통합과 직간접 적으로 재생 3, 8-10에 관여 둘 다 행동의 중앙 제어 규제의 근간이되는 신경 생리 학적 메커니즘을 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이 모델 시스템의 중요한 장점 중 하나는 GFP를 표현하는 많은 GnRH3 뉴런은 신경 회로 6, 9, 11, 12 (그림 방해하지 않고 전기 생리학 기록을 위해 신경을 비교적 쉽게 액세스 할 수 있도록 두뇌의 복부 표면에 가까운 즉 1B 및 1C, 도표 3A 및 3B). 이 비디오에서는, 우리는 송사리의 손상 성인 뇌의 TN-GnRH3 신경 세포 모두에서 느슨한 패치 및 전체 세포 녹음을 보여 주었다. 자연 발화에는 검출 성별 차이는 TN-GnRH3 신경 강장제 0.5-6Hz.There의 주파수로 발사 자발적 활동 전위의 박동 패턴을 전시 않았다비율 5 만 GnRH3 신경 세포의 전기적 활동에 극적인 발달 변화는 배아 9시이 있었다. 느슨한 패치 및 전체 세포 전기 생리학은 서로 다른 방법론의 장점과 단점이 있습니다. 느슨한 패치는 전체 세포 녹음보다 기술적으로 쉽다, 그러나 신경 세포의 발화 패턴과 주파수를 보여줍니다. 휴식 막 잠재력, 발사 패턴 및 빈도, 활동 전위 분석, 막 커패시턴스와 저항 : 반면에, 전체 셀 녹음 더 많은 정보를 제공 할 수 있습니다. 느슨한 - 패치 녹음이 세포막을 분해하고 세포 내 이온과 두 번째 메신저 농도를 방해하지 않기 때문에, 신경 활동의 장기 녹음에 이상적입니다. 전체 세포 녹음 파열은 세포막 결국 그로 인하여 잠재적으로 더 오랜 기록과 함께 신경 세포 특성을 변화, 세포 내 분자의 투석로 이어집니다. 때문에 electrophysi 모두의 장점과 단점ological 방법은 그것을 두 가지 기술을 사용하여 신경 세포의 특성을 연구하는 것이 중요 할 수 있습니다. pH와 삼투압 모두 신경 세포의 생존과 기능에 매우 중요하기 때문에, 사용의 모든 솔루션을 적절히 조정해야합니다.
기록 된 신경 세포의 신원을 확인하기 위해 음의 압력은 녹화 완료 후 적용되며, 전극의 끝 부분에 다음 형광 현미경 형광 이미징을 사용하여 확인됩니다. 작은 분자 염료 또는 프로브 (예 : 알렉사 플 루어 568 염료 또는 biocytin 등) 자세한 형태 분석을 위해 기록 된 신경 세포를 표시하는 전체 세포 녹음 세포 내 솔루션에 포함 할 수 있습니다.
그대로 뇌의 대상 뉴런에서 성공적으로 기록하려면, 신경의 위치의 깊이는 매우 중요합니다 - 깊이 신경 패치 (느슨한 패치 및 전체 세포 모두)에 더. 일반적으로, 성공적인 패치에 대한 가능한 깊이는 표면에서 약 5-6 세포층이다. 메드제브라 피쉬의 시상 하부 GnRH3 뉴런가 표면에서 6 셀 레이어가 될 수 있지만 일명 TN-GnRH3 뉴런은 뇌의 복부 표면에서 일반적입니다. 긍정적 인 압력이 세포를 접근하는 동안 막힘 기록 전극을 방지하기 위해 매우 도움이됩니다. 실험적인 접근이 유형의 유전자 형광 단백질로 표시되어있는 신경 세포를 사용할 수 있습니다. 성인 두뇌에있는 GnRH의 신경 활동을 연구하기 위해, 우리는 정기적으로 연령 4 ~ 6 개월 송사리와 제브라 피쉬를 사용합니다. 작은 두뇌 이상 석회화 두개골 오래된 물고기와 어린 물고기 해부 더 도전 할 것입니다. TN : GnRH3 신경 힘든 결합 칼집에 넣어 진입니다 GnRH3 신경 성인 송사리 뇌에서 전기 생리학에 대한 쉽게 접근 할 수 있지만,이 성인 제브라 피쉬의 경우하지 않은 TN합니다. 반면에, GnRH3 POA, 버몬트에있는 뉴런, 그리고 시상 하부는 더 쉽게 접근 전기 생리학에 대한 성인 zebrafish의 두뇌에있는 송사리에서보다. 어떤 섹스가 없습니다해부 종 중 하나의 전기 생리학 기록의 어려움에 따라 차이가.
이 생체 실험 접근 방법은 아니지만, 최소한의 손상 상대적으로 그대로 연결 회로에서 녹음을하면 생리 기능과 관심의 신경 시스템의 규정을 탐구하는 매력적인 방법입니다. 그대로 뇌의 준비 시간 동안 지속, 그리고 좋은 녹음 시간 6 이상 지속될 수있다. 이 프로토콜은 이미 기초 지식과 전기 생리학 기술 13와 경험, 그리고뿐만 아니라 작업을 수행하는 데 필요한 전문 장비를 가지고 연구에 적합합니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을위한 박사 멩 턱 린 양 위안 동 감사합니다. 이 작품은 건강 HD053767의 국립 연구소 (NLW에 하청)에서 교부금에 의해 캘리포니아 로스 앤젤레스의 연구 대학 (NLW)를위한 부총장의 생리학 및 Office의 부서에서 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
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