Summary
I denne videoen vil vi demonstrere hvordan du tar opp elektrisk aktivitet fra identifiserte enkelt nevroner i en hel hjerne forberedelse, som bevarer komplekse nevrale kretser. Vi bruker transgen fisk hvori gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH)-nevronene er genetisk merket med en fluorescerende protein for identifikasjon i den intakte hjerne preparatet.
Abstract
Forstå cellefysiologi av nevrale kretser som regulerer komplekse atferd er sterkt forbedret ved hjelp av modellsystemer der dette arbeidet kan utføres i en intakt hjerne forberedelse der nevrale kretser i CNS forblir intakt. Vi bruker transgen fisk som gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) nevroner er genetisk merket med grønt fluorescerende protein for identifikasjon i den intakte hjerne. Fisk har flere populasjoner av GnRH-neuroner, og deres funksjon er avhengig av deres plassering i hjernen og den GnRH-genet som de uttrykker en. Vi har fokusert vår demonstrasjon på GnRH3 nevroner lokalisert i terminalen nerver (TN) forbundet med olfactory pærer bruker intakt hjernen av transgene medaka fisk (Figur 1B og C). Studier tyder på at medaka TN-GnRH3 nevroner er neuromodulatory, fungerer som en formidler av informasjon fra det ytre miljøet til det sentrale nervesystemet, tHei ikke spille en direkte rolle i å regulere hypofyse-/gonadesystemet funksjoner, som gjør den velkjente hypothalamus GnRH1 to nerveceller, tre. Den tonic mønster av spontan handling potensial avfyring av TN-GnRH3 nevroner er en iboende egenskap 4-6, frekvensen som er modulert av visuelle signaler fra conspecifics 2 og neuropeptide kisspeptin en fem. I denne videoen bruker vi en stabil linje av transgene medaka der TN-GnRH3 nevroner uttrykker et transgen inneholder promoter regionen Gnrh3 knyttet til forbedret grønt fluorescerende protein syv vise deg hvordan du kan identifisere nevroner og overvåke deres elektrisk aktivitet i hele hjernen forberedelse seks.
Protocol
En. Disseksjon av Hjerner fra Adult medaka
- Anesthetize voksen mann eller kvinne (figur 1A) ved å dyppe i 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), vent et par minutter etter at gjeller bevegelser har opphørt før decapitating. Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of University of California-Los Angeles.
- Decapitate fisken i fisk fysiologisk saltvann ved den caudale enden av operculum med saks i et 60 mm diameter petriskål.
- Transfer fisk hodet til en 35-mm diameter petriskål, halvveis fylt med fisk saltvann og foret med Sylgard som har en depresjon i det å plassere og sikre hodet for hjernen disseksjon. Plasser og fest hodet dorsal side opp med insekt pins.
- Skjær forsiktig dorsal del av skallen rundt omkretsen sin med fine saks og forsiktig fjerne den med pinsett, utsette dorsal del av hjernen totalt inkludert den fremre delen av ryggmargen. <li> Løft ryggmargen forsiktig med fin-tip pinsett og bryte den bilaterale connective nervene med tynn saks: kraniale nerver, spinal nerver og optiske nerver på baksiden side av hjernen, og de luktnervene på fremre del av hjernen.
- Plasser fullt dissekert hjernen i en frisk petriskål fylt med fisk saltvann, og sjekke nøye under mikroskop for å sikre at hele hjernen er intakt (inkludert hypofysen) uten noen kutt og punkteringer. Skadede hjerner er ikke brukt til eksperimentering.
2. Montering av Brain i et opptak Chamber
- Plasser en liten dråpe av cyanoakrylat eller et annet hurtig-virkende lim med en nål inn i sentrum av opptaket kammeret og spres limet omtrent 1 cm 2.
- Raskt overføre hjernen og lim den ned i en ventral side opp stillingen.
- Tilsett 1 ml av fisk saltvann, slik at det fyller opptak kammeret og dekker hjernen. Kontinuerlig perfusehjernen med oksygenert fisk saltvann med en hastighet på minst 200 mL / min.
- Ved hjelp av den fine spiss tang forsiktig fjerne hjernehinnene over overflaten av opptaket område av hjernen.
3. Elektrofysiologi
- Loose patch innspilling av handling potensial avfyring
- Mikroelektroder av glass (6-10 MΩ) er konstruert av borsilikatglass pipetter (1B150F-4, verdens Precision Instruments) ved hjelp av en elektrode avtrekker (f.eks Sutter P-87), og tilbake fylt med løs-patch opptak løsning halvveis opp elektrode.
- Ved hjelp av en oppreist fluorescerende mikroskop med en avkjølt kostnad-brikken (CCD) kamera, finner GFP-uttrykke TN-GnRH3 nevroner gjennom 10x (figur 1B), deretter 40x vann nedsenking mål (figur 1C). De er lokalisert ved eller nær den ventrale overflaten av olfactory pærer, bare anteriort for telencephalon.
- Bytt til en video monitor som levererreal-time bilder fra mikroskop for å lokalisere TN-GnRH3 nervecellen cluster (figur 1C).
- Plasser mikroelektroden inn mot badekaret, slik at spissen av elektroden er over neuron målet. Påfør konstant lett positivt trykk til mikroelektroden slik at den ikke blir tilstoppet, og forsiktig komme nær målet neuron med spissen av elektroden.
- Kontroller og overvåke elektrode motstand i spenning-klemme modus ved hjelp AxoGraph programvare og forsterker Axoclamp 200B med Axograph programvare (Axon Instruments). Når du ser av videomonitoren at spissen av elektroden er på overflaten av nervecellen og fra AxoGraph displayet at motstanden endrer litt, slipper overtrykket og anvende svakt negativt trykk hvis det er nødvendig å foreta en forsegling på lav motstand nervecellen (<100 MΩ).
- Bytt til strøm-klemme-modus, og ta opp membranen spenning kontinuerlig uten strøm inngang, justere skalaenav spenning og hastighet på opptaket hvis nødvendig. Data blir samlet inn og analysert av Powerlab programvare (ADInstruments Inc.).
- Record baseline elektrisk aktivitet i normal fisk saltvann i ca 5 min før noen behandling (Figur 2A). Bath perfusjon av legemidler, hormoner, peptider, osv.. tilsatt til fisk saltvann fortsetter med en hastighet på 200 pl / min, fulgt av en utvaskingsperiode på normal saltløsning fisk 5, 6, 11.
- Hele celle opptak av membranpotensiale
Hele cellen patch clamp elektrofysiologiske fremgangsmåten er den samme som for den ekstracellulære løs-lapp opptak fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor, fra trinn 3.1.1 - 3.1.4. Da prosedyrene avviker tilsvarende:- Kontroller og overvåke elektrode motstand i spenning-klemme-modus. Når du ser av videomonitoren at spissen av elektroden er på overflaten av nervecellen og fra oscilloskop at motstanden endres litt, slipper den positivetrykk og bruke litt negativt press for å lage en høy motstand segl på nervecellen (~ 3 Giga Ω). Påfør lett sug gjennom munnen til å sprekke den lappet membran, vil du se et plutselig fall av motstand mot ca 120-250 MΩ.
- Bytt til strøm-klemme-modus, og ta opp membranen spenning kontinuerlig uten strøm inngang, justere omfanget av spenning og hastighet på opptaket hvis nødvendig.
- Record baseline elektrisk aktivitet i normale fisk saltløsning i ca 5 minutter før noen behandling som beskrevet ovenfor i 3.1.7 (figur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på bilaterale klynger av GFP-merket tn-GnRH3 nerveceller fra utskåret hjerne killifisk av fisk er vist på figurene 1B og 1C. Hver klynge inneholder ca 8-10 GnRH nerveceller. De spontane nevrale målselskapets TN-GnRH3 ble registrert i current-klemme-modus (I = 0) med typiske avfyring priser på 0,5-6 Hz. Mønsteret av handlingen potensial avfyring er vanligvis en tonic eller banke mønster, med en ganske vanlig interspike intervall. Eksempel på spor er vist i figur 2 (2A: løs-patch; 2B: hel-celle).
Dette eksperimentell tilnærming er også vellykket i opptak fra GFP-merket GnRH nevroner ligger i forhjernen av voksen sebrafisk (3A og 3B). Neuron elektrisk aktivitet i utskåret, intakte hjerne ble registrert på lignende måte som beskrevet ovenfor i killifisk av løs-lapp (figur 3C) og hel-celle-opptak ( 
Figur 1. Dyremodell brukes til TN-GnRH3 nervecellen studie i denne videoen A: Voksen medaka GnRH3: GFP transgen fisk, venstre: mann; høyre:.. Kvinnelig B: Confocal bilde av ventral utsikt over forebrain. OB: luktelappen; TN: Terminal nerve GnRH3 nevroner; TELE: telencephalon; PÅ:. Synsnerven C: Høy forstørrelse av TN-GnRH3 nevroner som vises i hvit boks med panel B. (Skalalinje: A: 5 mm, B: 100 mikrometer, C: 20 mikrometer). 
Figur 2. Spontaneous aksjonspotensialer tatt opp fra TN-GnRH3 nevroner i current-klemme-modus (I = 0) A: Eksempel spor fra løs-patch innspillingen; B:. Sample spor fra hel-celle opptak. 
Figur 3. Opptak av GnRH3: EMD (Emerald grønt fluorescerende protein) neuron aktivitet fra intakt hjerne utarbeidelse av voksen transgen sebrafisk 9 bruker samme eksperimentell tilnærming som beskrevet for medaka hjernen forberedelse A:. GnRH3: EMD nevroner ligger i ventrale telencephalon (VT) og preoptic . område (POA) i forhjerne av voksen sebrafisk B: GnRH3: EMD nevroner ligger i hypothalamus (føling). Scale barer: 100 mikrometer C:. Sample spor av løs-patch opptak fra GnRH3: EMD nervecellen iVT D:. Sample spor av hel-celle patch opptak fra VT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GnRH 3: GFP transgene fiskene gir unike modeller for å studere de nevrofysiologiske mekanismene bak neuronal integrering og regulering i sentral kontroll av atferd som er både direkte og indirekte involvert i tre reproduksjon, 8-10. En av de betydelige fordelene med dette modellsystemet er at mange GnRH3 nevroner uttrykker GFP seg i nærheten av den ventrale overflaten av hjernen, noe som muliggjør forholdsvis enkel tilgang til nervecellene for elektrofysiologisk registrering uten å forstyrre nevrale kretser 6, 9, 11, 12 (figurene 1B og 1C, Figurene 3A og 3B). I denne videoen har vi vist både løs-patch og hel-celle opptak fra TN-GnRH3 nevroner i intakt voksen hjerne medaka fisk. TN-GnRH3 nevroner viser en tonic eller banke mønster av spontan handling potensial skyte med en frekvens på 0,5-6Hz.There var ingen påvisbare kjønnsforskjeller i spontan fyringsats 5, men det var dramatiske utviklingsmessige endringer i GnRH3 nervecellen elektriske aktiviteter i løpet embryogenese ni. Loose-lapp og hel-celle elektrofysiologi har ulike metodiske fordeler og ulemper. Loose-patch er teknisk enklere enn hel-celle opptak, men bare viser nervecellen avfyring mønster og frekvens. På den annen side, kan hel-celle-opptak gir mye mer informasjon: hvilende membranpotensial, avfyring mønster og frekvens, aksjonspotensialet analyse, membran kapasitans og motstand. Fordi løs-patch opptak ikke bryter cellemembranen og forstyrre den intracellulære ion og andre messenger konsentrasjoner, er det ideelt for langsiktig opptak av neuronal aktivitet. Hele celle opptak brudd cellemembranen og til slutt føre til dialyse av intracellulære molekyler, og dermed potensielt endre nervecellen eiendommer med mer langvarige opptak. På grunn av de fordeler og ulemper ved begge electrophysiological metoder, kan det være viktig å studere nervecellen egenskaper ved hjelp av begge teknikkene. Fordi både pH og osmolaritet er svært viktig for neuron overlevelse og funksjon, alle løsningene i bruk må justeres riktig.
For å bekrefte identiteten av den innspilte nervecellen, blir negativt trykk påføres etter fullføring av opptaket, og deretter fluorescens ved spissen av elektroden er bekreftet ved hjelp av fluorescens mikroskopisk avbildning. Små molekylære fargestoffer eller prober (for eksempel Alexa Fluor 568 fargestoff eller biocytin) kan bli inkludert i den intracellulære løsning for hel-celle-opptak for å markere den innspilte neuron for videre morfologisk analyse.
Hvis du vil spille med suksess fra målet nevroner i intakt hjerne, er dybden av plasseringen av nevroner avgjørende - den dypere nervecellene, desto vanskeligere å patch (både løs-patch og hel-celle). Vanligvis er det mulig dybde for vellykket lapp ca 5-6 cellelag fra overflaten. Medaka TN-GnRH3 nevroner er vanligvis på ventral overflaten av hjernen, mens sebrafisk hypothalamus GnRH3 nevroner kan være opp til 6 cellelagene fra overflaten. Positivt trykk er meget nyttig for å hindre opptak elektroden fra tilstopping, mens nærmer cellene. Denne type eksperimentell tilnærming kan benyttes for en hvilken som helst nevron som er genetisk merket med fluorescerende protein. Å studere GnRH neuron aktivitet i den voksne hjernen, vi rutinemessig bruker medaka fisk og sebrafisk på 4-6 måneders alder. Den yngre fisk med mindre hjerne eller eldre fisk med mer forkalkede hodeskaller, vil gjøre disseksjon mer utfordrende. TN: GnRH3 nevroner er lett tilgjengelig for elektrofysiologi fra voksen medaka hjernen, men dette er ikke tilfelle for voksen sebrafisk som TN: GnRH3 nevroner er innkapslet i en tøff connective slire. På den annen side, GnRH3 nevroner i POA, VT, og hypothalamus er lettere tilgjengelig for elektrofysiologi i voksen sebrafisk hjerne enn fra medaka. Det er ingen sexforskjeller basert på vanskelighetene med disseksjon og elektrofysiologi opptak av noen av artene.
Selv om dette ikke er en in vivo eksperimentell tilnærming, opptak fra de relativt intakt nevrale kretser med minimum skade er en attraktiv måte å utforske den fysiologiske funksjon og regulering av neuronal system av interesse. Den intakt hjerne forberedelse varer i timer, og en god innspilling kan vare i over en time seks. Denne protokollen er egnet for forskere som allerede har grunnleggende kunnskap om og erfaring med elektrofysiologiske teknikker 13, og i tillegg til spesialisert utstyr som kreves for å gjøre jobben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Meng-Chin Lin og Ms Yuan Dong for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health HD053767 (underentrepriser til NLW), og med midler fra Institutt for fysiologi og kontor Vice Chancellor for Research, University of California-Los Angeles (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).
