Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

Summary

In deze video laten we zien hoe de elektrische activiteit van de geïdentificeerde enkele neuronen in een hele brein voorbereiding, waarin complexe neurale circuits behoudt opnemen. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch worden gelabeld met een fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte voorbereiding hersenen.

Abstract

Inzicht in de cel fysiologie van neurale circuits die complexe gedrag reguleren sterk verbeterd door modelsystemen waarop dit kan worden gewerkt in een intact preparaat hersenen waar de neurale circuits van het CZS blijft intact. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch zijn gelabeld met groen fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte hersenen. Vissen hebben meerdere populaties van GnRH neuronen en hun functies zijn afhankelijk van de plaats binnen de hersenen en GnRH gen dat ze expressie ^1. We hebben onze demonstratie gericht op GnRH3 neuronen in de terminal zenuwen (TN) van het te reukbollen met de intacte hersenen van transgene vis medaka (Figuur 1B en C). Studies suggereren dat medaka TN-GnRH3 neuronen zijn neuromodulatory, als een zender van informatie uit de externe omgeving aan het centrale zenuwstelsel; they niet een directe rol spelen in het reguleren hypofyse-gonadale functies, net als de bekende hypothalamus GnRH1 neuronen ^{2, 3.} De tonic patroon van spontane actiepotentiaal afvuren van TN-GnRH3 neuronen is een intrinsieke eigenschap ^4-6, de frequentie waarvan wordt gemoduleerd door visuele signalen van soortgenoten ² en het neuropeptide kisspeptin 1 ^5. In deze video, gebruiken we een stabiele lijn van transgene medaka waarin TN-GnRH3 neuronen drukken een transgenbevattende de promotor regio van Gnrh3 gekoppeld aan verbeterde groen fluorescerend eiwit ⁷ te laten zien hoe je neuronen identificeren en controleren hun elektrische activiteit in de gehele hersenen voorbereiding ^6.

Protocol

1. Dissectie van Brains uit Adult Medaka Verdoven volwassen mannelijke of vrouwelijke (figuur 1A) door onderdompeling in 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), en wacht een paar minuten na de kieuwen bewegingen voordat onthoofden hebben opgehouden. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Californië-Los Angeles. Onthoofden de vis in zoutoplossing bij het staarteinde van de operculum met schaar 60 mm petrischaal. …

Representative Results

Een voorbeeld van bilaterale clusters van GFP-gemerkte TN-GnRH3 neuronen in de hersenen uitgesneden van medaka vissen zijn getoond in figuren 1B en 1C. Elke cluster bevat ongeveer 8-10 GnRH neuronen. De spontane neuronale activiteiten van de doelgroep TN-GnRH3 werden opgenomen in de huidige-clamp-modus (I = 0) met typische werkingsveld van 0.5-6 Hz. Het patroon van de actiepotentiaal afvuren is typisch een tonic of kloppend patroon, met een vrij regelmatige interspike interval. Voorbeel…

Discussion

GnRH 3: GFP transgene vissen bieden unieke modellen om de neurofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de neuronale integratie-en regelgeving in het centrale controle van gedragingen die direct en indirect betrokken zijn bij de voortplanting ^{3, 8-10} bestuderen. Een van de belangrijke voordelen van dit modelsysteem is dat veel GnRH3 neuronen die GFP dicht bij het ​​ventrale oppervlak van de hersenen, waardoor relatief gemakkelijke toegang tot de neuronen voor elektrofysiologische op…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus		BX50W (Upright)
Amplifier	Axon Instruments		Axoclamp 200B
A-D converter	Computer Interference Corp.		Digidata ITC-18
Cooled CCD camera	PCO Computer Optics		Sensicam
Xenon lamp	Sutter Instruments Co.
GFP filter set	Chroma Technologies
Imaging Software	Intelligent Imaging Innovations		Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software	Axon Instruments		Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software	AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage for electrophysiology	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipulator	Sutter Instrument Co	MP-285
Recording Chamber Platform	Warner Instrument Corp.		P1
Recording Chamber	Warner Instrument Corp.		RC-26G
Electrode Puller	Sutter instruments		P87
Filament for electrode puller	Sutter Instruments	FB330B	3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries	World Precision Instruments	1B150-4	Microelectrode for recording
Syringe	Becton Dickinson	309586	3 ml
MS-222	Sigma	E10521-10G	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline			mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch)			mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch)			mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine