Summary
In questo video, dimostreremo come registrare l'attività elettrica di singoli neuroni identificati in una preparazione cervello intero, che preserva i circuiti neurali complessi. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con una proteina fluorescente per l'identificazione nella preparazione cervello intatto.
Abstract
Comprendere la fisiologia delle cellule di circuiti neurali che regolano i comportamenti complessi è notevolmente migliorata utilizzando sistemi modello in cui questo lavoro può essere eseguito in una preparazione intatto cervello in cui i circuiti neurali del sistema nervoso centrale rimane intatto. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con proteina fluorescente verde per l'identificazione nel cervello intatto. I pesci hanno molteplici popolazioni di neuroni GnRH, e le loro funzioni sono dipendenti dalla loro posizione nel cervello e il gene GnRH che essi esprimono 1. Abbiamo focalizzato la nostra dimostrazione GnRH3 neuroni situati nei nervi terminali (TN) associati ai bulbi olfattivi con il cervello intatto del transgenico Medaka pesce (Figura 1B e C). Studi suggeriscono che Medaka TN-GnRH3 neuroni sono neuromodulatori, che agisce come un trasmettitore di informazioni dall'ambiente esterno al sistema nervoso centrale; tehi non svolgono un ruolo diretto nel regolare le funzioni di ipofisi-gonadi, così come il ben noto ipotalamico GnRH1 neuroni 2, 3. L'andamento tonico di azione spontanea potenziale di scarica dei neuroni TN-GnRH3 è una proprietà intrinseca 4-6, la frequenza delle quali è modulata da segnali visivi da conspecifici 2 e il neuropeptide kisspeptin 1 5. In questo video, si usa una linea stabile di Medaka transgenici in cui i neuroni TN-GnRH3 esprimono un transgene contenente la regione del promotore del Gnrh3 legato alla maggiore proteina fluorescente verde 7 per mostrare come identificare i neuroni e monitorare la loro attività elettrica in tutto il cervello preparazione 6.
Protocol
1. Dissezione di Brains da adulti Medaka
- Anestetizzare adulto di sesso maschile o femminile (Figura 1A) immergendo in 5 ml di MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), attendere un paio di minuti dopo i movimenti branchie hanno cessato prima di decapitare. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa della University of California-Los Angeles.
- Decapitare il pesce in soluzione salina di pesce alla fine caudale della opercolo con le forbici in una capsula di Petri del diametro di 60 mm.
- Trasferimento testa di pesce ad un diametro piastra di Petri di 35 mm, riempito a metà con il pesce salino e foderato con Sylgard che ha una depressione in esso per posizionare e fissare la testa per la dissezione del cervello. Posizionare e fissare la testa dorso-laterale con perni di insetti.
- Tagliare con cautela la parte dorsale del cranio attorno al suo perimetro con le forbici sottili e rimuovere delicatamente con una pinza, esponendo la parte dorsale del cervello compreso completamente la parte anteriore del midollo spinale. <li> Sollevare il midollo spinale delicatamente con una pinza fine-tip e recidere i nervi connettivi bilaterali con le forbici dalla punta sottile: nervi cranici, nervi spinali e nervi ottici sul lato ventrale del cervello e dei nervi olfattivi presso la parte anteriore del il cervello.
- Mettere il cervello completamente sezionato in una capsula di Petri fresco riempito con soluzione fisiologica di pesce e di verificare attentamente al microscopio per assicurare tutto il cervello è intatto (compresa la ghiandola pituitaria), senza tagli o forature. Cervelli danneggiati non vengono utilizzati per la sperimentazione.
2. Montaggio del cervello in una camera di registrazione
- Posto una piccola goccia di cianoacrilato o qualche altro colla azione rapida con un ago nel centro della camera di registrazione e diffondere la colla di circa 1 cm 2.
- Trasferire rapidamente il cervello e la colla in basso in posizione ventrale up-side.
- Aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica pesce in modo da riempire la camera di registrazione e copre il cervello. Continuamente perfusioneil cervello con aerato salina pesce ad una velocità di almeno 200 ml / min.
- Utilizzando la messa a punta di pinza rimuovere con attenzione le meningi sulla superficie dell'area di registrazione del cervello.
3. Elettrofisiologia
- Allentato registrazione chiazza di potenziale d'azione di cottura
- Microelettrodi di vetro (6-10 MW) sono costruiti con pipette in vetro borosilicato (1B150F-4, Strumenti di precisione mondiale) utilizzando un estrattore elettrodo (es. Sutter P-87), e ritorno riempiti con la soluzione di registrazione loose-patch a metà strada su per la elettrodo.
- L'utilizzo di un microscopio a fluorescenza in posizione verticale con un dispositivo ad accoppiamento di carica raffreddata (CCD), fotocamera, trovare l'allora obiettivi ad immersione dell'acqua 40x (Figura 1C) GFP che esprimono TN-GnRH3 neuroni attraverso 10x (Figura 1B). Essi sono situati in corrispondenza o in prossimità della superficie ventrale dei bulbi olfattivi, solo anteriori al telencefalo.
- Passare a un monitor video che sta fornendoimmagini in tempo reale dal microscopio per individuare il neurone grappolo TN-GnRH3 (Figura 1C).
- Posizionare il microelettrodo nel bagno di modo che la punta dell'elettrodo è superiore all'obiettivo neurone. Applicare costante leggera pressione positiva alla microelettrodo modo che non diventi intasato, e avvicinarsi delicatamente il neurone bersaglio con la punta dell'elettrodo.
- Controllare e monitorare la resistenza degli elettrodi in modalità voltage-clamp utilizzando il software AxoGraph e amplificatore Axoclamp 200B con il software Axograph (Axon Instruments). Quando si può vedere dal monitor video che la punta dell'elettrodo è sulla superficie del neurone e dal display AxoGraph che la resistenza cambia leggermente, rilasciare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa se necessario, per fare un sigillo bassa resistenza il neurone (<100 MW).
- Passare alla modalità corrente-clamp, e registrare la tensione della membrana costantemente senza alcun input corrente, regolando la scaladi tensione e frequenza di registrazione in caso di necessità. I dati vengono raccolti e analizzati dal software Powerlab (ADInstruments Inc.).
- Record basale attività elettrica in soluzione fisiologica pesce per circa 5 minuti prima di qualsiasi trattamento (Figura 2A). Bagno perfusione di farmaci, ormoni, peptidi, ecc. aggiunto alla soluzione salina pesce continua alla velocità di 200 ml / min, seguito da un periodo di wash-out in pesce normale soluzione salina 5, 6, 11.
- Registrazione cellula intera del potenziale di membrana
L'intera procedura di patch clamp elettrofisiologia cella è uguale a quello della procedura di registrazione loose-patch extracellulare sopra descritto, da passaggi 3.1.1 - 3.1.4. Poi le procedure discostano di conseguenza:- Controllare e monitorare la resistenza degli elettrodi in modalità voltage-clamp. Quando si può vedere dal monitor video che la punta dell'elettrodo è sulla superficie del neurone e dall'oscilloscopio che la resistenza cambia leggermente, rilasciano il positivopressione e applicare una piccola pressione negativa per fare un sigillo ad alta resistenza sul neurone (~ 3 Giga Ω). Applicare aspirazione delicata per via orale alla rottura della membrana patch, si vedrà un calo improvviso della resistenza a circa 120-250 MW.
- Passare alla modalità corrente-clamp, e registrare la tensione della membrana costantemente senza alcun input corrente, regolando la scala di tensione e la frequenza di registrazione, se necessario.
- Record basale attività elettrica in soluzione fisiologica pesce per circa 5 minuti prima di ogni trattamento, come sopra descritto in 3.1.7 (Figura 2B).
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Representative Results
Un esempio di cluster bilaterali di GFP-etichettati TN-GnRH3 neuroni dal cervello asportato di Medaka pesci sono mostrati nelle figure 1B e 1C. Ogni cluster contiene circa 8-10 neuroni GnRH. Le attività neuronali spontanee del target TN-GnRH3 sono stati registrati in modalità di corrente-clamp (I = 0) con tassi di cottura tipiche di 0,5-6 Hz. Il modello di potenziale d'azione di cottura è in genere un modello di tonico o battere, con un intervallo di interspike abbastanza regolare. Tracce del campione sono illustrati nella Figura 2 (2A: loose-patch; 2B: a cellula intera).
Questo approccio sperimentale è anche riuscito a registrazione da neuroni GnRH GFP-etichettati situati nel proencefalo di adulto zebrafish (Figure 3A e 3B). Neurone attività elettrica nel asportato, cervello intatto è stato registrato in modo simile come descritto sopra nella medaka da loose-patch (Figura 3C) e la registrazione a cellula intera ( 
Figura 1. Modello animale utilizzato per lo studio TN-GnRH3 neurone in questo video A: Adulti Medaka GnRH3: GFP transgenico pesci, a sinistra: uomo, a destra:.. Femminile B: confocale immagine della vista ventrale del prosencefalo. OB: bulbo olfattivo; TN: terminale nervoso GnRH3 neuroni; TELE: telencefalo; ON:. Nervo ottico C: Alto ingrandimento: TN-GnRH3 neuroni indicati nella scatola bianca di pannello B. (bar Scala: A: 5 mm B: 100 micron, C: 20 micron). 
Figura 2. Spopotenziali d'azione ntaneous registrate da TN-GnRH3 neuroni in modalità current-clamp (I = 0) A: trace d'esempio della registrazione loose-patch, B:. traccia d'esempio della registrazione a cellula intera. 
Figura 3. Registrazione di GnRH3: EMD (Emerald green fluorescent protein) attività dei neuroni dalla preparazione cervello intatto di adulto zebrafish transgenico 9 utilizzando lo stesso approccio sperimentale come descritto per la preparazione cervello Medaka A:. GnRH3: EMD neuroni situati in telencefalo ventrale (VT) e preottica . zona (POA) nel proencefalo di zebrafish adulto B: GnRH3: EMD neuroni situati nell'ipotalamo (ipo). Barre di scala: 100 micron C:. Traccia di esempio di registrazione loose-patch da GnRH3: EMD neuroneVT D:. Traccia Esempio di registrazione di patch a cellula intera da VT.
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Discussion
GnRH 3: GFP transgenici pesci forniscono modelli unici per studiare i meccanismi neurofisiologici alla base di integrazione neuronale e la regolamentazione nel controllo centrale di comportamenti che sono direttamente e indirettamente coinvolti nella riproduzione 3, 8-10. Uno dei vantaggi significativi di questo modello di sistema è che molti GnRH3 neuroni esprimono GFP sono vicini alla superficie ventrale del cervello, consentendo relativamente facile accesso ai neuroni di registrazione elettrofisiologica senza interrompere circuiti neurali 6, 9, 11, 12 (figure 1B e 1C; Figure 3A e 3B). In questo video, abbiamo dimostrato entrambe le registrazioni loose-patch e whole-cell da TN-GnRH3 neuroni nel cervello adulto intatto di Medaka pesce. TN-GnRH3 neuroni mostrano un tonico o battendo modello del potenziale d'azione spontanea di tiro con una frequenza di 0.5-6Hz.There sono state differenze di sesso rilevabili a scarica spontaneatasso di 5, ma ci sono stati cambiamenti drammatici dello sviluppo nei GnRH3 neurone attività elettriche durante l'embriogenesi 9. Loose-patch ed elettrofisiologia a cellula intera hanno diversi vantaggi e svantaggi metodologici. Loose-patch è tecnicamente più facile di registrazione a cellula intera, ma mostra solo il modello cottura neurone e la frequenza. D'altra parte, la registrazione a cellula intera può fornire molte più informazioni: potenziale di membrana, lo schema di accensione e frequenza, analisi potenziale di azione, capacità della membrana e resistenza. Poiché la registrazione loose-patch non si rompe la membrana cellulare e interrompere lo ione intracellulare e secondo le concentrazioni messaggero, è ideale per la registrazione a lungo termine di attività neuronale. Cellula intera registrazioni rottura della membrana cellulare ed eventualmente portare alla dialisi di molecole intracellulari, così potenzialmente alterare le proprietà neuronali con le registrazioni più prolungati. A causa dei vantaggi e gli svantaggi di entrambi elettrofisiologicimetodi gici, può essere importante per studiare le proprietà dei neuroni che utilizzano entrambe le tecniche. Poiché sia il pH e osmolarità sono molto importanti per la sopravvivenza del neurone e la funzione, tutte le soluzioni in uso devono essere regolati correttamente.
Per confermare l'identità del neurone registrato, la pressione negativa è applicata dopo il completamento della registrazione, e poi fluorescenza sulla punta dell'elettrodo è confermata mediante fluorescenza imaging microscopico. Piccoli coloranti o sonde molecolari (come Alexa Fluor 568 colorante o biocitina) possono essere inclusi nella soluzione intracellulare per la registrazione a cellula intera per segnare il neurone registrata per ulteriori analisi morfologica.
Per registrare con successo da neuroni bersaglio nel cervello intatto, la profondità della posizione dei neuroni è fondamentale - il più profondo dei neuroni, più difficile di patch (sia sciolto-patch e cellula intera). Generalmente, la profondità fattibile per la permutazione di successo è di circa 5-6 strati di cellule dalla superficie. Medalias TN-GnRH3 neuroni sono in genere sulla superficie ventrale del cervello, mentre zebrafish ipotalamici GnRH3 neuroni possono essere fino a 6 strati di cellule dalla superficie. Pressione positiva è molto utile per evitare che l'elettrodo di registrazione da intasamento mentre si avvicina alle cellule. Questo tipo di approccio sperimentale può essere utilizzato per qualsiasi neurone che è geneticamente etichettato con proteina fluorescente. Per studiare l'attività dei neuroni GnRH nel cervello adulto, noi abitualmente utilizziamo Medaka pesce e pesce zebra di 4-6 mesi di età. Il pesce più giovane con il cervello più piccolo o il pesce più vecchio con teschi più calcificate, farà la dissezione più impegnativo. La TN: GnRH3 neuroni sono facilmente accessibili per elettrofisiologia da adulto Medaka cervello, ma questo non è il caso di zebrafish adulto in cui TN: GnRH3 neuroni sono racchiusi in una guaina connettivale duro. D'altra parte, GnRH3 neuroni nel POA, VT, e l'ipotalamo sono più facilmente accessibili per elettrofisiologia nel cervello adulto zebrafish che da Medaka. Non ci sono sessodifferenze basate sulle difficoltà di dissezione e la registrazione elettrofisiologia delle due specie animali.
Anche se questo non è un approccio sperimentale in vivo, la registrazione dai circuiti neuronali relativamente intatti con danno minimo è un modo interessante per esplorare la funzione fisiologica e di regolazione del sistema neuronale di interesse. La preparazione del cervello intatto dura per ore, e una buona registrazione può durare per più di un'ora 6. Questo protocollo è adatta per i ricercatori che hanno già conoscenze di base e di esperienza con le tecniche di elettrofisiologia 13, e così come le attrezzature specializzate necessarie per fare il lavoro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Meng-Chin Lin e signora Yuan Dong per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health HD053767 (subappalto a NLW), e da fondi del Dipartimento di Fisiologia e Ufficio del Vice Rettore per la Ricerca, l'Università di California-Los Angeles (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
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