Summary
I denne video, vil vi vise, hvordan man optager elektriske aktivitet fra identificerede enkeltstoffer neuroner i en hel hjerne forberedelse, som bevarer komplekse neurale kredsløb. Vi bruger transgene fisk, hvor gonadotropin-releasing hormon (GnRH) neuroner er genetisk kodet med et fluorescerende protein til identifikation i den intakte hjerne forberedelse.
Abstract
Forstå cellens fysiologi af neurale kredsløb, der regulerer kompleks adfærd er stærkt forbedret ved hjælp af modelsystemer, hvor dette arbejde kan udføres i en intakt hjerne forberedelse, hvor neurale kredsløb af CNS forbliver intakt. Vi bruger transgene fisk, hvor gonadotropin-releasing hormon (GnRH) neuroner er genetisk kodet med grønt fluorescerende protein til identifikation i den intakte hjerne. Fisk har flere populationer af GnRH neuroner og deres funktioner er afhængige af deres placering i hjernen og GnRH gen, de udtrykker 1.. Vi har fokuseret vores demonstration den GnRH3 neuroner beliggende i de terminale nerver (TN) er forbundet med de olfaktoriske pærer med den intakte hjerne transgene Medaka fisk (figur 1B og C). Undersøgelser tyder på, at Medaka TN-GnRH3 neuroner er neuromodulatory, der handler som en transmitter af oplysninger fra det ydre miljø til det centrale nervesystem; they ikke spille en direkte rolle i reguleringen af hypofyse-gonade-funktioner, som gør den velkendte hypothalamus GnRH1 neuroner 2, 3. Den tonic mønster af spontan handling potentiale affyring af TN-GnRH3 neuroner er en iboende egenskab 4-6, hyppigheden hvoraf moduleres af visuelle referencer fra artsfæller 2 samt neuropeptidet kisspeptin 1 5. I denne video, bruger vi en stabil linje af transgen Medaka hvor TN-GnRH3 neuroner udtrykker et transgen indeholdende promoter region Gnrh3 knyttet til øget grønt fluorescerende protein 7 for at vise dig, hvordan du identificerer neuroner og overvåge deres elektriske aktivitet i hele hjernen forberedelse 6..
Protocol
1.. Dissektion af Brains fra Adult Medaka
- Bedøve voksen mand eller kvinde (figur 1A) ved at nedsænke i 5 ml MS-222 (150 mg / l, pH 7,4), vente et par minutter efter gæller bevægelser er ophørt før decapitating. Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of California-Los Angeles.
- Halshugge fisken i fisk saltvand ved caudale ende af Laag med en saks i et 60-mm diameter petriskål.
- Transfer fisk hoved til en 35-mm petriskål, halvt fyldt med fisk saltvand og foret med Sylgard, der har en depression i det at placere og fastgøre hoved for hjernen dissektion. Placér og fastgør hovedet dorsale opad med insekt ben.
- Forsigtigt skære dorsale del af kraniet omkring sin omkreds med fine saks og forsigtigt fjerne det med en pincet, udsætter den dorsale del af hjernen fuldstændigt, herunder den forreste del af rygmarven. <li> Løft rygmarven forsigtigt med fin spids pincet og skille de bilaterale bindevæv nerver med fin spids saks: kranielle nerver, spinal nerver, og optiske nerver på den ventrale side af hjernen, og de olfaktoriske nerver på forreste del af hjernen.
- Placer fuldt dissekeret hjernen på en frisk petriskål fyldt med fisk saltvand, og kontroller omhyggeligt under mikroskop for at sikre hele hjernen er intakt (herunder hypofysen) uden nedskæringer eller punkteringer. Beskadigede hjerner ikke bruges til eksperimenter.
2.. Montering af Brain i en optagelse Chamber
- Placer en lille dråbe af cyanoacrylat eller en anden hurtigtvirkende lim med en nål ind i midten af optagelsen kammeret og sprede limen omkring 1 cm2.
- Hurtigt overføre hjernen og lim den ned i en ventral-side oppe.
- Tilsæt 1 ml af fisk saltvand så det fylder optagelsen kammeret og dækker hjernen. Kontinuerligt perfunderehjernen med beluftet fisk saltvand ved en hastighed på mindst 200 ul / min.
- Brug den fine-tip tang forsigtigt fjerne meninges over overfladen af optagelsen område af hjernen.
3.. Elektrofysiologi
- Løs plaster registrering af virkningspotentiale fyring
- Glasmikroelektroder (6-10 MOhm) er fremstillet af borosilikatglas pipetter (1B150F-4, Verden Precision Instruments) ved hjælp af en elektrode aftrækker (f.eks Sutter P-87), og bagsiden fyldt med løs-patch optagelse løsning halvvejs op elektrode.
- Ved hjælp af en opretstående fluorescensmikroskop med et afkølet ladningskoblet enhed (CCD) kamera, finde GFP-udtrykkende TN-GnRH3 neuroner gennem 10x (figur 1B), derefter 40x nedsænkning i vand mål (figur 1C). De er placeret ved eller nær den ventrale overflade af de olfaktoriske pærer, lige foran telencephalon.
- Skift til en videomonitor, der udbyderreal-time billeder fra mikroskopet for at finde de TN-GnRH3 neuron klynge (figur 1C).
- Placer mikroelektrode ind i badet, således at spidsen af elektroden er over neuron målet. Påfør konstant let positivt tryk til mikroelektrode, så det ikke bliver tilstoppet, og forsigtigt nærme målet neuron med spidsen af elektroden.
- Kontroller og overvåge elektrode modstand spænding-clamp-tilstand ved hjælp AxoGraph software og forstærker Axoclamp 200B med Axograph software (Axon Instruments). Når du kan se fra videomonitor at spidsen af elektroden er på overfladen af neuron og fra AxoGraph displayet, at modstanden ændrer lidt, slipper positive tryk og anvende svagt undertryk hvis det er nødvendigt at foretage en lav modstand segl på neuron (<100 MOhm).
- Skift til strøm-clamp-mode, og optage membranen spænding kontinuerligt uden nogen aktuelle input, justere skalaenaf spænding og hastighed på optagelse, hvis det er nødvendigt. Data er indsamlet og analyseret af Powerlab software (ADInstruments Inc.).
- Optag baseline elektrisk aktivitet i normalt fisk saltvand i omkring 5 min før en behandling (figur 2A). Bath perfusion af lægemidler, hormoner, peptider, osv. føjes til at fiske saltvand fortsætter med en hastighed på 200 ul / min, efterfulgt af en udvaskningsperiode i normalt fisk saltvand 5, 6, 11.
- Helcelle optagelse af membranpotentiale
Helcelle patch clamp elektrofysiologi Proceduren er den samme som for det ekstracellulære løs-patch optagelse ovenfor beskrevne, fra trin 3.1.1 - 3.1.4. Så de procedurer afviger tilsvarende:- Kontrollér og overvåge elektrodemodstand i spænding-clamp modus. Når du kan se fra videomonitor at spidsen af elektroden er på overfladen af neuron og fra oscilloskopet at modstanden ændres lidt, slipper positivepres og anvende en lidt negativt pres for at gøre en høj resistens forseglingen på neuron (~ 3 Giga Ω). Påfør blid sug i munden på briste lappet membran, vil du se et pludseligt fald i modstanden til omkring 120-250 MOhm.
- Skift til strøm-clamp-mode, og optage membranen spænding kontinuerligt uden nogen aktuelle input, justere omfanget af spænding og hastighed på optagelse, hvis det er nødvendigt.
- Optag baseline elektrisk aktivitet i normalt fisk saltvand i omkring 5 min før en behandling, som beskrevet ovenfor i 3.1.7 (figur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på bilaterale klynger af GFP-mærkede TN-GnRH3 neuroner fra det udskårne hjerne Medaka fisk er vist i figurerne 1B og 1C. Hver klynge indeholder omkring 8-10 GnRH neuroner. De spontane neuronale aktiviteter target TN-GnRH3 blev registreret i den nuværende-clamp-tilstand (I = 0) med typiske fyring satser af 0,5-6 Hz. Mønsteret af handling potentiale fyring er typisk en tonic eller slå mønster, med en temmelig regelmæssig interspike interval. Sample spor er vist i figur 2 (2A: løs-patch, 2B: hel-celle).
Denne eksperimentelle fremgangsmåde er også succes i optagelse fra GFP-mærkede GnRH neuroner beliggende i forhjernen af voksne zebrafisk (fig. 3A og 3B). Neuron elektrisk aktivitet i den udskårne, intakt hjerne blev registreret på samme måde som beskrevet ovenfor i Medaka ved løs-patch (figur 3C) og hel-celle optagelse ( 
Figur 1. Dyremodel anvendt til TN-GnRH3 neuron studie i denne video A: Voksen Medaka GnRH3: GFP transgene fisk, til venstre: mand, højre:.. Tæve B: Konfokal billede af den ventrale udsigt forhjernen. OB: lugtekolben, TN: Terminal nerve GnRH3 neuroner, TELE: telencephalon; ON:. Synsnerven C: Høj forstørrelse på TN-GnRH3 neuroner vises med hvidt æske panel B. (Scale bar: A: 5 mm, B: 100 um C: 20 um). 
Figur 2. Spontaneous virkningspotentialer optaget fra TN-GnRH3 neuroner i strøm-clamp-tilstand (I = 0) A: Prøve spor fra løs-patch optagelsen B:. Sample spor fra hele celler optagelse. 
Figur 3. Optagelse af GnRH3: EMD (Emerald grønt fluorescerende protein) neuron aktivitet fra intakte hjerne forberedelse af voksne transgene zebrafisk 9 vha. samme eksperimentelle fremgangsmåde som beskrevet for Medaka hjernen forberedelse A:. GnRH3: EMD neuroner beliggende i ventrale telencephalon (VT) og præoptiske . areal (POA) i forhjerne af voksne zebrafisk B: GnRH3: EMD neuroner beliggende i hypothalamus (HYPO). Skalapanelerne: 100 um C:. Sample spor af løst-patch optagelse fra GnRH3: EMD neuron iVT D:. Sample spor af hel-celle patch optagelse fra VT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GnRH 3: GFP transgene fisk giver unikke modeller til at studere neurofysiologiske mekanismer bag neuronal integration og regulering i central kontrol af adfærd, der både direkte og indirekte involveret i reproduktion 3, 8-10. En af de betydelige fordele ved denne model er, at mange GnRH3 neuroner udtrykker GFP er tæt på den ventrale overflade af hjernen, der giver mulighed for forholdsvis let adgang til de neuroner elektrofysiologiske optagelse uden at forstyrre neurale kredsløb 6, 9, 11, 12 (fig. 1B og 1C, figur 3A og 3B). I denne video har vi vist både løs-patch og hel-celle optagelser fra TN-GnRH3 neuroner i den intakte voksne hjerne Medaka fisk. TN-GnRH3 neuroner udviser en tonic eller slå mønster af spontan handling potentiale fyring med en frekvens på 0,5 6Hz.There var ingen påviselige kønsforskelle i spontan fyringsats 5, men der var dramatiske udviklingsmæssige ændringer i GnRH3 neuron elektriske aktiviteter under embryogenese 9.. Løs-patch og helcelle elektrofysiologi har forskellige metodiske fordele og ulemper. Loose-patch er teknisk lettere end hel-celle optagelse, men viser kun neuron fyring mønster og frekvens. På den anden side, kan hel-celle optagelse give meget mere information: hvilende membranpotentiale, fyring mønster og frekvens, handling potentiale analyse membran kapacitans og modstand. Fordi løs-patch optagelse ikke bryder cellemembranen og forstyrre den intracellulære ioner og second messenger koncentrationer, er det ideelt til langsigtet optagelse af neuronal aktivitet. Helcelle optagelser brud cellemembranen og eventuelt føre til dialyse af intracellulære molekyler, hvorved de potentielt ændre neuron egenskaber med mere langvarig optagelser. På grund af de fordele og ulemper ved begge electrophysigiske metoder, kan det være vigtigt at studere neuron egenskaber ved hjælp begge teknikker. Fordi både pH og osmolaritet er meget vigtige for neuron overlevelse og funktion, alle løsningerne i brug skal justeres korrekt.
At bekræfte identiteten af den optagede neuron er undertryk påføres efter afslutningen af optagelsen, og derefter fluorescens ved spidsen af elektroden bekræftes ved hjælp af mikroskopisk fluorescensimagografi. Små molekylære farvestoffer eller prober (såsom Alexa Fluor 568 farvestof eller biocytin) kan inkluderes i den intracellulære opløsning for helcelle-optagelse for at markere den optagne neuron til yderligere morfologisk analyse.
Hvis du vil optage med succes fra mål neuroner i intakt hjerne, dybden af placeringen af neuroner er afgørende - den dybere neuroner, jo sværere at lappe (både løs-patch og hel-celle). Generelt mulig dybde for vellykket patching er omkring 5-6 cellelag fra overfladen. Medaka TN-GnRH3 neuroner er typisk på den ventrale overflade af hjernen, mens zebrafisk hypothalamus GnRH3 neuroner kan være op til 6 cellelag fra overfladen. Positivt tryk er meget nyttigt for at forhindre optagelsen elektroden tilstopning, når du nærmer cellerne. Denne type af eksperimentel fremgangsmåde kan anvendes til enhver neuron der er genetisk mærket med fluorescerende protein. At studere GnRH neuron aktivitet i den voksne hjerne, vi anvender rutinemæssigt Medaka fisk og zebrafisk af 4-6 måneder. Den yngre fisk med mindre hjerner eller ældre fisk med flere forkalkede kranier, vil gøre dissektion mere udfordrende. TN: GnRH3 neuroner er let tilgængelige for elektrofysiologi fra voksen Medaka hjerne, men dette er ikke tilfældet for voksne zebrafisk, hvor TN: GnRH3 neuroner er indkapslet i en hård bindevæv kappe. På den anden side er GnRH3 neuroner i POA, VT, og hypothalamus mere let tilgængelig for elektrofysiologi i voksen zebrafisk hjerne end fra Medaka. Der er ingen sexforskelle baseret på vanskelighederne ved dissektion og elektrofysiologi optagelse af begge arter.
Selv om dette ikke er en in vivo eksperimenterende tilgang, optagelse fra de relativt intakte neuronale kredsløb med minimal beskadigelse er en attraktiv måde at udforske den fysiologiske funktion og regulering af neuronale system interesse. Den intakte hjerne forberedelse varer timer, og en god optagelse kan vare over en time 6.. Denne protokol er velegnet til forskere, der allerede har grundlæggende kendskab til og erfaring med elektrofysiologi teknikker 13, og såvel som det specialiserede udstyr, der kræves for at gøre arbejdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Meng-Chin Lin og Ms Yuan Dong til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health HD053767 (underleverance til NLW) og af midler fra Institut for Fysiologi og kontor vicekansler for forskning, University of California-Los Angeles (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).
