Summary
Neste vídeo, vamos demonstrar como para registrar a atividade elétrica dos neurônios individuais identificados em uma preparação do cérebro inteiro, o que preserva os circuitos neurais complexos. Usamos peixe transgênico no qual hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios são geneticamente marcadas com uma proteína fluorescente para identificação na preparação cérebro intacto.
Abstract
Compreendendo a fisiologia da célula de circuitos neurais que regulam comportamentos complexos é muito maior usando sistemas de modelo em que este trabalho podem ser realizados em uma preparação cérebro intacto, onde o circuito neural do SNC permanece intacta. Usamos peixe transgênico no qual hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios são geneticamente marcados com proteína fluorescente verde para identificação no cérebro intacto. Os peixes têm múltiplas populações de neurónios da GnRH, e as suas funções são dependentes da sua localização no cérebro e o gene de GnRH que expressam um. Nós nos concentramos em nossa demonstração GnRH3 neurônios localizados nos nervos terminais (TN) associados aos bulbos olfatórios usando o cérebro intacto de transgênicos medaka peixe (Figura 1B e C). Estudos sugerem que medaka TN-GnRH3 neurónios são neuromodulador, agindo como um transmissor de informação a partir do ambiente externo para o sistema nervoso central; they não desempenham um papel direto na regulação das funções hipofisário-gonadal, assim como o bem conhecido hipotálamo GNRH1 neurônios 2, 3. padrão A tônica do potencial de ação espontâneo disparo de TN-GnRH3 neurônios é uma propriedade intrínseca 4-6, a freqüência de que é modulada por pistas visuais de dois membros da mesma espécie e do neuropeptídeo Kisspeptin 1 5. Neste vídeo, usamos uma linha estável de transgênicos medaka em que TN-GnRH3 neurônios expressam um transgene contendo a região promotora de Gnrh3 ligado ao aumento da proteína verde fluorescente 7 para mostrar a você como identificar neurônios e monitorar a atividade elétrica em todo o cérebro preparação 6.
Protocol
1. Dissecação de cérebros de adultos Medaka
- Anestesiar adulto do sexo masculino ou do sexo feminino (Figura 1A) por imersão em 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), aguarde alguns minutos após movimentos brânquias cessaram antes de decapitar. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Califórnia-Los Angeles.
- Decapitar o peixe em solução salina peixe na extremidade caudal do opérculo com uma tesoura em um diâmetro de 60 mm placa de Petri.
- Transferência de cabeça de peixe até um diâmetro de 35 mm de uma placa de Petri, a metade cheio com solução salina e peixes revestida com Sylgard que tem uma depressão na mesma para posicionar e fixar a cabeça de dissecção cérebro. Posição e garantir a cabeça do lado dorsal com pinos de insetos.
- Corte com cuidado a parte dorsal do crânio em torno do seu perímetro com uma tesoura fina e retire-o delicadamente com uma pinça, expondo a parte dorsal do cérebro, incluindo completamente a parte anterior da medula espinhal. <li> Levante a medula espinhal delicadamente com uma pinça de ponta fina e cortar os nervos conjuntivo bilaterais com uma tesoura de ponta fina: nervos cranianos, nervos espinhais e nervos ópticos no lado ventral do cérebro e dos nervos olfativos na parte anterior do o cérebro.
- Coloque o cérebro totalmente dissecada em uma placa de Petri fresco preenchido com solução salina peixe e verifique cuidadosamente sob o microscópio para garantir todo o cérebro está intacto (incluindo a glândula pituitária), sem quaisquer cortes ou perfurações. Cérebros danificados, não são utilizados para a experimentação.
2. Montagem do cérebro em uma câmara de gravação
- Colocar uma pequena gota de cianoacrilato ou algum outro tipo de cola de acção rápida com uma agulha no centro da câmara de registo e para espalhar a cola de cerca de 1 cm 2.
- Transferir rapidamente o cérebro e cola-lo em uma posição ventral up-side.
- Adicionar 1 ml de solução salina de peixe de modo que ele preenche a câmara de registo e cobre o cérebro. Perfundir continuamenteo cérebro com salino gaseificado peixe a uma taxa de pelo menos 200 ul / min.
- Usando a ponta fina forceps remover cuidadosamente as meninges sobre a superfície da área de gravação do cérebro.
3. Eletrofisiologia
- Gravação remendo solto da ação potencial de queima
- Microeletrodos de vidro (6-10 mohms) são construídos a partir de pipetas de vidro de borosilicato (1B150F-4, Instrumentos de Precisão Mundial), utilizando um extrator de eletrodo (por exemplo, Sutter P-87), e de volta preenchido com a solução de gravação solta-patch no meio do caminho até o eletrodo.
- Usando um microscópio de fluorescência na posição vertical com a charge-coupled device refrigerado (CCD) da câmera, encontrar o GFP-expressando TN-GnRH3 neurônios através de 10x (Figura 1B), então os objetivos de imersão em água 40x (Figura 1C). Eles estão localizados em ou perto da superfície ventral dos bulbos olfativos, anteriormente ao telencéfalo.
- Mudar para um monitor de vídeo que está fornecendoimagens em tempo real a partir do microscópio para localizar o cluster neurônio TN-GnRH3 (Figura 1C).
- Posicionar o microeléctrodo no banho de modo que a ponta do eléctrodo está acima do neurónio alvo. Aplicar constante leve pressão positiva para o microeléctrodo de modo que ela não se torne obstruído, e aproximar-se suavemente o neurónio alvo com a ponta do eléctrodo.
- Controlar e monitorar a resistência do eletrodo no modo tensão-clamp usando software AxoGraph e amplificador Axoclamp 200B com software Axograph (Axon Instruments). Quando você pode ver a partir do monitor de vídeo que a ponta do eletrodo está na superfície do neurônio e da exibição de AxoGraph que a resistência muda um pouco, solte a pressão positiva e aplique uma ligeira pressão negativa se necessário, para fazer um selo de baixa resistência em neurônio (<100 mohms).
- Alternar para o modo atual-clamp, e registrar a tensão de membrana continuamente, sem qualquer entrada de corrente, ajustando a escalada tensão e da velocidade de gravação, se necessário. Os dados são coletados e analisados por software Powerlab (ADInstruments Inc.).
- Actividade da ficha eléctrica da linha de base em solução salina normal para peixes cerca de 5 minutos antes de qualquer tratamento (Figura 2A). Banheira de perfusão de medicamentos, hormônios peptídeos, etc. adicionada a solução salina de peixe continua a uma taxa de 200 ul / min, seguido por um período de lavagem em solução salina normal, peixes 5, 6, 11.
- Gravação do potencial de membrana de células inteiras
O adesivo de fixação procedimento electrofisiologia célula total é a mesma que a do processo de gravação solta-remendo extracelular acima descrito, a partir das etapas 3.1.1 - 3.1.4. Em seguida, os procedimentos de desviar de acordo:- Controlar e monitorar a resistência do eletrodo no modo tensão-clamp. Quando você pode ver a partir do monitor de vídeo que a ponta do eletrodo está na superfície do neurônio e do osciloscópio que a resistência muda um pouco, solte o positivoaplicar pressão e um pouco de pressão negativa para fazer uma vedação de alta resistência no neurónio (~ 3 Giga Ω). Aplicar sucção suave pela boca a ruptura da membrana remendado, você vai ver uma queda brusca da resistência à cerca de 120-250 mohms.
- Alternar para o modo atual-clamp, e registrar a tensão de membrana continuamente, sem qualquer entrada de corrente, ajustando a escala de tensão e taxa de gravação, se necessário.
- Actividade da ficha eléctrica da linha de base em solução salina normal para peixes cerca de 5 minutos antes de qualquer tratamento, como acima descrito no 3.1.7 (Figura 2B).
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Representative Results
Um exemplo de grupos bilaterais de GFP marcadas com TN-GnRH3 neurónios do cérebro excisada de medaka peixes são apresentados nas Figuras 1B e 1C. Cada cluster contém cerca de 8-10 neurônios GnRH. As actividades neuronais espontâneas do destino TN-GnRH3 foram registrados no modo de corrente-braçadeira (I = 0), com taxas de queima típicas de 0,5-6 Hz. O padrão de ação potencial de queima é tipicamente um padrão tônico ou batendo, com um intervalo bastante regular interspike. Vestígios Exemplo são mostrados na Figura 2 (2A: solta-remendo; 2B: células inteiras).
Esta abordagem experimental também é bem sucedido na gravação de GFP marcadas com GnRH neurónios localizados na parte frontal do cérebro de adulto do peixe-zebra (Figuras 3A e 3B). Atividade elétrica dos neurônios no excisadas, o cérebro intacto foi registrado na mesma forma como descrito acima em medaka por loose-patch (Figura 3C) e gravação de célula inteira ( 
Figura 1. Modelo animal usado para o estudo TN-GnRH3 neurônio neste vídeo A: Adulto medaka GnRH3: GFP transgênico peixe, para a esquerda: masculino; direita:.. Feminino B: imagem confocal da vista ventral do cérebro anterior. OB: bulbo olfatório; TN: Terminal nervo GnRH3 neurônios; TELE: telencéfalo; ON:. Nervo óptico C: alta ampliação de TN-GnRH3 neurônios mostrados na caixa branca do painel B. (Barra de escala: A: 5 mm; B: 100 im; C: 20 mm). 
Figura 2. Spopotenciais de ação ntaneous gravadas de TN-GnRH3 neurônios no modo atual-clamp (I = 0): trace Amostra de solta-patch de gravação; B:. Amostra traço de gravação de célula inteira. 
Figura 3. Gravação de GnRH3: EMD (Emerald green fluorescent protein) a atividade dos neurônios do cérebro intacto preparação de adulto zebrafish transgênicos 9 usando a mesma abordagem experimental, conforme descrito para a preparação do cérebro medaka A:. GnRH3: EMD neurônios localizados no telencéfalo ventral (VT) e preoptic . área (POA) no prosencéfalo de peixe-zebra adulto B: GnRH3: EMD neurônios localizados no hipotálamo (hipo). Barras de escala: 100 mM C:. Amostra traço de gravação solta-patch de GnRH3: EMD neurônio emVT D:. Amostra traço de gravação patch-célula inteira de VT.
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Discussion
GnRH 3: GFP peixes transgênicos oferecem modelos exclusivos para estudar os mecanismos neurofisiológicos subjacentes à integração e regulamentação de controle central de comportamentos que estão direta e indiretamente envolvidos na reprodução 3, 8-10 neuronal. Uma das vantagens significativas deste sistema modelo é que muitas GnRH3 neurónios expressando GFP estão perto da superfície ventral do cérebro, o que permite um acesso relativamente fácil para os neurónios para o registo electrofisiológico sem perturbar os circuitos neurais 6, 9, 11, 12 (Figuras 1B e 1C, as Figuras 3A e 3B). Neste vídeo, mostramos duas gravações solta-patch e de célula inteira de TN-GnRH3 neurônios no cérebro adulto intacto de medaka peixe. TN-GnRH3 neurônios apresentam um tônico ou batendo padrão do potencial de ação espontâneo disparando com uma frequência de 0,5 6Hz.There houve diferenças sexuais detectáveis no disparo espontâneotaxa de 5, mas houve mudanças dramáticas no desenvolvimento GnRH3 neurônio atividades elétricas durante a embriogênese 9. Loose-patch e eletrofisiologia de células inteiras têm diferentes vantagens metodológicas e desvantagens. Loose-patch é tecnicamente mais fácil do que a gravação de célula inteira, mas só mostra o padrão de disparo dos neurônios e frequência. Por outro lado, a gravação de células inteiras podem fornecer muito mais informações: potencial de repouso, disparando padrão e frequência, análise de potencial de ação, a capacitância de membrana e resistência. Porque gravação solta-patch não quebrar a membrana da célula e interromper o íon intracelular e concentrações de segundos mensageiros, é ideal para gravação de longo prazo da atividade neuronal. Ruptura gravações de células inteiras da membrana celular e, eventualmente, levar a diálise de moléculas intracelulares, assim potencialmente alterar as propriedades neuronais com gravações mais prolongados. Por causa das vantagens e desvantagens de ambos electrophysimétodos fisiológicas, pode ser importante para estudar as propriedades de neurónios utilizando ambas as técnicas. Porque tanto o pH e osmolaridade são muito importantes para a sobrevivência de neurónios e função, todas as soluções utilizadas devem ser ajustadas adequadamente.
Para confirmar a identidade do neurónio gravada, a pressão negativa é aplicada após a conclusão do registo, e, em seguida, a fluorescência na ponta do eléctrodo é confirmada usando imagens de fluorescência microscópica. Corantes moleculares pequenos ou sondas (tais como o corante Alexa Fluor 568 ou biocitina) podem ser incluídos na solução intracelular para o registo de células inteiras para marcar o neurónio gravados para posterior análise morfológica.
Para gravar com sucesso a partir de neurônios alvo no cérebro intacto, a profundidade da localização dos neurônios é fundamental - o mais profundo dos neurônios, o mais difícil para patch (tanto solta-patch e todo-cell). Geralmente, a profundidade viável para remendar sucesso é de cerca de 5-6 camadas de células da superfície. Medaka TN-GnRH3 neurónios são tipicamente na superfície ventral do cérebro, enquanto zebrafish GnRH3 neurónios hipotalâmicos podem ter até seis camadas de células da superfície. A pressão positiva é muito útil para evitar que o eletrodo de registro de entupimento quando se aproxima das células. Este tipo de abordagem experimental pode ser utilizado para qualquer neurónio que está geneticamente marcada com proteína fluorescente. Para estudar a atividade dos neurônios GnRH no cérebro adulto, que usam rotineiramente medaka peixe e peixe-zebra de 4-6 meses de idade. O peixe mais jovem, com cérebros menores ou peixes mais velhos com crânios mais calcificadas, fará a dissecção mais desafiador. A TN: GnRH3 neurônios são facilmente acessíveis para eletrofisiologia do adulto medaka cérebro, mas este não é o caso do peixe-zebra adulto em que TN: GnRH3 neurônios são encerradas em uma bainha conjuntivo resistente. Por outro lado, GnRH3 neurônios em POA, VT e hipotálamo são mais facilmente acessíveis para eletrofisiologia no cérebro de peixe-zebra adulto do que de medaka. Não há sexodiferenças baseadas nas dificuldades de dissecção e gravação de eletrofisiologia de ambas as espécies.
Embora esta não é uma abordagem experimental em vivo, a gravação dos circuitos neuronais relativamente intactas com dano mínimo é uma forma atraente para explorar a função fisiológica e regulação do sistema neuronal de interesse. A preparação cérebro intacto dura horas, e uma boa gravação pode durar mais de uma hora 6. Este protocolo é adequado para os investigadores que já têm conhecimento básico e experiência com técnicas electrofisiologia 13, e, assim como o equipamento especializado requerido para realizar o trabalho.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Meng-Lin Chin e Sra. Yuan Dong para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health HD053767 (subcontrato para NLW) e por fundos do Departamento de Fisiologia e Gabinete do Vice-Reitor de Pesquisa, Universidade da Califórnia-Los Angeles (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).
