Summary
I den här videon, kommer vi att visa hur man registrerar elektriska aktiviteten från identifierade enskilda nervceller i hela hjärnan beredning, vilket bevarar komplexa neurala kretsar. Vi använder transgen fisk i vilken gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) nervceller är genetiskt märkta med en fluorescerande protein för identifiering i den intakta hjärnan beredning.
Abstract
Förstå cellens fysiologi nervbanor som reglerar komplexa beteenden har ökat avsevärt genom att använda modellsystem där detta arbete kan utföras i en intakt hjärna beredning där neurala kretsar i CNS förblir intakt. Vi använder transgen fisk i vilken gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) nervceller är genetiskt märkta med grönt fluorescerande protein för identifiering i den intakta hjärnan. Fisk har flera populationer av GnRH neurons, och deras funktioner är beroende av deras läge i hjärnan och den GnRH-genen att de uttrycker en. Vi har fokuserat vår demonstration på GnRH3 neuroner i terminalen nerver (TN) är förknippade med lukt glödlampor med den intakta hjärnan av transgen medaka fisk (Figur 1B och C). Studier tyder på att medaka TN-GnRH3 nervceller är neuromodulatory, i egenskap av en sändare av information från den yttre omgivningen till det centrala nervsystemet; thej inte spelar en direkt roll i regleringen av hypofys-gonadfunktioner, liksom den välkända hypotalamus GnRH1 nervceller 2, 3. tonic mönster av spontan aktionspotential bränning av TN-GnRH3 neuroner är en inneboende egenskap 4-6, frekvensen varav moduleras genom visuella referenser från artfränder 2 och neuropeptid kisspeptin 1 5. I den här videon, använder vi en stabil linje av transgena medaka där TN-GnRH3 nervceller uttrycka en transgen innehållande promotorregionen av Gnrh3 kopplat till förbättrade grönt fluorescerande protein 7 för att visa dig hur man identifierar neurons och övervaka deras elektriska aktiviteten i hela hjärnan framställning 6.
Protocol
Ett. Dissektion av Brains från Adult Medaka
- Söva vuxen man eller kvinna (Figur 1A) genom nedsänkning i 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), vänta ett par minuter efter gälar rörelser har upphört innan halshugga. Alla förfaranden godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén av University of California-Los Angeles.
- Halshugga fisken i fisk saltlösning vid den kaudala änden av kapseln med en sax i en 60-mm diameter petriskål.
- Överför fisk huvud till en 35-mm diameter petriskål, fylld hälften med fisk saltlösning och fodrad med Sylgard som har en fördjupning i det att positionera och säkra huvudet för hjärnan dissekering. Placera och fäst huvudet rygg uppåt med insekter stift.
- Skär försiktigt ryggdelen av skallen runt dess omkrets med fina sax och försiktigt bort det med pincett, utsätta den dorsala delen av hjärnan helt inklusive den främre delen av ryggmärgen. <li> Lyft ryggmärgen försiktigt med fin spets pincett och kapa de bilaterala bindväv nerverna med spetsig sax: cranial nerver, spinal nerver och synnerverna på den ventrala sidan av hjärnan, och luktsinnet nerver vid den främre delen av hjärnan.
- Placera helt dissekerade hjärnan i en ny petriskål fylld med fisk saltlösning, och kolla noga under mikroskop för att säkerställa att hela hjärnan är intakt (inklusive hypofysen) utan nedskärningar eller punktering. Skadade hjärnor inte används för experiment.
2. Montering av hjärnan i en inspelning kammare
- Placera en liten droppe cyanoakrylat eller någon annan snabbverkande lim med en nål in i centrum av inspelningen kammaren och sprida limmet ca 1 cm 2.
- Snabbt överföra hjärnan och limma ner det i en ventral-sidan uppåt läge.
- Tillsätt 1 ml av fisk saltlösning så att den fyller inspelningen kammaren och täcker hjärnan. Kontinuerligt BEGJUTAhjärnan med luftad fisk koksaltlösning vid en hastighet av minst 200 ul / min.
- Använda fin spets pincett försiktigt bort meningerna över ytan av inspelningen område i hjärnan.
Tre. Elektrofysiologi
- Loose patch inspelning av aktionspotential bränning
- Glasmikroelektroder (6-10 MQ) är tillverkade av borosilikatglas pipetter (1B150F-4, World Precision Instruments) med användning av en elektrod avdragare (t.ex. Sutter P-87), och tillbaka fyllda med den lös-patch inspelning lösning halvvägs upp elektroden.
- Använda en upprätt fluorescerande mikroskop med en kyld charge-coupled device (CCD) kamera, hitta GFP-uttryckande TN-GnRH3 neuroner genom 10x (Figur 1B), då 40x nedsänkning i vatten mål (Figur 1C). De är belägna vid eller nära den ventrala ytan av luktsinnet lökar, bara anterior till telencephalon.
- Byt till en videomonitor som tillhandahållerrealtid bilder från mikroskop för att lokalisera TN-GnRH3 neuron kluster (Figur 1C).
- Placera mikroelektrod in i badet så att spetsen av elektroden ligger över neuron målet. Applicera konstant svagt positivt tryck till mikroelektroden så att den inte blir igensatta, och försiktigt närma sig målet neuron med spetsen av elektroden.
- Kontrollera och övervaka elektrodresistans i spänning-clamp läge med AxoGraph programvara och förstärkare Axoclamp 200B med Axograph mjukvara (Axon Instruments). När du kan se från videomonitorn att spetsen av elektroden befinner sig på ytan av neuron och från AxoGraph displayen att resistansen förändras något, släpper det positiva trycket och anbringa ett lätt negativt tryck om nödvändigt för att göra en låg resistans sigill på neuronen (<100 MQ).
- Växla till aktuell-clamp-läge, och spela in membranet spänningen kontinuerligt utan ström ingång, justera skalanav spänningen och hastigheten för inspelning vid behov. Data samlas in och analyseras av Powerlab programvara (ADInstruments Inc.).
- Record baslinjen elektrisk aktivitet i normal fisk saltlösning under ca 5 min innan någon behandling (Figur 2A). Bath perfusion av läkemedel, hormoner, peptider, etc. läggas att fiska saltlösning fortsätter med en hastighet av 200 l / min, följt av en wash-out period i normal fisk saltlösning 5, 6, 11.
- Whole cell inspelning av membranpotential
Hela cell patch clamp elektrofysiologi Proceduren är densamma som den för den extracellulära lös-patch inspelning förfarande som beskrivs ovan, från steg 3.1.1 - 3.1.4. Då de förfaranden avviker därefter:- Kontrollera och övervaka elektroden motstånd i spänning-clamp-läge. När du kan se från videomonitor att spetsen av elektroden är på ytan av neuron och från oscilloskopet att resistans ändras något, släpp positivatryck och tillämpa lite undertryck för att göra en hög resistans tätning på neuron (~ 3 Giga Ω). Ansök skonsam sugkraft genom munnen för att spräcka den lappade membranet, kommer du att se en plötslig minskning av motståndet till ca 120-250 Mohm.
- Växla till aktuell-clamp-läge, och spela in membranet spänningen kontinuerligt utan ström ingång, justera omfattningen av spänningen och hastigheten på inspelningen om det behövs.
- Record baslinjen elektrisk aktivitet i normal fisk saltlösning under ca 5 min innan någon behandling, såsom beskrivits ovan i 3.1.7 (Figur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på bilaterala kluster av GFP-märkta TN-GnRH3 neuroner från den utskurna hjärnan hos medaka fisk visas i figurerna 1B och 1C. Varje kluster innehåller cirka 8-10 GnRH nervceller. De spontana neuronala aktiviteter målet TN-GnRH3 noterades i ström-clamp-läge (I = 0) med typiska bränning hastigheter av 0,5-6 Hz. Mönstret av aktionspotential bränning är vanligtvis en tonic eller slå mönster, med en ganska regelbunden interspike intervall. Exempel på spår visas i figur 2 (2A: lös-patch, 2B: hel-cell).
Denna experimentella tillvägagångssätt är också framgångsrik i inspelningen från GFP-märkta GnRH neuron belägna i framhjärnan av vuxna zebrafisk (figurerna 3A och 3B). Neuron elektrisk aktivitet i den utskurna, intakta hjärnan spelades in på liknande sätt som beskrivits ovan i medaka genom lös-patch (fig 3C) och helcells-inspelning ( 
Figur 1. Djurmodell används för TN-GnRH3 neuron studie i denna video A: Vuxen medaka GnRH3: GFP transgena fiskar, vänster: hane, höger:.. Kvinnlig B: Confocal bilden av den ventrala syn på framhjärnan. OB: luktbulben, TN: Terminal nerv GnRH3 neuroner, TELE: telencephalon, ON:. Synnerven C: Hög förstoring av TN-GnRH3 neuroner visas i vitt fält av panel B. (Skala bar: A: 5 mm, B: 100 im; C: 20 ^ m). 
Figur 2. Spontaneous aktionspotentialer inspelade från TN-GnRH3 nervceller i ström-clamp-läge (I = 0) A: Prov spår från lös-patch inspelning, B:. Sample spår från hela celler inspelning. 
Figur 3. Registrering av GnRH3: EMD (Emerald grönt fluorescerande protein) neuron aktivitet från intakta hjärnan beredning av vuxen transgen zebrafisk 9 med användning av samma experimentella tillvägagångssätt som beskrivits för medaka hjärnan beredningen A:. GnRH3: EMD neuron belägna i ventrala telencefalon (VT) och preoptiska . område (POA) i framhjärna av vuxna zebrafisk B: GnRH3: EMD neuron belägna i hypothalamus (HYPO). Skala barer: 100 pm C:. Sample spår av lös-patch inspelning från GnRH3: EMD neuron iVT D:. Sample spår av hel-cell patch inspelning från VT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GnRH 3: GFP transgena fiskar ger unika modeller för att studera neurofysiologiska mekanismer bakom neuronal integration och reglering i central kontroll av beteenden som är både direkt och indirekt involverade i fortplantning 3, 8-10. En av de stora fördelarna med denna modell system är att många GnRH3 nervceller som uttrycker GFP är nära den ventrala ytan av hjärnan, vilket möjliggör relativt enkel tillgång till de nervceller för elektrofysiologiska inspelning utan att störa nervbanor 6, 9, 11, 12 (Siffror 1B och 1C, fig. 3A och 3B). I den här videon, har vi visat både lös-patch och hel-cell inspelningar från TN-GnRH3 nervceller i den intakta vuxen hjärna medaka fisk. TN-GnRH3 neuroner uppvisar en tonic eller slå mönster av spontan aktionspotential bränning med en frekvens av 0,5-6Hz.There fanns inga påvisbara könsskillnader i spontan bränningkurs 5, men det fanns dramatiska utvecklingsmässiga förändringar i GnRH3 neuron elektriska aktiviteter under fosterutvecklingen 9. Loose-patch och helcell-elektrofysiologi har olika metodologiska fördelar och nackdelar. Loose-patch är tekniskt enklare än hel-cell inspelning, utan bara visar mönstret neuron bränning och frekvens. Å andra sidan, kan hel-cell inspelning ger betydligt mer information: vila membran potential, bränning mönster och frekvens, aktionspotential analys, membran kapacitans och motstånd. Eftersom lös-patch inspelning inte bryta cellmembranet och störa intracellulära jonen och andra koncentrationer budbärare, är den idealisk för långvarig inspelning av neuronal aktivitet. Hela cellen inspelningar bristning cellmembranet och så småningom leda till dialys av intracellulära molekyler, och därigenom potentiellt förändra neuron fastigheter med mer långvariga inspelningar. På grund av de fördelar och nackdelar med både electrophysigiska metoder, kan det vara viktigt att studera neuron egenskaper med hjälp av båda teknikerna. Eftersom både pH och osmolaritet är mycket viktiga för neuron överlevnad och funktion, alla lösningar som används behöva justeras på rätt sätt.
För att bekräfta identiteten på den inspelade neuron, är undertryck appliceras efter avslutad inspelning, och sedan fluorescens vid spetsen av elektroden bekräftas med hjälp av mikroskopisk fluorescens avbildning. Små molekylära färgämnen eller sonder (t.ex. Alexa Fluor 568 färgämne eller biocytin) kan ingå i den intracellulära lösningen för hela-cell inspelning för att markera den inspelade neuron för ytterligare morfologisk analys.
Om du vill spela framgångsrikt från mål nervceller i intakta hjärnan, är djupet av placeringen av nervceller avgörande - ju djupare nervceller, desto svårare att plåstret (både lös-patch och hel-cell). Generellt är det genomförbart djupet för framgångsrik patchning ca 5-6 cellager från ytan. Medaka TN-GnRH3 nervceller är typiskt vid den ventrala ytan av hjärnan, medan zebrafisk hypotalamiska GnRH3 nervceller kan vara upp till 6 cellskikt från ytan. Positivt tryck är mycket användbart att skydda inspelningen elektroden från igensättning när du närmar cellerna. Denna typ av experimentell metod kan användas för något neuron som är genetiskt märkt med fluorescerande protein. Att studera GnRH neuron aktivitet i den vuxna hjärnan, använder vi rutinmässigt medaka fisk och zebrafisk av 4-6 månaders ålder. Den yngre fisk med mindre hjärnor eller äldre fisk med mera förkalkade skallar, gör dissekering mer utmanande. Den TN: GnRH3 neuroner är lätt åtkomliga för elektrofysiologi från vuxen medaka hjärna, men detta är inte fallet för vuxna zebrafisk i vilken TN: GnRH3 neuroner är inneslutna i en tuff connective mantel. Å andra sidan, GnRH3 neuroner i POA, VT och hypotalamus är mer lättillgängliga för elektrofysiologi i vuxna zebrafisk hjärna än från medaka. Det finns inget könskillnader baserat på svårigheterna med dissektion och elektrofysiologi inspelning av någon av arterna.
Även om detta inte är en in vivo experimentell metod, inspelning från de relativt intakta neuronala kretsar med minimal skada är ett attraktivt sätt att utforska den fysiologiska funktionen och regleringen av neuronala systemet av intresse. Den intakta hjärnan förberedelse varar i timmar, och en bra inspelning kan pågå i över en timme 6. Detta protokoll är lämpligt för forskare som redan har grundläggande kunskaper om och erfarenhet av elektrofysiologi tekniker 13, och liksom den specialutrustning som krävs för att göra jobbet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Meng-Chin Lin och Ms Yuan Dong för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health HD053767 (underleverantör till NLW), samt genom medel från Institutionen för fysiologi och tjänstgörande rektor för forskning, University of California-Los Angeles (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).
