Udarbejdelse af pancreas acinarceller til brug ved Calcium Imaging, celleskade Målinger og adenovirusinfektion

Summary

Vi beskriver en reproducerbar fremgangsmåde til fremstilling af muse pankreatiske acinarceller fra en mus for at undersøge acinar celle calcium signaler og cellulær skade med fysiologisk og patologisk relevante stimuli. En fremgangsmåde til adenoviral infektion af disse celler er også tilvejebragt.

Abstract

Pancreas acinar celle er den vigtigste parenkyme celle af eksokrine pancreas og spiller en primær rolle i sekretion af pancreas enzymer i pancreas kanalen. Det er også stedet for at indlede pancreatitis. Her beskriver vi, hvordan acinar celler isoleres fra hele pancreas væv og intracellulære calcium signaler måles. Herudover beskriver vi de teknikker transfektion disse celler med adenovirale konstruktioner, og efterfølgende måling af udsivning af lactatdehydrogenase, en markør for celleskade under betingelser der inducerer acinar celleskade in vitro. Disse teknikker giver et kraftfuldt værktøj til at karakterisere acinar celle fysiologi og patologi.

Introduction

Dynamiske ændringer i cytosolisk calcium er nødvendig for både fysiologiske og patologiske acinar celle begivenheder. Disse forskellige effekter af calcium menes at stamme fra forskellige rumlige og tidslige mønstre af calcium signalering ^1. For eksempel enzym og væske sekretion fra acinar celle er knyttet til calcium pigge fra en begrænset område af den apikale pol hvor sekretion finder sted ^2.. I modsætning hertil er en global calcium bølge efterfulgt af intense ikke-oscillerende calcium signaler forbundet med tidlige patologiske begivenheder, der fører til akut pancreatitis ^3,4. Disse omfatter intra-acinært protease aktivering, reduceret enzym sekretion, og acinar celle skade. Vores laboratorium bruger isoleret pancreas acini at studere disse tidlige patologiske begivenheder, der fører til sygdom både in vivo og in vitro ^5-7. De beskrevne metoder her beskrive isolering af primære acinarceller med henblik på måling af cytosolic calcium niveauer og celle skade. En fremgangsmåde til adenoviral infektion af disse celler er også tilvejebragt.

Protocol

1.. Forberedelse Pancreas acinarceller for Calcium Imaging

1. Forbered HEPES inkubationspuffer indeholdende 20 mM HEPES, 95 mM NaCI, 4,7 mM KCI, 0,6 mM _MgCl2, 1,3 mM _CaCl2, 10 mM glucose, 2 mM glutamin og 1 × mindste Eagles medium ikke-essentielle aminosyrer. Juster den endelige opløsning til pH 7,4 med NaOH.
2. Forbered en BSA inkubationspuffer ved tilsætning BSA (1% vægt / volumen endelig) til 25 ml af HEPES inkubationsbuffer (beskrevet ovenfor).
3. Forbered en collagenasefordøjelse buffer ved tilsætning 1,1 mg / ml (200 enheder / ml) type 4 collagenase og 1 mg / ml sojabønnetrypsininhibitor til 6 ml BSA inkubationsbuffer (beskrevet ovenfor).
4. Syre-vask 22x22 mm dækglas ved at nedsænke i to dele HNO ₃ og en del HCI i 2 timer. Derefter dekanteres bruge DI vand og opbevares i 70% ethanol.
5. Afliv en mus ved CO ₂ kvælning. Orient dyret i liggende stilling, og forberede den abdominale overflade ved cleaning med 70% ethanol. Udfør en laparotomi at eksponere bughulen. Dissekere ud bugspytkirtlen og straks skylle i en lille vejer båd indeholdende 6 ml collagenasefordøjelse buffer.
6. Dissekere væk eventuelle store stykker af fedt eller synlige blodkar, fjern derefter 5 ml collagenasefordøjelse puffer og føje den tilbage til 15 ml konisk rør.
7. Brug fine dissektion saks hakkekød bugspytkirtlen i den lille vejebåd indeholdende 1 ml collagenasefordøjelse buffer. Hakke indtil den resulterende opløsning ser jævnt dispergeret.
8. Overfør hakket produktet til en 125 ml Erlenmeyer plastflaske og tilføje de resterende 5 ml collagenasefordøjelse buffer til beholderen. Sørg for, at vævet er fuldt nedsænket i buffer.
9. Kolben anbringes i et 37 ° C vandbad og ryst ved 90 rpm i 30 min. I løbet af denne korte periode nedetid, forberede calcium aktiverende agonister (f.eks caerulein, carbachol) og skyl 22x22 mm afsyret dækselglider med DI vand. Tør, og derefter placere på toppen af ​​en flad overflade foret med laboratorie film.
10. Efter 30 min fordøje er færdig, overføre suspensionen tilbage til 15 ml koniske rør og tillade cellerne at sætte sig. Forsigtigt pipette ud collagenasefordøjelse buffer og erstatte med 6 ml BSA inkubationsbuffer. Rystes kraftigt med hånden i 10 sekunder for at dispergere cellerne i mindre klynger. Straks efter at ryste, fjerne store, flydende vragdele fra uafviklede medier.
11. Lad de resterende celler at bosætte og udveksle medierne med frisk BSA inkubationspuffer.
12. Gentag trin 1.11 to gange, indtil suspensionen kun består af små klynger, der kun fint synlige for det blotte øje. Cellerne bør ligne dem afbildet i figur 1A (øverste række).
13. Fjern BSA inkubationsbuffer og erstatte med HEPES inkubationspuffer.
14. Forbered en 750 uM, 100X materiel af Fluo-04:00 i 10% DMSO.
15. Indlæse celler i 15 ml koniske rør indeholdende cellesuspensionen og BSA-fri HEPES inkubationspuffer. For at gøre dette, tilføj en passende mængde (1:100 fortynding) af stamopløsningen til cellen suspension. Så plade 500 pi af denne suspension på hver 22x22 mm dækglas.
16. Hold dækglas i mørke ved stuetemperatur. Tag den første Ca ^{2 +} målinger 30 min efter læsningen. Farvestoffet fjernes automatisk fra mediet efter start perfusionen, hvilket skal ske 30 min efter farvestof belastning.

2.. Måling Calcium i pancreas acinarceller

1. Skyl hver perfusion set-up med DI-vand og fyldes med en passende mængde buffer eller agonist. Prime hver sprøjte med buffer eller agonist for at sikre korrekt flow. Clamp sprøjter til en ring stå ca 1-2 meter over mikroskopbordet.
2. Brug fine pincet til forsigtigt fat fra sin kant ene dækglas indeholder celle suspension. Vip dæksletglide 45 °, og lade det overskydende buffer til afstrømning. Placer dækglasset oven på gummipakningen med cellerne på toppen af dækglasset, og samle kammeret (figur 2A og 2B).
3. Fastgør perfusionskammeret på scenen og indsæt slangen som indeholder buffer ind i den første indløb af kammeret (Figur 2C). Vend sprøjten indeholdende buffer og lad buffer til perfundere over hele overfladen af ​​dækglasset. Når bufferen har nået den modsatte ende af kammeret, indsætte en vakuumledning i vakuum indløb. Indsæt øvrige rør (indeholdende agonist, inhibitorer, osv.) i deres passende position langs kammeret.
4. Visualisere celler ved hjælp af enten en 200X eller 400X, 1,4 numeriske åbning objektiv og en argon laser til ophidse Fluo-04:00 farvestof ved en bølgelængde på 488 nm (figur 1A, nederst). Strømindstillingerne af laseren bør justeres således, at fotomultiplikatorrør (PMT) Ikke mættet af det udsendte lys. Desuden skal spændingen over PMT kan optimeres til maksimal lysdetektion.
5. Lang pass emission signaler> 515 nm skal afhentes på frame hastigheder på 2-5 sek / ramme til at visualisere langsomme oscillerende mønstre og 0,2-0,3 sec / ramme til at visualisere hurtigere, globale calcium bølger (figur 3 og 4).
6. Efter billeddannelse er færdig, skal du lukke sprøjter og fjerne alle rør. Skil kammeret og gentag trin 2,2-2,4.
7. Indsamle data som numeriske værdier af fluorescens-intensiteten over tid og overførsel til Image J (softwarepakke leveres som freeware af National Institutes of Health, og kan findes på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
8. Se realtid cellulære billeder og identificere områder af interesse (ROIs, dvs apikale, basolateral, atomkraft osv.)
9. Anskaf fluorescensintensiteterne for disse ROIs og represent som fluorescensintensitet / baseline fluorescensintensitet (dvs. F/F0).
10. Generer tracings ved at plotte F / F ₀ vs tid. Ud over tracings er repræsentative billederne almindeligt forekommende og vises ved hjælp af pseudo.

3.. Udarbejdelse af pancreas acinarceller for celleskade Analyser

1. Warm DMEM F-12 medier (uden phenolrødt) til 37 ° C.
2. Tilføj BSA (0,1% vægt / volumen endelig), og HCI (50 uM endelig) til DMEM F-12 medier.
3. Portion 50 ml DMEM i en konisk rør.
4. Forbered en collagenasepuffer ved tilsætning af 0,5 mg / ml (12 U / ml) af collagenase type IV til 10 ml suppleret DMEM F-12 medier.
5. Afliv en mus ved CO ₂ kvælning. Orient dyret i liggende stilling, og forberede den abdominale overflade ved rengøring med 70% ethanol. Udfør en laparotomi at eksponere bughulen. Dissekere ud bugspytkirtlen og straks skylle i en lille vejebåd containing 6 ml collagenasepuffer.
6. Hakke vævet med fine dissektion saks i 3-5 min, eller indtil den resulterende løsning forekommer jævnt fordelt.
7. Overfør det hakkede væv til en 125 ml Erlenmeyerkolbe med 5 ml yderligere collagenasepuffer, derefter sted i et 37 ° C vandbad med omrystning ved 90 rpm i 5 min.
8. Fjern fra shaker, tillade celler til kortvarigt bosætte og udveksling med 5 ml frisk collagenasepuffer. Inkubér derefter i yderligere 35 minutter i et 37 ° C vandbad med omrystning ved 90 rpm.
9. Energisk resuspenderes fordøje ved hjælp af en overførsel pipette indtil suspensionen virker homogen uden tydelige celleklumper. Derefter forsigtigt pipettere cellesuspensionen gennem en pre-våd nylonnet i en konisk kolbe.
10. Energisk pipettere yderligere 3 ml frisk DMEM F-12 medier (med collagenase) gennem masken, for at tvinge igennem de resterende celler.
11. Tilføje en anden 6-10 ml DMEM F-12 medier og enllow cellerne til at nøjes med 2-3 min. Gentag dette trin to gange, og supernatanten fjernes efter den sidste vask.
12. Tilføj frisk DMEM F-12 medier, cellerne, og plade 500 gl cellesuspension til hver brønd af en 48-brønds plade til vævsdyrkning. Cellerne bør ligne dem afbildet i figur 1B.
13. Lad pladen sidde i et 37 ° C vandbad ved 90 rpm i 5 minutter før tilsætning af agonister.
14. Stimulere cellerne med varierende agonister for 2-4 timer.
15. Vip pladen i en vinkel for at tillade cellerne at afvikle og omhyggeligt pipetteres ud en portion af medier (sædvanligvis 100 ul) og flash fryse i flydende nitrogen.
16. Flash fryse den resterende cellesuspension. Lynfrysning er ikke afgørende for LDH målinger. Som et alternativ prøver kan opbevares på is, hvis de vil blive analyseret samme dag eller opbevaret i -20 ° C til langtidsopbevaring.

4.. Måling Lactatdehydrogenase Lækage

1. Opløs LDH substrat (der er forudsat i sættet) med 12 ml assay buffer (også).
2. Tø frosne cellesuspension og medier prøver i et vandbad ved stuetemperatur.
3. Plade 50 ul af hver medier prøve i en 96-brønds plade.
4. Til cellesuspensionen, det nødvendige volumen af ​​10X lysepuffer tilføje således at den endelige koncentration er 1X. Vortexes kort og inkuber ved 37 ° C i 60 min.
5. Centrifuger lyserede prøver ved 250 xg i 4 min for at pelletere cellerester.
6. For cellelysater. Pladen 50 ul af en 1:10 fortynding i hver brønd på en plade med 96 brønde
7. Der tilsættes 50 ul af rekonstitueret substrat til hver brønd, inkuberes pladen i mørke ved stuetemperatur i 30 min.
8. Reaktionen standses vedtilsætning af 50 ul af stop-opløsning (følger med kittet) til hver brønd.
9. Mål absorbans ved 490 nm.
10. Brug følgende formler til at beregne% LDH lækage. De optiske densiteter nedenfor er korrigeret ved at fratrække en blank OD aflæsning fra en brønd indeholdende kun PBS, substrat og stopopløsning.

LDH i medierne = (Media OD492) x (media fortyndingsfaktor) x (vol. af medier) * Da det er normalt ikke nødvendigt at fortynde medieprøver, fortyndingsfaktoren oftest equal1.

Samlet LDH = ((Lysate OD ₄₉₀₎ x (lysat fortyndingsfaktor) x (vol. i celle suspension)) + ((Media OD ₄₉₀₎ x (fortyndingsfaktor) x (vol. af medier alikvoteret for prøveudtagning))

5.. Inficerer Pancreas acinarceller med Adenovirus

1. Forberedpancreas acinarceller som beskrevet i § 3. Stk.
2. Efter trin 3.12, 10 ⁷ infektiøse enheder (IFUs) af adenovirus føje til cellesuspensionen og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
3. Jævnt plade 2 ml cellesuspension i en 6-brønds plade.
4. For de fleste ekspressionskonstrukter bør celler være tilstrækkeligt smittet inden for 18 timer, og for nogle luciferase konstruktioner, lige inden 6 timer.

Representative Results

Et eksempel på acinar celle calcium målinger i respons på fysiologiske stimuli er tilvejebragt i figur 3.. Acinuscellerne blev fyldt med calcium farvestof Fluo-4 og perfunderet med acetylcholin analog carbachol (CCh, 1 uM)) ^8. Celler reagerede i form af et calcium-bølge, som initierer i den apikale region og forplanter til den basolaterale region ^3,9. Repræsentative kurver er vist i figur 3B viser den typiske top-plateau mønster almindeligvis observeret med 1 uM carbachol. Omvendt, ved hjælp af sub-maksimale doser af cholecystokinin analoge caerulein (22:00) giver oscillerende calcium reaktioner (figur 4) ^10.

Lækage af LDH fra acinar celler i respons på pancreatitis-fremkaldende agonister er vist i fig. 5. Her viser vi koncentrations-afhængige stigninger i LDH lækage i nærværelse af caerulein, carbachol, eller than galdesyre taurolithocholsyre syre-3-sulfat (TLCS). Koncentrationerne er nødvendige for at fremkalde maksimal udsivning af LDH er i overensstemmelse med dem, der kræves for at inducere intra-acinært protease aktivering og patologiske calcium signalering, hvilket tyder disse begivenheder kan føre til skade.

Acinar celler blev inficeret med en luciferase reporter adenovirus, der er drevet af promotoren for en nedstrøms Cn effektor, nuklear faktor af aktiverede T-celler (NFAT, figur 6A). Vi giver repræsentative data validering vores infektion metode, der viser koncentration-og tidsafhængig stigninger i NFAT-luciferaseaktiviteten i nærværelse af TLCS (figur 6B og 6C).

Figur 1. Repræsentative billeder af pancreas acinarceller folgende forskellige præparater. (A) acinuscellerne forberedt til ^{Ca2 +-målinger,} som visualiseret ved 630X forstørrelse. Øverste række viser lysfeltmikroskopi, nederste række afbilder acinuscellerne ladet med ^{Ca2 +} farvestof Fluo-4 og visualiseret ved hjælp af fluorescensmikroskopi. (B) acinuscellerne forberedt til cytotoksicitetsassays, som visualiseret ved 400X forstørrelse.

Figur 2. . Den perifusion kammer (A) Kammeret består af tre lag:. En metal base, en gummipakning og et plastdæksel (B) Gummipakningen er placeret på toppen af metal base og en 22x22 mm dækglas indeholdende celler er placeret opad på toppen af ​​gummipakning. Dækplasten skrues til metallet base og en 18x18 mm dækglas placeres på toppen. (C) Kammeret er derefterfastgjort til mikroskopet scenen. Tubing indeholdende puffer eller agonist, føres ind indløb placeret på kammerets kant (pil). Separat slange fører til en vakuum (pilespids).

Figur 3. En typisk top-plateau calcium signal ved stimulering med carbachol (1 uM). (A) Fra venstre til højre, Bright felt visning af en acinus mærket på (A) Pical og (B) asolateral regioner af interesse fra en acinar celle. Celler blev fyldt med calcium-indikator Fluo-4 (5 uM). Ved stimulering med fysiologisk carbachol (1 uM, Ach analoge), viser efterfølgende billeder indledningen af calcium signal i den apikale region efterfulgt af formering i de basale region (B) Hver paneler billede (1-4), svarer til en ramme. langs en repræsentant sporing af forandringer i fluorescens over tid for hver region af interesse. Billederne errepræsenteret i pseudo med en farveskala (nederst til højre). Venstre og højre pile viser tidspunkt for første calcium stigning i apikale og basale områder, hhv. Dette tal blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. (Orabi AI, Shah AU, Muili K., Luo Y., Mahmood SM, Ahmad A., Reed A., Husain SZ Ethanol øger carbachol-induceret protease aktivering og accelererer calcium bølger i isolerede rotte pancreas acini. The Journal of Biological Chemistry , 2 86, 14.090-14.097 (2011)).

Figur 4.. En typisk calcium svingning ved stimulering caerulein (22:00). (A) Ændringer i helcelle cytosolisk calcium blev målt en gang per sekund ved time-lapse konfokal mikroskopi under anvendelse af calciumphosphat farvestof Fluo-4 / AM. Billeder er repræsenteret i pseudo med en farve sCale (øverst til højre). (B) repræsentant plot af fluorescens over tid blev registreret fra en enkelt celle behandlet med caerulein (10:00) ved pH 7,4. Dette tal blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. (Reed AM, Husain SZ, Thrower E., Alexandre M., Shah A., Gorelick FS, Nathanson MH Low Extracellular pH inducerer Skader i bugspytkirtlen Acinar Cell ved at øge Calcium signalering Journal of Biological Chemistry, 286, 1919-1926 ( 2011)).

Figur 5. Målecelle skade ved acinære celler behandlet med forskellige pancreatitis-fremkaldende agonister. I isolerede acinarceller blev laktat dehydrogenase (LDH) udsivning bruges som en biochemical indikator for skade. Isolerede acinar celler blev behandlet med varierende koncentrationer af (A) caerulein (1-100 nM) (B) carbachol (1 uM -1 mM) og (C) TLCS (50-500 uM), og% LDH lækage blev målt efter 2 time. (N = 3). #, *, P <0,05 sammenlignet med kontrollen og TLCS alene hhv.

Figur 6.. Måling luciferaseaktivitet i pancreas acinare celler inficeret med adeno-NFAT-luciferase. (A) Skema for infektion af primære muse pankreatiske acinarceller med adenoviral NFAT-luciferase. (B) Administration af TLCS (5-500 uM) induceret NFAT-luciferaseaktivitet. (C) Tidsforløb viser akkumulering af luminescens med TLCS (500 gm) givet over en 6hr periode. (N = 3). *, #, P <0,05, i forhold til kontrolgruppen eller TLCS alene hhv.

Discussion

Cellen isolation metode og de efterfølgende analyser afbildet her, udgør stærke redskaber til at studere de fysiologiske og patofysiologiske funktioner i eksokrine pancreas. Fremgangsmåden til isolering dispergerede pancreas acinarceller blev først beskrevet af Amsterdam og Jamieson i 1972 ^11. De metoder, der præsenteres her, er blevet tilpasset fra nyere isolation beskrevet af Van Acker og kolleger ^12. Selv om disse teknikker er meget reproducerbar og let lært, at der er flere kritiske funktioner til hver metode der skal udføres præcist. Forståelsen af ​​disse tekniske detaljer vil give mulighed for lettere fejlfinding og bedre anvendelse.

Ved udarbejdelsen af ​​celler til calcium målinger, har vi fundet, at bugspytkirtlen fra yngre gnavere giver mere ensartede resultater. De acini er mere jævnt fordelt, muligvis fordi de indeholder mindre fibro-fedtvæv. For Ca ^{2 +} målinger vi forbereder mindre acini for optimal single cell imaging. Dette kræver et højere collagenase koncentration (1,1 mg / ml eller 200 U / ml) end den, der anvendes til LDH målinger. For LDH målinger, forberede vi større acini fordi denne metode medfører mindre skade ved baseline. Fremstillingen modtager derfor en lavere collagenase koncentration (0,5 mg / ml eller 91 U / ml).

For Ca ^{2 +-målinger,} er det afgørende, at cellerne udplades på afsyret dækglas. Formålet med syre-vask er at tilvejebringe en ren overflade samt elektrostatiske interaktioner, der vil give maksimal vedhæftning af acini. Celle Tak (BD Bioscience) kan anvendes i stedet for eller som supplement til denne metode. Derudover er det kritisk, at ^{Ca2 +} farvestof er lagt i en BSA-fri inkubationspuffer i rækkefølge (1) for at forhindre farvestof fra binding til BSA og (2) at tillade acini til maksimalt overholde de afsyrede dækglas .

t "> Perfusionen beskrevne Kammeret blev specialdesignede. Kommercielle kamre og flowsystemer, er dog tilgængelige via Warner Instruments. Ud over perfusionen er at oprette en ordentligt reguleret vakuum en kritisk faktor i forebyggelsen acinarceller bliver suget væk fra dækglasset.

Ved måling calcium signaler fra pankreatiske acinarceller, vi beskriver anvendelse af et konfokalt mikroskop. Konfokal billeddannelse bruger et pinhole foran et fotomultiplikatorrør for at eliminere lys fra oven eller under brændplanet. I modsætning hertil detekterer bredt synsfelt billeddannende lys hele excitation stien af prøven, som tillader ud af fokus lys (dvs. lys over og under den ønskede fokusplanet) at forurene fluorescens billede af prøven. Fordelen ved konfokal mikroskopi i bredt felt er, at det giver mulighed for tynd-sektion billeddannelse af en prøve, samt 3D rekonstruktion af optiske skiver indsamlet langsen Z-akse. Desuden giver konfokal mikroskopi high-speed indsamlingssystemer, der kan fange hurtige ændringer i calcium fluorescens ved hjælp af en roterende disk, line scanner, sweptfield scanner eller endda indsnævret regioner fra et punkt scanner.

Rumlige og tidsmæssige ændringer i calcium signalering mønstre såsom bølger og svingninger, henholdsvis, kan måles pålideligt ved hjælp af F / F ₀ beregning, men dette er ikke en sand indikator for ^{[Ca2 +].} Kvantitative målinger af ^{[Ca2 +]} kan beregnes ved hjælp af enkelt bølgelængde excitation og emission calcium farvestoffer, såsom Fluo-4, selvom fejl kan forekomme i disse målinger grund fotoblegning og farvestof tab ^{13,14. [Ca2 +]} kan måles mere nøjagtigt ved hjælp af ratiometrisk farvestoffer, såsom fura2 eller Indo1 ^15, men dette er upraktisk på de fleste konfokale mikroskoper grund af kravet om en UV laser excitation. På den anden side, concomitant brug af Fluo-3 eller Fluo-4 og Fura-Red kan tillade forholdet billeddannelse vha. 488 nm excitation linje, der er til stede på de fleste konfokale mikroskoper ^16.

LDH lækage er et følsomt værktøj til måling acinært celleskade ^7,17. En anden supplerende metode er propidiumiodid optagelse ^18. Adenovirus infektioner opnår høje infektion satser i dyrkede acini ^19.. Koncentrationen af ​​virus kan være nødvendigt at titreres. Desuden er det nyttigt at tilvejebringe sammenlignelige kontrolforanstaltninger forhold, hvor en anden irrelevante adenovirale konstruktion også inficeret. De fleste af vores infektionsundersøgelser sidste for under 12 timer. Men for længere perioder, kan antibiotika sættes til DMEM-F12 medier i starten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 um pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110