Summary
Wir beschreiben ein reproduzierbares Verfahren zur Herstellung von Maus Azinuszellen des Pankreas von einer Maus für die Zwecke der Prüfung Azinuszelltumoren Calcium-Signale und zelluläre Schädigung mit physiologisch und pathologisch relevanten Reize. Verfahren für die adenovirale Infektion dieser Zellen wird ebenfalls bereitgestellt.
Abstract
Das Pankreas Azinuszelltumoren ist die wichtigste Parenchymzelle des exokrinen Pankreas und spielt eine führende Rolle bei der Sekretion von Pankreas-Enzyme in den Pankreasgang. Es ist auch der Ort für die Einleitung der Pankreatitis. Hier beschreiben wir, wie Azinuszellen isoliert werden aus ganzen Pankreasgewebe und intrazellulären Calcium-Signale werden gemessen. Darüber hinaus beschreiben wir die Techniken der Transfektion dieser Zellen mit adenoviralen Konstrukte und anschließend Messung der Leckage von Laktat-Dehydrogenase, ein Marker der Zellschädigung, während die Bedingungen Azinuszelltumoren Verletzungen in vitro zu induzieren. Diese Techniken bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um Azinuszelltumoren Physiologie und Pathologie zu charakterisieren.
Introduction
Dynamische Veränderungen in zytosolischen Kalzium sind notwendig sowohl für physiologische und pathologische Azinuszelltumoren Veranstaltungen. Diese unterschiedlichen Effekte von Calcium werden gedacht, um aus unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Muster der Calcium-Signalgebung 1 führen. Zum Beispiel werden Enzym und Sekretion aus der Azinuszelltumoren Calcium Spikes aus einem begrenzten Bereich des apikalen Pol, wo Sekretion erfolgt 2 verbunden. Im Gegensatz dazu ist ein globales Calcium Welle durch intensive nicht-oszillierende Kalzium-Signale verfolgt mit frühen pathologischen Ereignissen, die zu einer akuten Pankreatitis führen 3,4 zugeordnet. Dazu gehören intra-acinar Proteaseaktivierung, reduzierte Enzym-Sekretion und Azinuszelltumoren Verletzungen. Unser Labor verwendet isoliert Pankreasazini diese frühen pathologischen Ereignissen, die Krankheit sowohl in vivo und in vitro 5-7 führen zu studieren. Die Methoden detailliert beschreiben Isolierung von primären Azinuszellen zum Zweck der Messung cytosolic Kalziumspiegel und Zellschäden. Verfahren für die adenovirale Infektion dieser Zellen wird ebenfalls bereitgestellt.
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Protocol
1. Vorbereiten Azinuszellen des Pankreas für Calcium Imaging
- Bereiten HEPES Inkubationspuffer enthaltend 20 mM HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1,3 mM CaCl 2, 10 mM Glucose, 2 mM Glutamin und 1 × Minimum Eagle-Medium nicht-essentiellen Aminosäuren. Stellen Sie die endgültige Lösung auf pH 7,4 mit NaOH.
- Vorbereiten einer BSA Inkubationspuffer indem BSA (1% w / v Endkonzentration) unter 25 ml HEPES Inkubationspuffer (oben beschrieben).
- Vorbereiten einer Collagenaseverdau Puffer durch Zugabe von 1,1 mg / ml (200 Einheiten / ml) Typ-4-Kollagenase und 1 mg / ml Sojabohnen-Trypsininhibitor bis 6 ml BSA Inkubationspuffer (oben beschrieben).
- Acid-Wash 22x22 mm Deckgläser durch Eintauchen in zwei Teile HNO 3 und einem Teil HCl für 2 Stunden. Dann dekantiert mit DI-Wasser und Speicher in 70% Ethanol.
- Euthanize eine Maus durch CO 2-Erstickung. Orient das Tier in Rückenlage, und bereiten die Bauchdecke von cleAning mit 70% Ethanol. Führen Sie eine Laparotomie, um die Bauchhöhle aussetzen. Präparieren Sie sich die Bauchspeicheldrüse und sofort in einem kleinen Boot wiegen mit 6 ml Kollagenaseverdau Puffer spülen.
- Sezieren entfernt alle große Stücke von Fett oder sichtbare Blutgefäße, entfernen Sie dann 5 ml Kollagenaseverdau Puffer und fügen Sie es zurück in die 15 ml konischen Röhrchen.
- Mit feinen Sezierung Schere zerkleinern die Bauchspeicheldrüse in dem kleinen Boot mit einem Gewicht, das 1 ml Kollagenaseverdau Puffer. Mince bis die resultierende Lösung erscheint gleichmäßig verteilt.
- Übertragen Sie das Hackfleisch Produkt einem 125 ml Erlenmeyer Plastikflasche, und fügen Sie die restlichen 5 ml Kollagenaseverdau Puffer zum Container. Stellen Sie sicher, das Gewebe vollständig in Puffer getaucht.
- Der Kolben wird in einem 37 ° C warmen Wasserbad und schütteln bei 90 rpm für 30 min. Während dieser kurzen Zeit von Ausfallzeiten, bereiten Calcium aktivierenden Agonisten (zB Caerulein, Carbachol) und spülen Sie die 22x22 mm acid-washed Abdeckungrutscht mit DI-Wasser. Trockene, und legen Sie dann oben auf eine ebene Fläche von Labor Film ausgekleidet.
- Nach Ablauf der 30 min Digest abgeschlossen ist, überführt die Suspension zurück zu dem 15 ml konischen Röhrchen und damit die Zellen zu begleichen. Beim Pipettieren das Kollagenaseverdau Puffer und ersetzen mit 6 ml BSA Inkubationspuffer. Kräftig schütteln Rohr von Hand für 10 Sekunden, um die Zellen in kleinere Cluster zu dispergieren. Unmittelbar nach Schütteln entfernen großen, Treibgut aus den unruhigen Medien.
- Lassen Sie die übrigen Zellen zu regeln, und tauschen Sie die Medien mit frischen BSA Inkubationspuffer.
- Wiederholen Sie Schritt 1.11 zweimal, bis die Suspension von nur kleinen Clustern, die nur fein mit bloßem Auge besteht. Die Zellen sollten die in Abbildung 1A (obere Reihe) dargestellt ähneln.
- Entfernen Sie die BSA Inkubationspuffer und ersetzen mit HEPES Inkubationspuffer.
- Bereiten Sie eine 750 pM, 100X Lager von Fluo-04.00 in 10% DMSO.
- Legen Sie die Zellen in der 15 ml konischen Röhrchen mit der Zellsuspension und BSA-freien HEPES Inkubationspuffer. Um dies zu tun, fügen Sie ein geeignetes Volumen (1:100 Verdünnung) der Stammlösung zu der Zellsuspension. Dann die Platte 500 ul dieser Suspension auf jeden 22x22 mm Deckglas.
- Halten Deckgläser im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nehmen Sie die erste Ca 2 +-Messungen 30 min nach der Belastung. Der Farbstoff wird automatisch von dem Medium bei Beginn der Perfusion, die 30 min nach Farbstoffbeladung auftreten sollte entfernt.
2. Mess-Calcium in Azinuszellen des Pankreas
- Spülen jedes Perfusion Aufbau mit entionisiertem Wasser füllen und mit einer geeigneten Menge von Puffer oder Agonisten. Prime jede Spritze mit Puffer oder Agonisten zur richtigen Fluss zu versichern. Clamp Spritzen zu einem Ring stehen etwa 1-2 Meter über dem Mikroskop Bühne.
- Verwenden feinen Pinzette vorsichtig aus seinem Rand ein Deckglas haltige Zellsuspension zu erreichen. Kippen Sie die Abdeckungrutschen 45 °, und lassen Sie das überschüssige Puffer ablaufen. Legen Sie das Deckglas auf der Gummidichtung mit den Zellen auf der Oberseite des Deckglases, und montieren Sie die Kammer (2A und 2B).
- Sichern Sie die Perfusionskammer auf die Bühne und legen Sie den Schlauch, die Puffer enthält in den ersten Einlass der Kammer (Abbildung 2C). Drehen Sie die Spritze mit Puffer auf und lassen Sie den Puffer auf perfundieren über die gesamte Oberfläche des Deckglases. Sobald der Puffer das entgegengesetzte Ende der Kammer erreicht hat, legen Sie eine Saugleitung in das Vakuum Einlass. Legen Sie keine anderen Rohre (mit Agonisten, Inhibitoren, etc.) in die entsprechende Position entlang der Kammer.
- Visualisieren der Zellen entweder mit einem 200X oder 400X, 1,4 numerische Apertur Ziel und einen Argon-Laser, um die Fluo-4.00 Farbstoff bei einer Wellenlänge von 488 nm (1A, unten) zu erregen. Die Leistungseinstellung des Lasers sollte so eingestellt werden, daß die Photovervielfacherröhre (PMT) Nicht durch das emittierte Licht gesättigt. Darüber hinaus muss die Spannung über der PMT, um eine maximale Lichterfassungseinrichtung optimiert werden.
- Langpaß Sendesignale von> 515 nm bei Frameraten von 2-5 gesammelt sec / Rahmen zur Visualisierung langsam oszillierenden Muster und 0,2-0,3 sec / Rahmen zur Visualisierung schneller, global Calcium Wellen (3 und 4).
- Nach der Bebilderung abgeschlossen ist, schließen Sie die Spritzen und entfernen Sie alle Schläuche. Demontieren Sie die Kammer und wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.4.
- Sammeln von Daten als numerische Werte der Fluoreszenzintensität über die Zeit und Transfer zum Bild J (Software als Freeware von den National Institutes of Health und finden Sie unter http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
- Echtzeit-Anzeige von Bildern und zellulären identifizieren regions of interest (ROIs, dh apikal, basolateral, Kernenergie, etc.)
- Erwerben Fluoreszenzintensitäten für diese ROIs und represent als Fluoreszenzintensität / Fluoreszenzbasismesswert Intensität (dh F/F0).
- Generieren Kurven durch Auftragen F / F 0 vs Zeit. Neben Kurven sind repräsentative Bilder allgemein vorgesehen und angezeigt Pseudocolor.
3. Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für Zellschädigung Assays
- Warm DMEM F-12 Medium (ohne Phenolrot) bis 37 ° C.
- In BSA (0,1% w / v final) und HCl (50 uM endgültig) DMEM F-12 Medien.
- Aliquot 50 ml DMEM in einem konischen Rohr.
- Vorbereiten einer Kollagenase-Puffer durch Zugabe von 0,5 mg / ml (12 U / ml) von Collagenase Typ IV bis 10 ml DMEM ergänzt F-12 Medien.
- Euthanize eine Maus durch CO 2-Erstickung. Orient das Tier in Rückenlage, und bereiten Sie die Bauch-Oberfläche durch die Reinigung mit 70% Ethanol. Führen Sie eine Laparotomie, um die Bauchhöhle aussetzen. Präparieren Sie sich die Bauchspeicheldrüse und sofort in einem kleinen Boot mit einem Gewicht von c spülenontaining 6 ml Kollagenase-Puffer.
- Mince das Gewebe mit feinen Sezierung Schere für 3-5 min oder bis die resultierende Lösung erscheint gleichmäßig verteilt.
- Übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in einen 125 ml Erlenmeyerkolben mit 5 ml Kollagenase zusätzliche Puffer und anschließend in einem 37 ° C Wasserbad unter Schütteln bei 90 rpm für 5 min.
- Entfernen Sie aus dem Shaker, erlauben Zellen kurz absetzen, und der Austausch mit 5 ml frischem Kollagenase-Puffer. Dann für weitere 35 min in einem 37 ° C Wasserbad unter Schütteln bei 90 Upm inkubiert.
- Energisch resuspendieren Digest mit einem Transferpipette bis die Suspension erscheint ohne offensichtliche Zellklumpen homogen. Dann vorsichtig pipettieren die Zellsuspension durch eine vorbefeuchtenden Nylon-Mesh in einen Erlenmeyerkolben.
- Kräftig pipettieren weitere 3 ml frisches DMEM F-12 Medium (mit Kollagenase) durch das Gitter, um durch alle übrigen Zellen zu erzwingen.
- Hinzufügen 6-10 ml DMEM F-12 Medien und einellow die Zellen für 2-3 min zu begleichen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, und entfernen Sie den Überstand nach dem letzten Waschen.
- In frischem DMEM F-12 Medien, werden die Zellen, und die Platte 500 ul Zellsuspension in jede Vertiefung einer 48-well Gewebekulturplatte. Die Zellen sollten die in Abbildung 1B dargestellt ähneln.
- Die Platte wird in einem 37 ° C Wasserbad bei 90 UpM für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, bevor Agonisten.
- Stimulieren Sie die Zellen mit unterschiedlichen Agonisten für 2-4 Std.
- Kippen Sie die Platte in einem Winkel, damit die Zellen, sich niederzulassen und sorgfältig Pipette heraus ein Aliquot der Medien (in der Regel 100 ul) und Flash-freeze in flüssigem Stickstoff.
- Blitzeis die verbleibende Zellsuspension. Flash-Einfrieren ist nicht für LDH Messungen unerlässlich. Als Alternative können Proben auf Eis gehalten werden, wenn sie am gleichen Tag analysiert oder gespeichert werden in -20 ° C für die langfristige Lagerung.
4. Mess-Lactatdehydrogenase Leakage
- Den Inhalt der LDH Substrat (das ist im Kit enthalten) mit 12 ml Assay-Puffer (ebenfalls mitgeliefert).
- Auftauen Zellsuspension und Medien Proben in einem Wasserbad bei Raumtemperatur.
- Die Platte 50 ul jeder Medien Probe in einer 96-Well-Platte.
- Zu der Zellsuspension, fügen Sie das notwendige Volumen von 10X Lysepuffer so dass die endgültige Konzentration 1X. Vortex kurz und bei 37 ° C für 60 min.
- Zentrifuge lysierten Proben bei 250 xg für 4 min zur Pelletierung Zelltrümmer.
- Für Zelllysaten Platte 50 ul einer Verdünnung von 1:10 in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- In 50 ul des rekonstituierten Substrat in jede Vertiefung, bebrüten die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min.
- Stoppen der Reaktion durchZugabe von 50 ul der Stop-Lösung (im Kit enthalten) in jede Vertiefung.
- Messen Sie die Absorption bei 490 nm.
- Verwenden Sie die folgenden Formeln% LDH Leckage berechnen. Die optischen Dichten sind unten durch Subtraktion eine leere OD Lesung aus einem Brunnen, die nur PBS, Substrat korrigiert und Stop-Lösung.
LDH in media = (Medien OD492) x (Medien Verdünnungsfaktor) x (Bd. von Medien) * Da es in der Regel nicht erforderlich, Medien Proben zu verdünnen, der Verdünnungsfaktor wird meist equal1.
Insgesamt LDH = ((Lysate OD 490) x (Lysat Verdünnungsfaktor) x (Volumen in Zellsuspension)) + ((Media-OD 490) x (Verdünnungsfaktor) x (Volumen der Medien für die Probenahme aliquotiert))
5. Infizieren Azinuszellen des Pankreas mit Adenovirus
- BereitenAzinuszellen des Pankreas, wie in Kapitel 3 beschrieben.
- Nach Schritt 3.12, mit 10 7 infektiösen Einheiten (IFUs) von Adenovirus zu der Zellsuspension und Inkubation für 30 min bei 37 ° C
- Gleichmäßig Platte 2 ml Zellsuspension in einer 6-Well-Platte.
- Für die meisten Ausdruck Konstrukte sollten die Zellen ausreichend innerhalb von 18 Stunden infiziert werden, und für einige Luciferase Konstrukten, nur innerhalb von 6 Stunden.
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Representative Results
Ein Beispiel Azinuszelltumoren Calcium, welche in Reaktion auf physiologische Stimuli ist in 3 bereitgestellt. Acinar Zellen wurden mit dem Calcium geladen Farbstoff Fluo-4 und durchströmt mit dem Acetylcholin analogen Carbachol (CCH, 1 uM)) 8. Zellen reagierten in Form eines Calcium-Welle, die in dem apikalen Bereich initiiert und breitet sich zur basolateralen Bereich 3,9. Repräsentative Kurven in 3B gezeigt zeigen die typische Peak-Plateau-Muster häufig mit 1 uM Carbachol beobachtet. Umgekehrt mit sub-maximale Dosen des cholecystokinin analogen Caerulein (10.00) ergibt oszillierende Kalzium Antworten (Abbildung 4) 10.
Austritt von LDH aus acinärem Zellen in Reaktion auf Pankreatitis-induzierende Agonisten wird in Abbildung 5 dargestellt. Hier zeigen wir, konzentrationsabhängige Erhöhung der LDH Leckage in Gegenwart von Caerulein, Carbachol oder ter Gallensäure taurolithocholic Säure-3-Sulfat (TLCS). Die Konzentrationen erforderlich, um eine maximale Leckage von LDH induzieren stimmen mit denen erforderlich, um intra-acinar Proteaseaktivierung und pathologischen Kalzium-Regulation zu induzieren, was darauf hindeutet, diese Ereignisse können zu Verletzungen führen.
Acinar Zellen wurden mit einem Luciferase-Reporter-Adenovirus, das durch den Promotor für ein Downstream-Cn Effektor nuclear factor von aktivierten T-Zellen (; 6A NFAT) angetrieben wird infiziert. Wir stellen repräsentative Daten Validierung unserer infizieren, was zeigt, Konzentrations-und zeitabhängige Zunahme der NFAT-Luciferase-Aktivität in Gegenwart von TLCS (Fig. 6B und 6C).
Abbildung 1. Repräsentative Bilder von Pankreas-Azinuszellen folgenden verschiedenen Zubereitungen. (A) Azinuszellen für Ca 2 +-Messungen vorbereitet, als sichtbar bei 630X Vergrößerung. Obere Reihe zeigt Hellfeldmikroskopie, untere Reihe zeigt Azinuszellen mit dem Ca 2 +-Farbstoff Fluo-4 geladen und visualisiert mittels Fluoreszenzmikroskopie. (B) Azinuszellen für Zytotoxizitätsassays hergestellt, wie bei 400-facher Vergrößerung sichtbar.
Abbildung 2. . Perifusion Die Kammer (A) Die Kammer besteht aus drei Schichten:. Ein Metall Basis, eine Gummidichtung und eine Kunststoff-Abdeckung (B) Die Gummidichtung auf der Oberseite des Metall-Basis und einem 22x22 mm Deckglas enthaltenden Zellen platziert wird gelegt oben auf der Oberseite der Gummidichtung. Die Kunststoff-Abdeckung ist mit dem Sockel verschraubt Metall und einem 18x18 mm Deckglas wird auf die Spitze. (C) Die Kammer ist dannan dem Objekttisch. Schlauch, mit Puffer oder Agonist wird in Buchten auf der Kammer Kante (Pfeil) zugeführt. Separate Schlauch führt zu einem Vakuum (Pfeilspitze).
Abbildung 3. Eine typische Peak-Plateau Kalzium-Signal nach Stimulation mit Carbachol (1 uM). (A) Von links nach rechts; Hellfeld Ansicht eines acinus an der (A) pical etikettiert und (B) asolateral Regionen von Interesse aus einer Azinuszelltumoren. Die Zellen wurden mit dem Calcium-Indikator Fluo-4 (5 uM) geladen. Nach Stimulation mit physiologischen Carbachol (1 uM; Ach analog), zeigen nachfolgende Bilder die Einleitung des Calcium-Signal in der apikalen Region durch Vermehrung der basalen Region gefolgt (B) Jedes getäfelten Bild (1-4), an einem Rahmen entspricht. entlang einer repräsentativen Verfolgung der Änderung der Fluoreszenz mit der Zeit für jeden interessierenden Bereich. Bildervertreten in Pseudocolor mit einer Farbskala (unten rechts). Linke und rechte Pfeile zeigen Zeitpunkt der ersten Calcium-Anstieg in den apikalen und basalen Regionen, bzw.. Diese Figur wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. (Orabi AI, Shah AU, Muili K., Y. Luo, Mahmood SM, Ahmad A., A. Reed, Husain SZ Ethanol verbessert carbacholinduzierte Proteaseaktivierung und beschleunigt Kalziumwellen in isolierten Ratten Pankreasazini. The Journal of Biological Chemistry , 2 86, 14090-14097 (2011)).
Abbildung 4. Ein typischer Calcium-Oszillation nach Stimulation Caerulein (10 Uhr). (A) Veränderungen in ganzen Zellen zytosolische Calcium wurden einmal pro Sekunde durch Zeitraffer-konfokale Mikroskopie mit der Calcium-Farbstoff Fluo-4 AM / gemessen. Die Bilder werden in Pseudocolor mit einer Farbe dargestellt scale (oben rechts). (B) Repräsentative Grundstück von Fluoreszenz im Laufe der Zeit wurden aus einer einzigen Zelle mit Caerulein (10 Uhr) bei pH 7,4 behandelt aufgezeichnet. Diese Figur wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. (Reed AM, Husain SZ, Thrower E., Alexandre M., A. Shah, Gorelick FS, MH Nathanson Low extrazellulären pH induziert Schaden in der Bauchspeicheldrüsenkrebs Azinuszelltumoren durch Verbesserung der Calcium Signaling The Journal of Biological Chemistry, 286, 1919-1926 ( 2011)).
Abbildung 5. Messzelle Verletzung von Azinuszellen mit verschiedenen Pankreatitis-induzierende Agonisten behandelt. In isolierten Azinuszellen, Lactat-Dehydrogenase (LDH) Leckage wurde als bi verwendetochemical Indikator für Verletzungen. Isoliert acinar Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von (A) Caerulein (1-100 nM) (B) Carbachol (1 uM -1 mM) und (C) TLCS (50-500 um) und LDH% Leckage wurde nach 2 gemessen behandelt hr. (N = 3). #, * P <0,05 und die Steuer-und TLCS allein verglichen sind.
Abbildung 6. Messen Luciferaseaktivität in Pankreas-Azinuszellen mit Adeno-NFAT-Luciferase infiziert. (A) Schema für die Infektion von primären Maus Azinuszellen des Pankreas mit adenoviralen NFAT-Luciferase. (B) Verwaltung von TLCS (5-500 &mgr; M) induzierte NFAT-Luciferase-Aktivität. (C) Zeitverlauf zeigt Anhäufung von Lumineszenz mit TLCS (500 pM) über eine 6 gegebenStunden-Zeitraum. (N = 3). *, #, P <0,05, bezogen auf die Kontrolle oder TLCS allein sind.
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Discussion
Die Zelle Isolierung Verfahren und anschließende Tests hier dargestellten stellen leistungsfähige Werkzeuge, mit denen die physiologische und pathophysiologische Funktionen des exokrinen Pankreas zu studieren. Das Verfahren zur Isolierung verteilt Azinuszellen des Pankreas wurde erstmals von Amsterdam und Jamieson 1972 11 beschrieben. Die hier vorgestellten Methoden aus neueren Methoden Isolierung von Van Acker und Kollegen 12 beschrieben angepasst wurden. Obwohl diese Techniken gut reproduzierbare und leicht erlernbar sind, gibt es mehrere wichtige Funktionen zu jedem Verfahren, die durchgeführt werden müssen präzise ausgeführt. Das Verständnis dieser technischen Details werden zur leichteren Fehlersuche und verbesserte Anwendung zu ermöglichen.
Bei der Herstellung der Zellen für die Calcium-Messungen haben wir festgestellt, dass die Bauchspeicheldrüse von jüngeren Nagetiere mehr konsistente Ergebnisse liefert. Die Acini sind gleichmäßiger verteilt, möglicherweise, weil sie weniger Fibro-Fettgewebe enthalten. Für Ca 2 +-Messungen, bereiten wir kleinere acini für optimale Single-Cell-Imaging. Dies erfordert eine höhere Konzentration Collagenase (1,1 mg / ml oder 200 U / ml) als die für LDH-Messungen verwendet. Für LDH-Messungen, bereiten wir größere acini da diese Methode verursacht weniger Verletzungen an der Grundlinie. Die Herstellung erhält also eine geringere Konzentration Collagenase (0,5 mg / ml oder 91 U / ml).
Für Ca 2 +-Messungen, ist es wichtig, dass die Zellen auf acid-washed Deckgläser plattiert werden. Der Zweck des Säure-waschen ist, um eine saubere Oberfläche und elektrostatische Wechselwirkungen, die eine maximale Haftung Acini ermöglichen bereitzustellen. Zelle Tak (BD Bioscience) können anstelle von oder zusätzlich zu diesem Verfahren verwendet werden. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Ca 2 +-Farbstoff in einem BSA-frei Inkubationspuffer, um (1) geladen wird, um den Farbstoff an der Bindung an BSA zu verhindern und (2) um die Acini bis maximal zu den Säure gewaschenen Deckgläschen haften .
t "> Die Perfusionskammer beschrieben wurde kundenspezifisch angefertigt. Gewerbe Kammern und Flow-Systeme sind aber durch Warner Instruments zur Verfügung. Neben der Perfusion, die Einrichtung eines ordnungsgemäß reguliert Vakuum ist ein kritischer Faktor bei der Verhinderung Azinuszellen davor aus der angesaugten Deckglas.Bei der Messung von Kalzium Signale von Azinuszellen des Pankreas, beschreiben wir die Verwendung eines konfokalen Mikroskops. Konfokales Abbildungssystem verwendet eine Lochblende vor einem Photomultiplier, um Licht von oberhalb oder unterhalb der Fokalebene zu beseitigen. Im Gegensatz dazu erkennt Weitfeld-Abbilden von Licht während der Anregung Weg der Probe, welche zum Beispiel der Fokus Licht (dh Licht oberhalb und unterhalb der gewünschten Fokusebene), um das Fluoreszenzbild der Probe kontaminieren. Der Vorteil der konfokalen Mikroskopie in großem Feld ist, dass sie für Dünnschicht-Abbildung einer Probe, sowie 3D-Rekonstruktion von optischen Scheiben gesammelt entlang erlaubteine Z-Achse. Darüber hinaus bietet der konfokalen Mikroskopie Hochgeschwindigkeits-Sammelsystem, die eine schnelle Änderung in Calcium-Fluoreszenz unter Verwendung einer sich drehenden Scheibe,-Scanner, Sweptfield Scanner oder sogar verengten Bereiche von einem Punkt Scanner erfassen kann.
Räumliche und zeitliche Änderungen der Kalzium-Signalgebung Muster wie Wellen und Schwingungen, bzw. verlässlich bewertet werden können mit der F / F 0 Berechnung, aber dies ist kein echter Indikator für [Ca 2 +]. Quantitative Messungen der [Ca 2 +] kann unter Verwendung einer einzelnen Wellenlänge Anregung und Emission Calcium Farbstoffe wie Fluo-4, obwohl Fehler in diesen Messungen durch Bleichen und Farbstoffverlust 13,14 auftreten können. [Ca 2 +] genauer mit ratiometrische Farbstoffe wie Fura2 oder Indo1 15 gemessen werden, dies ist jedoch unpraktisch meisten konfokale Mikroskope wegen des Erfordernisses eines UV-Lasers zur Anregung. Auf der anderen Seite, concomitant Verwendung von Fluo-3 oder Fluo-4 und Fura-Red erlauben können Ratio-Imaging mit der 488 nm Anregung Linie, die auf den meisten konfokalen Mikroskopen 16 ist.
LDH Leckage ist ein sensibles Instrument zur Messung Azinuszelltumoren Verletzung 7,17. Eine weitere Methode ist komplementär Propidiumiodid-Aufnahme 18. Adenovirus-Infektionen eine hohe Infektionsraten in kultivierten acini 19. Die Konzentration des Virus müssen titriert werden. Darüber hinaus ist es hilfreich, vergleichbar Steuerbedingungen in dem ein anderer irrelevant adenoviralen Konstrukts auch infiziert bereitzustellen. Die meisten unserer Infektionsstudien zuletzt für unter 12 Std. Jedoch für längere Zeit, können Antibiotika die DMEM-F12-Medium am Anfang hinzugefügt werden.
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Disclosures
Kein Interessenkonflikt erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem National Institutes of Health Grants DK083327 und DK093491 (bis SZH) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
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- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells. Embo J. 16, 242-251 (1997).
- Husain, S. Z., et al. The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).
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