Summary
हम physiologically और विकृतिविज्ञानी प्रासंगिक उत्तेजनाओं के साथ कोष्ठकी सेल कैल्शियम संकेतों और सेलुलर चोट की जांच करने के प्रयोजन के लिए एक माउस से माउस अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं की तैयारी की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन है. इन कोशिकाओं के adenoviral संक्रमण के लिए एक विधि को भी प्रदान की जाती है.
Abstract
अग्नाशय कोष्ठकी सेल बहि अग्न्याशय के मुख्य parenchymal सेल है और अग्नाशय वाहिनी में अग्नाशय एंजाइमों के स्राव में एक प्राथमिक भूमिका निभाता है. यह भी अग्नाशयशोथ की दीक्षा के लिए साइट है. यहाँ हम पूरे अग्न्याशय के ऊतकों और intracellular कैल्शियम संकेतों से कोष्ठकी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं वर्णन कैसे मापा जाता है. इसके अलावा, हम इन विट्रो में कोष्ठकी सेल चोट प्रेरित है कि शर्तों के दौरान, adenoviral निर्माणों के साथ इन कोशिकाओं transfecting, और बाद में लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज, सेल चोट के एक मार्कर के रिसाव को मापने की तकनीक का वर्णन है. इन तकनीकों में कोष्ठकी सेल फिजियोलॉजी और विकृति को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं.
Introduction
साइटोसोलिक कैल्शियम में गतिशील परिवर्तन शारीरिक और रोग दोनों कोष्ठकी सेल घटनाओं के लिए आवश्यक हैं. कैल्शियम की ये भिन्न प्रभाव 1 संकेतन कैल्शियम की अलग स्थानिक और लौकिक पैटर्न से परिणाम माना जाता है. उदाहरण के लिए, कोष्ठकी सेल से एंजाइम और तरल पदार्थ का स्राव स्राव जगह 2 लेता है जहां शिखर ध्रुव के एक प्रतिबंधित क्षेत्र से कैल्शियम spikes के लिए जुड़े हुए हैं. इसके विपरीत, तीव्र गैर oscillatory कैल्शियम संकेतों के बाद वैश्विक कैल्शियम लहर तीव्र pancreatitis 3,4 नेतृत्व करने के लिए जो जल्दी रोग की घटनाओं के साथ जुड़ा हुआ है. ये अंतर कोष्ठकी प्रोटीज सक्रियण, कम एंजाइम स्राव, और कोष्ठकी सेल चोट शामिल हैं. हमारी प्रयोगशाला vivo में और 5-7 इन विट्रो में दोनों रोग को जन्म दे जो इन जल्दी रोग की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अलग अग्नाशय acini का उपयोग करता है. यहाँ विस्तृत तरीकों cy मापने के उद्देश्य से प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं के अलगाव का वर्णनtosolic कैल्शियम का स्तर और सेल चोट. इन कोशिकाओं के adenoviral संक्रमण के लिए एक विधि को भी प्रदान की जाती है.
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Protocol
1. कैल्शियम इमेजिंग के लिए अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं की तैयारी
- 20 मिमी HEPES, 95 मिमी NaCl, 4.7 मिमी KCl, 0.6 मिमी 2 MgCl, 1.3 मिमी 2 CaCl, 10 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी glutamine, और 1 × न्यूनतम ईगल मध्यम गैर आवश्यक अमीनो एसिड युक्त HEPES के ऊष्मायन बफर तैयार. NaOH के साथ 7.4 पीएच के लिए अंतिम समाधान के लिए समायोजित करें.
- HEPES के ऊष्मायन बफर (ऊपर वर्णित) के 25 मिलीलीटर के लिए बीएसए (1% w / ध् अंतिम) जोड़कर एक बीएसए ऊष्मायन बफर तैयार.
- 1.1 मिलीग्राम / एमएल (/ 200 इकाइयों मिलीलीटर) टाइप -4 collagenase और 1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन trypsin अवरोध से 6 बीएसए ऊष्मायन बफर (ऊपर वर्णित) के मिलीलीटर जोड़कर एक collagenase पाचन बफर तैयार.
- दो भागों HNO 3 और 2 घंटे के लिए एक हिस्सा एचसीएल में डुबो कर एसिड धोने 22x22 मिमी coverslips. फिर 70% इथेनॉल में डि पानी और दुकान का उपयोग छानना.
- सीओ 2 asphyxiation द्वारा एक माउस euthanize. ओरिएंट लापरवाह स्थिति में पशु, और cle के द्वारा पेट की सतह तैयार70% इथेनॉल के साथ Aning. उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए एक laparotomy प्रदर्शन करना. अग्न्याशय काटना और तुरंत collagenase पाचन बफर के 6 मिलीग्राम से युक्त एक छोटा सा वजन नाव में कुल्ला.
- वसा या दिखाई रक्त वाहिकाओं के किसी भी बड़े टुकड़े दूर काटना, फिर collagenase पाचन बफर के 5 मिलीलीटर हटाने और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को वापस जोड़ने.
- ठीक विच्छेदन कैंची का प्रयोग collagenase पाचन बफर के 1 मिलीलीटर युक्त छोटे वजन नाव में अग्न्याशय कीमा. परिणामस्वरूप समाधान समान रूप से छितरी हुई दिखाई देती है जब तक क़ीमा.
- एक 125 मिलीलीटर Erlenmeyer प्लास्टिक कुप्पी कीमा उत्पाद स्थानांतरण, और कंटेनर को collagenase पाचन बफर के शेष 5 मिलीलीटर जोड़ें. ऊतक पूरी तरह से बफर में डूबे हुए है सुनिश्चित करें.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कुप्पी प्लेस और 30 मिनट के लिए 90 rpm पर हिला. डाउनटाइम की इस छोटी सी अवधि के दौरान, कैल्शियम सक्रिय एगोनिस्ट (जैसे caerulein, carbachol) तैयार करने और 22x22 मिमी एसिड धोया कवर कुल्लाडि पानी के साथ निकल जाता है. सूखी, और फिर प्रयोगशाला फिल्म से लाइन में खड़ा एक फ्लैट सतह के शीर्ष पर जगह है.
- 30 मिनट पचाने के पूरा होने पर, 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को वापस निलंबन हस्तांतरण और कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. ध्यान collagenase पाचन बफर बाहर पिपेट और बीएसए ऊष्मायन बफर के 6 मिलीलीटर के साथ बदलें. सख्ती छोटे समूहों में कोशिकाओं को फैलाने के क्रम में 10 सेकंड के लिए हाथ से ट्यूब हिला. तुरंत मिलाते पर, अस्थिर मीडिया से किसी भी बड़े, चल मलबे को हटा दें.
- शेष कोशिकाओं को व्यवस्थित, और ताजा बीएसए ऊष्मायन बफर के साथ मीडिया का आदान प्रदान करने की अनुमति दें.
- निलंबन नग्न आंखों के लिए ही पतले दिखाई दे रहे हैं जो केवल छोटे समूहों के शामिल है, जब तक दो बार 1.11 कदम दोहराएँ. कोशिकाओं चित्रा 1 ए (शीर्ष पंक्ति) में दर्शाया उन समान होना चाहिए.
- बीएसए ऊष्मायन बफर निकालें और HEPES के ऊष्मायन बफर के साथ बदलें.
- 10% DMSO में एक 750 माइक्रोन, Fluo-4:00 के 100X स्टॉक तैयार.
- सेल निलंबन और बीएसए से मुक्त HEPES के ऊष्मायन बफर युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं लोड. ऐसा करने के लिए, सेल निलंबन के शेयर समाधान का एक उचित मात्रा (1:100 कमजोर पड़ने) जोड़ें. प्रत्येक 22x22 मिमी coverslip पर इस निलंबन की फिर थाली 500 μl.
- कमरे के तापमान पर अंधेरे में coverslips रखें. पहले सीए 2 + माप लदान के बाद 30 मिनट ले लो. डाई स्वतः डाई लदान के बाद 30 मिनट हो जाना चाहिए जो छिड़काव, शुरू करने पर मध्यम से निकाल दिया जाता है.
2. अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं में कैल्शियम मापने
- डि पानी के साथ प्रत्येक छिड़काव सेट अप कुल्ला और बफर या एगोनिस्ट का एक उचित राशि के साथ भरें. उचित प्रवाह बीमा करने के लिए बफर या agonist के साथ प्रधानमंत्री प्रत्येक सिरिंज. एक अंगूठी के लिए सीरिंज दबाना खुर्दबीन मंच के ऊपर लगभग 1-2 फुट खड़े हो जाओ.
- ध्यान से इसके किनारे एक coverslip युक्त सेल निलंबन से काबू करने के लिए ठीक चिमटी का प्रयोग करें. कवर झुकाएँ45 ° पर्ची, और अतिरिक्त बफर बंद चलाने के लिए अनुमति देते हैं. Coverslip के शीर्ष पर कोशिकाओं के साथ रबर गैसकेट के शीर्ष पर coverslip, जगह और चैम्बर (आंकड़े 2A और 2 बी) को इकट्ठा करो.
- मंच पर छिड़काव चैम्बर सुरक्षित और चैम्बर (चित्रा -2) के पहले प्रवेश में बफर होता है जो टयूबिंग डालें. पर बफर युक्त सिरिंज मुड़ें और बफर coverslip की पूरी सतह पर छिड़कना करने के लिए अनुमति देते हैं. बफर चैम्बर के विपरीत अंत तक पहुँच गया है एक बार, वैक्यूम इनलेट में एक निर्वात लाइन डालने. चैम्बर के साथ उनके उचित स्थिति में किसी भी अन्य ट्यूब (युक्त एगोनिस्ट, अवरोधकों, आदि) डालें.
- 488 एनएम (चित्रा 1 ए, नीचे) की तरंग दैर्ध्य में Fluo-04:00 डाई उत्तेजित करने के लिए या तो एक 200X या 400X, 1.4 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य और एक आर्गन लेजर का उपयोग कोशिकाओं कल्पना. लेजर की शक्ति सेटिंग्स समायोजित किया जाना चाहिए कि इस तरह के photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) उत्सर्जित प्रकाश से संतृप्त नहीं है. इसके अलावा, पीएमटी में वोल्टेज अधिकतम प्रकाश का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- > 515 एनएम के लंबे पास उत्सर्जन संकेतों 2-5 की फ्रेम गति पर एकत्र कर रहे हैं सेक, तेजी से वैश्विक कैल्शियम तरंगों (आंकड़े 3 और 4) दृश्यमान करने के लिए धीमी गति से oscillatory पैटर्न और 0.2-0.3 सेकंड / फ्रेम दृश्यमान करने के लिए / फ्रेम.
- इमेजिंग के पूरा होने पर, सीरिंज को बंद करने और सभी ट्यूबिंग हटा दें. चैम्बर और दोहराने कदम 2.2-2.4 जुदा.
- छवि जम्मू के लिए समय और हस्तांतरण पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के संख्यात्मक मान (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा फ्रीवेयर के रूप में प्रदान की है और में पाया जा सकता है सॉफ्टवेयर पैकेज के रूप में डेटा ले लीजिए http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
- वास्तविक समय सेलुलर छवियों को देखने और हित के क्षेत्रों (ROIs, यानी नाभिकीय, basolateral, शिखर, आदि) की पहचान
- इन ROIs और अनुसंधान के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता मोलप्रतिदीप्ति तीव्रता / आधारभूत प्रतिदीप्ति तीव्रता (यानी F/F0) के रूप में epresent.
- एफ / एफ 0 बनाम साजिश रचने के ट्रेसिंग उत्पन्न समय. ट्रेसिंग के अलावा, प्रतिनिधि छवियों सामान्यतः प्रदान की और pseudocolor का उपयोग कर प्रदर्शित कर रहे हैं.
3. सेल चोट Assays के लिए अग्नाशय कोष्ठकी कक्ष की तैयारी
- गर्म DMEM एफ 12 मीडिया (फिनोल लाल) के बिना 37 डिग्री सेल्सियस
- DMEM के एफ -12 मीडिया को बीएसए (0.1% w / ध् अंतिम), और एचसीएल (50 माइक्रोन अंतिम) जोड़ें.
- एक शंक्वाकार ट्यूब में अशेष DMEM के 50 मिलीलीटर.
- पूरक DMEM के एफ -12 मीडिया के 10 मिलीलीटर के लिए collagenase प्रकार चतुर्थ के 0.5 मिलीग्राम / एमएल (12 यू / एमएल) जोड़कर एक collagenase बफर तैयार.
- सीओ 2 asphyxiation द्वारा एक माउस euthanize. ओरिएंट लापरवाह स्थिति में पशु, और 70% इथेनॉल के साथ सफाई से पेट की सतह तैयार करते हैं. उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए एक laparotomy प्रदर्शन करना. अग्न्याशय काटना और तुरंत एक छोटा सा वजन नाव ग में कुल्लाcollagenase बफर के 6 मिलीलीटर ontaining.
- 3-5 मिनट के लिए या जिसके परिणामस्वरूप समाधान समान रूप से छितरी हुई दिखाई देता है जब तक ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग ऊतक क़ीमा.
- 5 मिनट के लिए 90 rpm पर झटकों के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में अतिरिक्त collagenase बफर, तो जगह के 5 मिलीलीटर के साथ एक 125 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क को कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण.
- प्रकार के बरतन से निकालें, कोशिकाओं को संक्षेप में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं, और ताजा collagenase बफर के 5 मिलीलीटर के साथ विनिमय. फिर 90 rpm पर झटकों के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक अतिरिक्त 35 मिनट के लिए सेते हैं.
- निलंबन कोई स्पष्ट सेल clumps के साथ सजातीय प्रकट होता है जब तक सख्ती एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग पचाने resuspend. फिर धीरे एक शंक्वाकार फ्लास्क में एक पूर्व गीला नायलॉन जाल के माध्यम से सेल निलंबन विंदुक.
- सख्ती किसी भी शेष कोशिकाओं के माध्यम से बाध्य करने के लिए, जाल के माध्यम से ताजा DMEM एफ 12 मीडिया (collagenase के साथ) के एक अतिरिक्त 3 मिलीलीटर विंदुक.
- एक और 6-10 DMEM के एफ 12 मीडिया की मिलीलीटर और एक जोड़ें2-3 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए कोशिकाओं llow. दो बार इस चरण को दोहराएँ, और अंतिम धोने के बाद सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- एक 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में ताजा DMEM एफ 12 मीडिया, कोशिकाओं resuspend, और सेल निलंबन की थाली 500 μl जोड़ें. कोशिकाओं चित्रा 1 बी में दिखाया गया उन जैसे लगते हैं चाहिए.
- थाली एगोनिस्ट जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए 90 rpm पर एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बैठने की अनुमति दें.
- 2-4 घंटे के लिए agonists के साथ अलग कोशिकाओं को उत्तेजित.
- कोशिकाओं को व्यवस्थित करने और ध्यान से एक मीडिया की विभाज्य (आमतौर पर 100 μl) और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज बाहर पिपेट को अनुमति देने के लिए एक कोण पर थाली झुकाएँ.
- फ्लैश शेष सेल निलंबन फ्रीज. फ्लैश ठंड LDH मापन के लिए आवश्यक नहीं है. वे उसी दिन assayed या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जाएगा अगर एक वैकल्पिक नमूने बर्फ पर रखा जा सकता है.
4. लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिसाव मापने
- पुनर्गठित LDH सब्सट्रेट (किट में दिए गए) परख बफर के 12 मिलीलीटर के साथ (भी) प्रदान की.
- कमरे के तापमान पर एक पानी के स्नान में जमे हुए सेल निलंबन और मीडिया नमूने गला लें.
- एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक मीडिया नमूना की प्लेट 50 μl.
- अंतिम एकाग्रता 1X है कि इतनी सेल निलंबन के लिए, 10X lysis बफर की आवश्यक मात्रा में जोड़ें. 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर भंवर संक्षिप्त और सेते हैं.
- गोली सेल मलबे से 4 मिनट के लिए 250 XG पर lysed नमूने अपकेंद्रित्र.
- सेल lysates के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में एक 1:10 कमजोर पड़ने की थाली 50 μl.
- प्रत्येक अच्छी तरह से पुनर्गठन सब्सट्रेट के 50 μl जोड़ें, 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में थाली सेते हैं.
- द्वारा प्रतिक्रिया बंद करोप्रत्येक अच्छी तरह से बंद समाधान (किट में प्रदान की) का 50 μl जोड़ने.
- 490 एनएम पर absorbance के उपाय.
- % LDH रिसाव की गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें. नीचे ऑप्टिकल घनत्व एक अच्छी तरह से युक्त ही पीबीएस, सब्सट्रेट से एक खाली आयुध डिपो पढ़ने बाहर घटाकर सही, और एक बंद समाधान कर रहे हैं.
मीडिया = में LDH (मीडिया OD492) एक्स (मीडिया कमजोर पड़ने कारक) एक्स (मीडिया के खंड) यह मीडिया के नमूनों को कमजोर करने के लिए आमतौर पर अनावश्यक है के बाद *, कमजोर पड़ने कारक होगा सबसे अक्सर equal1.
कुल LDH = ((Lysate आयुध डिपो 490) एक्स (lysate कमजोर पड़ने कारक) एक्स (सेल निलंबन में खंड)) ((मीडिया आयुध डिपो 490) (x कमजोर पड़ने कारक) एक्स (नमूना लेने के लिए aliquoted मीडिया की Vol.))
5. एडिनोवायरस साथ अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं को संक्रमित
- तैयार करनाअग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं के रूप में धारा 3 में वर्णित है.
- कदम 3.12 के बाद, सेल निलंबन को adenovirus के 10 7 संक्रामक इकाइयों (IFUs) जोड़ने के लिए और 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- 6 अच्छी तरह से थाली में सेल निलंबन के समान रूप से थाली 2 मिलीलीटर.
- सबसे अभिव्यक्ति निर्माणों के लिए, कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से 18 घंटे के भीतर संक्रमित किया जाना चाहिए, और सिर्फ 6 घंटे के भीतर कुछ luciferase निर्माणों के लिए.
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Representative Results
शारीरिक उत्तेजनाओं के जवाब में कोष्ठकी सेल कैल्शियम माप का एक उदाहरण 3 चित्र में प्रदान की जाती है. कोष्ठकी कोशिकाओं कैल्शियम के साथ भरी हुई थी डाई Fluo 4 और acetylcholine अनुरूप carbachol (सीसीएच, 1 माइक्रोन) के साथ perfused) 8. कोशिकाओं के शिखर क्षेत्र में शुरू की और basolateral क्षेत्र 3,9 को प्रसारित जो एक कैल्शियम लहर के रूप में जवाब दिया. चित्रा 3 बी में दिखाया प्रतिनिधि ट्रेसिंग आमतौर पर 1 माइक्रोन carbachol के साथ मनाया ठेठ चोटी पठार पैटर्न प्रदर्शित करता है. इसके विपरीत, cholecystokinin अनुरूप caerulein (10 बजे) के उप अधिक से अधिक खुराक का उपयोग कर oscillatory कैल्शियम प्रतिक्रियाओं (चित्रा 4) 10 पैदावार.
अग्नाशयशोथ उत्प्रेरण एगोनिस्ट के जवाब में कोष्ठकी कोशिकाओं से LDH का रिसाव चित्रा 5 में दिखाया गया है. यहाँ हम caerulein, carbachol, या टी की उपस्थिति में LDH रिसाव में एकाग्रता पर निर्भर बढ़ जाती है का प्रदर्शनवह पित्त अम्ल taurolithocholic एसिड -3 सल्फेट (TLCS). LDH से अधिक से अधिक रिसाव को प्रेरित करने के लिए आवश्यक सांद्रता, अंतर कोष्ठकी प्रोटीज सक्रियण और वैकृत संकेत कैल्शियम के लिए प्रेरित करने की आवश्यकता है उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं कि इन घटनाओं का सुझाव चोट करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
कोष्ठकी कोशिकाओं को सक्रिय टी कोशिकाओं की एक बहाव Cn प्रेरक, परमाणु कारक (, चित्रा 6A NFAT) के प्रमोटर द्वारा संचालित है कि एक luciferase संवाददाता adenovirus, से संक्रमित थे. हम TLCS (आंकड़े 6B और 6C) की उपस्थिति में NFAT-luciferase गतिविधि में एकाग्रता और समय पर निर्भर बढ़ जाती है का प्रदर्शन, हमारे संक्रमण विधि मान्य प्रतिनिधि डेटा प्रदान करते हैं.
चित्रा 1. अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं की छवियों प्रतिनिधि folविभिन्न तैयारियों lowing. (ए) कोष्ठकी कोशिकाओं के रूप में 630X बढ़ाई कल्पना, सीए 2 + मापन के लिए तैयार किया. शीर्ष पंक्ति उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी दर्शाया गया है, नीचे पंक्ति सीए 2 + डाई Fluo 4 के साथ भरी हुई कोष्ठकी कोशिकाओं को दर्शाया गया है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना. (बी) कोष्ठकी कोशिकाओं के रूप में 400X बढ़ाई कल्पना, cytotoxicity assays के लिए तैयार है.
चित्रा 2. . perifusion कक्ष (ए) के चैम्बर में तीन परतें होती हैं:., एक रबर गैसकेट, एक धातु का आधार है और एक प्लास्टिक कवर (बी) रबर गैसकेट धातु आधार के ऊपर और कोशिकाओं को रखा गया है, जिसमें एक 22x22 मिमी coverslip पर रखा गया है रबर गैसकेट के शीर्ष पर ऊपर की तरफ. प्लास्टिक कवर धातु आधार को खराब कर दिया है और एक 18x18 मिमी coverslip शीर्ष पर रखा गया है. (सी) कक्ष तो हैखुर्दबीन मंच के लिए सुरक्षित. ट्यूबिंग, युक्त बफर या एगोनिस्ट, चैम्बर की बढ़त (तीर) पर स्थित inlets में खिलाया जाता है. अलग ट्यूबिंग एक निर्वात (तीर सिर) की ओर जाता है.
चित्रा 3. Carbachol (1 माइक्रोन) के साथ उत्तेजना पर एक ठेठ चोटी पठार कैल्शियम संकेत. . (ए) बाएँ से सही करने के लिए, एक (ए) Pical में लेबल बेरी और (बी) के एक कोष्ठकी सेल से ब्याज की asolateral क्षेत्रों के उज्ज्वल क्षेत्र दृश्य कोशिकाओं कैल्शियम सूचक Fluo 4 (5 माइक्रोन) के साथ भरी हुई थी. शारीरिक carbachol (1 माइक्रोन, Ach एनालॉग) के साथ उत्तेजना पर, बाद में छवियों बेसल क्षेत्र के लिए प्रचार के द्वारा पीछा शिखर क्षेत्र में कैल्शियम संकेत की दीक्षा दिखाने (बी) प्रत्येक पैनल वाली छवि (1-4), एक फ्रेम से मेल खाती है. ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की ट्रैकिंग एक प्रतिनिधि के साथ. छवियाँ हैंएक रंग पैमाने (नीचे सही) के साथ pseudocolor में प्रतिनिधित्व किया. बाएँ और दाएँ तीर क्रमश: शिखर और बेसल क्षेत्रों में पहले कैल्शियम उदय के समय दिखा. यह आंकड़ा मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था. (Orabi ऐ, शाह ए.यू., Muili कुमार, लुओ वाई, महमूद एसएम, अहमद ए, रीड ए, हुसैन SZ इथेनॉल carbachol प्रेरित प्रोटीज सक्रियण को बढ़ाता है और अलग चूहे अग्नाशय acini में कैल्शियम तरंगों accelerates. जैव रसायन विज्ञान के जर्नल , 2 86, 14090-14097 (2011)).
4 चित्रा. उत्तेजना caerulein (10 बजे). पर एक ठेठ कैल्शियम दोलन (ए) पूरे सेल साइटोसोलिक कैल्शियम में परिवर्तन डाई Fluo 4 / AM कैल्शियम का उपयोग करते समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रति सेकंड एक बार मापा गया. छवियाँ एक रंग के साथ pseudocolor में प्रतिनिधित्व कर रहे हैंयुक्ति (ऊपर दाएं). (बी) समय के साथ प्रतिदीप्ति के प्रतिनिधि साजिश 7.4 पीएच पर caerulein (10 बजे) के साथ इलाज के लिए एक एकल कोशिका से दर्ज किए गए. यह आंकड़ा मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था. (रीड हूँ, हुसैन SZ, प्रक्षेपक ई., एलेक्जेंडर एम, शाह ए, Gorelick एफएस, Nathanson महाराष्ट्र कम कोशिकी पीएच जैव रसायन विज्ञान के जर्नल, 286, 1919-1926 (संकेतन बढ़ाना कैल्शियम से अग्नाशय कोष्ठकी सेल में नुकसान लाती है 2011)).
चित्रा 5. विभिन्न अग्नाशयशोथ उत्प्रेरण agonists के साथ इलाज किया कोष्ठकी कोशिकाओं से सेल चोट मापने. पृथक कोष्ठकी कोशिकाओं में, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) रिसाव एक द्वि के रूप में इस्तेमाल किया गया थाचोट के ochemical सूचक. पृथक कोष्ठकी कोशिकाओं (ए) caerulein (1-100 एनएम) (बी) carbachol (1 माइक्रोन -1 मिमी) और (सी) TLCS (50-500 माइक्रोन), और% LDH रिसाव 2 के बाद मापा गया था के अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया घंटा. (एन = 3). # *, पी <0.05 क्रमशः, नियंत्रण और TLCS अकेले की तुलना में.
6 चित्रा. एडिनो-NFAT-luciferase से संक्रमित अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं में luciferase गतिविधि को मापने. (ए) TLCS साथ luminescence के adenoviral NFAT-luciferase. (बी) TLCS (5-500 माइक्रोन) प्रेरित NFAT-luciferase गतिविधि. के प्रशासन (सी) टाइम कोर्स का प्रदर्शन संचय के साथ प्राथमिक माउस अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं के संक्रमण के लिए स्कीमा (500 माइक्रोन) एक 6 पर दियाअवधि घंटा. (एन = 3). * #, पी क्रमश अकेले नियंत्रण या TLCS के सापेक्ष 0.05 <,,.
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Discussion
सेल अलगाव विधि और बाद assays के बहि अग्न्याशय के शारीरिक और pathophysiological सुविधाओं का अध्ययन करने के साथ जो शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व यहां दर्शाया. छितरी अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं को अलग करने के लिए विधि पहली बार 1972 11 में एम्सटर्डम और जेमीसन ने बताया था. यहाँ प्रस्तुत तरीकों वान ऐकर और उनके सहयोगियों ने 12 से वर्णित अधिक हाल ही में अलगाव तरीकों से अनुकूलित किया गया है. इन तकनीकों अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और आसानी से सीख रहे हैं, ठीक किया जाना चाहिए जो प्रत्येक विधि के लिए कई महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं. इन तकनीकी जानकारी समझना मुसीबत शूटिंग आसान और बेहतर आवेदन के लिए अनुमति देगा.
कैल्शियम मापन के लिए कक्षों की तैयारी में, हम छोटे कृन्तकों से अग्न्याशय अधिक अनुरूप परिणाम है कि पैदावार पाया है. वे कम fibro-वसायुक्त ऊतक होते संभवतः क्योंकि acini, अधिक समान रूप से वितरित कर रहे हैं. के लिए सीए 2 + माप, हम इष्टतम एकल कक्ष इमेजिंग के लिए छोटे acini तैयार करते हैं. इस LDH मापन के लिए प्रयोग किया जाता है कि तुलना में एक उच्च collagenase एकाग्रता (1.1 मिलीग्राम / एमएल या 200 यू / एमएल) की आवश्यकता है. इस पद्धति का आधारभूत पर कम चोट का कारण बनता है क्योंकि LDH माप के लिए, हम बड़े acini तैयार करते हैं. तैयारी, इसलिए, एक कम collagenase एकाग्रता (0.5 मिलीग्राम / एमएल या 91 यू / एमएल) प्राप्त करता है.
सीए 2 के लिए + माप, यह कोशिकाओं एसिड धोया coverslips पर चढ़ाया जाना है कि महत्वपूर्ण है. एसिड धोने का उद्देश्य एक स्वच्छ सतह के साथ ही acini की अधिकतम पालन की अनुमति देगा कि electrostatic बातचीत प्रदान करना है. सेल तक (बी बायोसाइंस) के एवज में या इस विधि के अलावा में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, यह सीए 2 + डाई बीएसए को बंधन से डाई को रोकने के क्रम में बीएसए से मुक्त ऊष्मायन बफर (1) में भरी हुई है और (2) acini ज़्यादा से ज़्यादा एसिड धोया coverslips का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है कि .
टी "वर्णित> छिड़काव चैम्बर कस्टम डिजाइन. वाणिज्यिक संगठनों और प्रवाह प्रणाली, तथापि, वार्नर उपकरण के माध्यम से उपलब्ध हो गया था. छिड़काव के अलावा, एक अच्छी तरह विनियमित निर्वात की स्थापना से दूर suctioned होने से कोष्ठकी कोशिकाओं को रोकने में एक महत्वपूर्ण कारक है coverslip.अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं से कैल्शियम संकेतों को मापने करते हैं, हम एक confocal खुर्दबीन के प्रयोग का वर्णन है. Confocal इमेजिंग ऊपर या फोकल हवाई जहाज़ नीचे से प्रकाश को खत्म करने के क्रम में एक photomultiplier ट्यूब के सामने एक pinhole का उपयोग करता है. इसके विपरीत, व्यापक क्षेत्र इमेजिंग नमूना के प्रतिदीप्ति छवि को दूषित करने के लिए (ध्यान देने के वांछित विमान से ऊपर और नीचे यानी प्रकाश) फोकस प्रकाश के बाहर की अनुमति देता है जो नमूना, की उत्तेजना पथ भर में प्रकाश का पता लगाता है. व्यापक क्षेत्र से अधिक confocal माइक्रोस्कोपी का लाभ यह पतली अनुभाग एक नमूना की इमेजिंग, साथ ही साथ एकत्र ऑप्टिकल स्लाइस के 3D पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता हैएक Z-अक्ष. इसके अलावा, confocal माइक्रोस्कोपी, लाइन स्कैनर, sweptfield स्कैनर, या एक बिंदु स्कैनर से भी संकुचित क्षेत्रों के एक कताई डिस्क का उपयोग कैल्शियम प्रतिदीप्ति में तेजी से परिवर्तन पर कब्जा कर सकते हैं, जो उच्च गति संग्रह प्रणाली प्रदान करता है.
ऐसे क्रमशः लहरों और दोलनों, के रूप में कैल्शियम संकेत पैटर्न में स्थानिक और अस्थायी परिवर्तन, मज़बूती एफ / एफ 0 गणना का उपयोग करके मापा, लेकिन इस [2 Ca +] के एक सच्चे संकेत नहीं है किया जा सकता है. के मात्रात्मक माप [सीए 2 +] त्रुटियों को नुकसान 13,14 photobleaching और डाई के कारण इन मापों में हो सकता है, हालांकि, एकल तरंगदैर्ध्य उत्तेजना और ऐसे Fluo 4 के रूप में उत्सर्जन कैल्शियम रंगों का उपयोग कर की गणना की जा सकती है. [2 Ca +] इस तरह के Fura2 या Indo1 15 ratiometric रंगों का उपयोग करके अधिक सही मापा, लेकिन इस वजह से उत्तेजना के लिए एक यूवी लेजर की आवश्यकता का सबसे confocal सूक्ष्मदर्शी पर अव्यावहारिक है किया जा सकता है. दूसरी ओर, concomita परFluo-3 या Fluo 4 और Fura लाल की NT के उपयोग सबसे confocal सूक्ष्मदर्शी 16 पर मौजूद है कि 488 एनएम उत्तेजना लाइन का उपयोग अनुपात इमेजिंग अनुमति दे सकते हैं.
LDH रिसाव कोष्ठकी सेल चोट 7,17 को मापने के लिए एक संवेदनशील उपकरण है. एक अन्य पूरक विधि propidium आयोडाइड तेज 18 है. Adenovirus संक्रमण सुसंस्कृत acini 19 में उच्च संक्रमण दर को प्राप्त करने. वायरस की एकाग्रता titrated होना पड़ सकता है. इसके अलावा, यह एक और अप्रासंगिक adenoviral निर्माण भी संक्रमित है जिसमें तुलनीय नियंत्रण की स्थिति प्रदान करने के लिए उपयोगी है. 12 घंटा के तहत के लिए पिछले हमारी संक्रमण के अध्ययन के अधिकांश. हालांकि, लंबी अवधि के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं के शुरू में DMEM-F12 के मीडिया में जोड़ा जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य अनुदान DK083327 और DK093491 का एक राष्ट्रीय संस्थान (SZH के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
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