Summary
Vi beskriver en reproducerbar metod för framställning av musceller bukspottkörtel acinar från en mus för att undersöka acinar signaler cellkalcium och cellulär skada med fysiologiskt och patologiskt relevanta stimuli. En metod för adenoviral infektion av dessa celler finns också.
Abstract
Den bukspottkörtel körtelcell är den viktigaste parenkymala cellen i exokrina pankreas och spelar en central roll i utsöndringen av pankreasenzymer i bukspottkörtelns kanalen. Det är också platsen för inledandet av pankreatit. Här beskriver vi hur acinar celler isoleras från hela pankreas vävnad och intracellulära signaler kalcium mäts. Dessutom beskriver vi de metoder för transfektering av dessa celler med adenovirala konstruktioner, och därefter mäta läckage av laktatdehydrogenas, en markör för cellskada, under betingelser som inducerar skada acinar cell in vitro. Dessa tekniker ger ett kraftfullt verktyg för att karakterisera körtelcell fysiologi och patologi.
Introduction
Dynamiska förändringar i cytosoliskt kalcium är nödvändigt för både fysiologiska och patologiska händelser körtelcell. Dessa divergerande konsekvenser av kalcium tros bero på olika rumsliga och tidsmässiga mönster kalcium signalering 1. Till exempel är enzymet och vätskeutsöndring från körtelcell kopplad till kalcium spikar från en begränsad region av apikala polen där utsöndring äger rum 2. Däremot är en global kalcium våg följs av intensiva icke-oscillerande kalcium signaler i samband med tidiga patologiska händelser som leder till akut pankreatit 3,4. Dessa inkluderar intra-acinar proteasaktivering, reducerad enzym sekretion, och körtelcell skada. Vårt labb använder isolerade pankreaskörtelgång att studera dessa tidiga patologiska händelser som leder till sjukdomen både in vivo och in vitro 5-7. De metoder som beskrivs här beskriver isolering av primära körtelceller i syfte att mäta cytosolic kalciumnivåer och cellskada. En metod för adenoviral infektion av dessa celler finns också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Förbereda bukspottkörtel Acinar för Kalcium Imaging
- Förbered HEPES inkubationsbuffert innehållande 20 mM HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,3 mM CaCl2, 10 mM glukos, 2 mM glutamin och 1 × minsta Eagles medium icke-essentiella aminosyror. Justera den slutliga lösningen till pH 7,4 med NaOH.
- Förbered en BSA inkubationsbuffert genom tillsats av BSA (1% vikt / volym slutlig) till 25 ml av HEPES inkubationsbufferten (beskriven ovan).
- Förbered en buffert kollagenasdigerering genom tillsats av 1,1 mg / ml (200 enheter / ml) av typ-4 kollagenas och 1 mg / ml trypsininhibitor från sojaböna till 6 ml av BSA inkubationsbuffert (beskriven ovan).
- Syra-wash 22x22 mm täckglas genom nedsänkning i två delar HNO 3 och en del HCl under 2 timmar. Häll sedan med avjoniserat vatten och förvara i 70% etanol.
- Euthanize en mus genom kvävning med CO2. Orient djuret i ryggläge, och förbereda bukytan av cleAning med 70% etanol. Utför en laparotomi för att exponera bukhålan. Dissekera ut bukspottkörteln och skölj omedelbart i en liten väger båt innehållande 6 ml kollagenasdigerering buffert.
- Dissekera bort stora bitar av fett eller synliga blodkärl, ta sedan bort 5 ml kollagenasdigerering buffert och lägga den tillbaka till 15 ml koniska rör.
- Använda fina dissektion sax färs bukspottkörteln i den lilla vägning båten innehållande 1 ml kollagenas digereringsbuffert. Finhacka tills den resulterande lösningen verkar jämnt fördelade.
- Överför den malda produkten till en 125 ml E-plast kolv och tillsätt resterande 5 ml kollagenasdigerering buffert till behållaren. Se till att vävnaden är helt nedsänkt i buffert.
- Placera kolven i ett 37 ° C vattenbad och skaka vid 90 rpm under 30 min. Under denna korta period av driftstopp, förbereda agonister kalcium aktiverande (t.ex. kaerulein, karbakol) och skölj 22x22 mm syratvättad lockglider med DI-vatten. Torr, och sedan placera ovanpå en plan yta kantad av laboratorie-film.
- Efter 30 min digest är klar överför suspensionen tillbaka till 15 ml koniska rör och tillåta cellerna att sedimentera. Försiktigt pipettera ut bufferten kollagenasdigestion och ersätta med 6 ml BSA inkubationsbuffert. Skaka röret för hand under 10 sek för att dispergera cellerna i mindre kluster. Omedelbart efter skakning, ta bort alla stora, flytande skräp från de oreglerade media.
- Låt de kvarvarande cellerna att sedimentera och utbyta media med färsk BSA inkubationsbuffert.
- Upprepa steg 1,11 gånger, tills suspensionen består av endast små kluster som är bara fint med blotta ögat. Cellerna bör likna de som visas i figur 1 A (övre raden).
- Ta BSA inkubationsbufferten och ersätta med HEPES inkubationsbuffert.
- Förbered en 750 iM, 100X lager av Fluo-4:00 i 10% DMSO.
- Fyll cellerna i 15 ml koniska rör innehållande cellsuspensionen och BSA-fri HEPES inkubationsbuffert. För att göra detta, lägg till en lämplig volym (1:100 utspädning) av stamlösning till cellsuspensionen. Då plattan 500 l av denna suspension på varje 22x22 mm täckglas.
- Håll täckglas i mörker vid rumstemperatur. Ta första Ca2 + mätningar 30 minuter efter lastning. Färgämnet tas automatiskt bort från mediet vid start av perfusionen som bör ske 30 min efter färgämnesbelastning.
2. Mätning Kalcium i bukspottkörtel Acinar
- Skölj varje perfusion set-up med avjoniserat vatten och fyll med en lämplig mängd buffert eller agonist. Prime varje spruta med buffert eller agonist att säkerställa korrekt flöde. Clamp sprutor till en ring står ca 1-2 meter ovanför mikroskop scenen.
- Använd fin pincett för att försiktigt tag från sin kant ett täckglas innehållande cellsuspension. Luta luckanglida 45 °, och låta överskottet buffert för att rinna av. Placera täckglas ovanpå gummipackningen med cellerna på toppen av täckglas, och montera kammaren (fig. 2A och 2B).
- Säkra perfusionskammaren till scenen och sätt i rör, som innehåller bufferten i det första inloppet av kammaren (figur 2C). Vänd sprutan innehållande buffert på och låt bufferten för att perfundera över hela ytan av täckglas. När väl bufferten har nått den motsatta änden av kammaren, infoga en vakuumledning in i vakuum inlopp. Sätt några andra rör (innehållande agonist, inhibitorer, etc) i deras lämplig position längs kammaren.
- Visualisera cellerna med användning av antingen en eller 200X 400X, 1,4 numerisk apertur objektiv och en argonlaser för att excitera Fluo-04:00 färgämne vid en våglängd av 488 nm (figur 1 A, botten). De effektinställningar hos lasern bör justeras så att fotomultiplikatorrör (PMT) Är inte mättad av det utsända ljuset. Dessutom måste spänningen över PMT optimeras för maximal Ijusdetektering.
- Lång-pass utsläpp signaler> 515 nm samlas vid ram hastigheter på 2-5 sek / ram för att visualisera långsamma oscillerande mönster och 0,2-0,3 sek / ram för visualisering snabbare, globala kalcium vågor (figur 3 och 4).
- Efter bildbehandling är klar, stäng sprutorna och ta bort alla slangar. Demontera kammaren och upprepa steg 2.2-2.4.
- Samla data som numeriska värden av fluorescens intensitet över tid och transfer till bild J (programvara paket som tillhandahålls som freeware av National Institutes of Health och kan hittas på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
- Visa realtid cellulära bilder och identifiera områden av intresse (ROI, dvs apikal, basolateral, kärnkraft, etc.)
- Förvärva fluorescensintensiteter för dessa ROI och represent som fluorescens intensitet / baseline fluorescens intensitet (dvs. f/f0).
- Generera kurvor genom att rita F / F 0 vs tid. Förutom spårningar är representativa bilder allmänt tillgänglig och visas med pseudofärger.
Tre. Beredning av celler i bukspottkörteln Acinar för analyser cellskada
- Varma DMEM F-12-medium (utan fenolrött) till 37 ° C.
- Lägg BSA (0,1% vikt / volym slutlig) och HCl (50 ^ M slutlig) till DMEM F-12 media.
- Alikvotera 50 ml DMEM i en konisk tub.
- Förbered en kollagenas-buffert genom att tillsätta 0,5 mg / ml (12 U / ml) av typ IV-kollagenas till 10 ml kompletterat DMEM F-12 media.
- Euthanize en mus genom kvävning med CO2. Orient djuret i ryggläge, och förbereda bukytan genom rengöring med 70% etanol. Utför en laparotomi för att exponera bukhålan. Dissekera ut bukspottkörteln och skölj omedelbart i en liten vägning båt containing 6 ml kollagenas buffert.
- Finhacka vävnaden med fina dissektion sax för 3-5 min eller tills den erhållna lösningen blir jämnt fördelat.
- Överför det malda vävnaden till en 125 ml Erlenmeyer-kolv med 5 ml ytterligare kollagenas buffert, placera sedan i en 37 ° C vattenbad med skakning vid 90 rpm under 5 min.
- Ta bort från shaker, låta cellerna att kortfattat lösa, och utbytet med 5 ml färskt kollagenas buffert. Inkubera sedan under ytterligare 35 min i en 37 ° C vattenbad med skakning vid 90 rpm.
- Kraftfullt resuspendera digest hjälp av en pipett tills suspensionen ser homogent med inga uppenbara cell klumpar. Sedan försiktigt pipettera cellsuspensionen genom en pre-wet nylonnät i en konisk kolv.
- Kraftfullt Pipettera ytterligare 3 ml färsk DMEM F-12-medium (med kollagenas) genom nätet, i syfte att tvinga igenom eventuella kvarvarande celler.
- Lägg till ytterligare 6-10 ml DMEM F-12 medium och enllow cellerna sedimentera under 2-3 min. Upprepa detta steg två gånger, och avlägsna supernatanten efter den slutliga tvättningen.
- Lägg nytt DMEM F-12 media, återsuspendera cellerna, och plattan 500 | il av cellsuspensionen i varje brunn i en 48-brunnars vävnadsodlingsplatta. Cellerna bör likna de som visas i figur 1B.
- Låt plattan sitta i en 37 ° C vattenbad vid 90 varv per minut under 5 minuter före tillsats av agonister.
- Stimulera cellerna med varierande agonister för 2-4 timmar.
- Vippa plattan vid en vinkel för att tillåta cellerna att sedimentera och försiktigt pipettera ut en alikvot av media (vanligtvis 100 | il) och blixt frysa i flytande kväve.
- Flash frysa resterande cellsuspension. Flash frysning är inte nödvändigt för LDH mätningar. Som ett alternativ kan prover kan förvaras på is om de kommer att analyseras samma dag eller förvaras i -20 ° C för långtidsförvaring.
4. Mätning laktatdehydrogenas Läckage
- Bered LDH substratet (som medföljer i satsen) med 12 ml analysbuffert (också).
- Tina frysta cellsuspensionen och mediaprover i ett vattenbad vid rumstemperatur.
- Plate 50 pl av varje mediespår prov i en 96-brunnars platta.
- Till cellsuspensionen, lägger den nödvändiga volymen 10X lysbuffert så att den slutliga koncentrationen är 1X. Skaka snabbt och inkubera vid 37 ° C i 60 min.
- Centrifugera lyserade proverna vid 250 xg under 4 min till pellets cell skräp.
- För cellysat, plattan 50 pl av en 1:10 spädning i varje brunn i en 96 brunnars platta.
- Lägg 50 pl av rekonstituerad substrat till varje brunn, inkubera plattan i mörker vid rumstemperatur under 30 min.
- Stoppa reaktionen genomtillsats av 50 | il av stopplösning (tillhandahållet i kitet) till varje brunn.
- Mät absorbansen vid 490 nm.
- Använd följande formler för att beräkna% LDH läckage. De optiska densiteter under korrigeras genom att subtrahera ut ett tomt OD läsning från en brunn innehåller endast PBS, substrat, och stoppa lösning.
LDH i media = (Media OD492) x (media utspädningsfaktor) x (vol. medier) * Eftersom det är oftast onödigt att späda media prover, utspädningsfaktorn kommer oftast equal1.
Totalt LDH = ((Lysate OD 490) x (lysate utspädningsfaktor) x (vol. i cell suspension)) + ((Media OD 490) x (spädningsfaktor) x (vol. av media alikvoteras för provtagning))
Fem. Infektera celler Pancreatic Acinar med Adenovirus
- Förberedbukspottkörtel körtelceller beskrivs i avsnitt 3.
- Efter steg 3,12, tillsätt 10 7 infektiösa enheter (IFU) av adenovirus till cellsuspensionen och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
- Jämnt platta 2 ml cellsuspension i en 6-brunnars platta.
- För de flesta uttryckskonstruktioner bör cellerna tillräckligt smittas inom 18 timmar, och för några luciferas konstruktioner, bara inom 6 tim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på mätningar acinar cell kalcium som svar på fysiologiska stimuli ges i figur 3. Körtelceller laddades med kalcium färgämnet Fluo-4 och genomströmmas med acetylkolin analog karbakol (CCh, 1 M)) 8. Celler reagerade i form av ett kalcium våg som initierar i apikala regionen och propagerar för basolateral regionen 3,9. Representativa kurvor visas i figur 3b visar den typiska topp-platån mönster vanligen observeras med 1 ^ M karbakol. Omvänt, med sub-maximala doser av cholecystokinin analoga kaerulein (22:00) ger oscillerande kalcium svar (Figur 4) 10.
Läckage av LDH från acinära celler som svar på pankreatit-framkallande agonister visas i figur 5. Här visar vi koncentrationsberoende ökningar av LDH läckage i närvaro av kaerulein, karbakol, eller than gallsyra taurolithocholic syra-3-sulfat (TLCS). De koncentrationer som krävs för att framkalla maximal läckage av LDH överensstämmer med de som krävs för att inducera intra-acinar proteasaktivering och patologiska signalering kalcium, tyder dessa händelser kan leda till skador.
Acinar celler infekterades med en luciferasrapportör adenovirus, som drivs av promotorn för en nedströms Cn effektor, nukleär faktor av aktiverade T-celler (NFAT, figur 6A). Vi tillhandahåller representativa uppgifter validera vår infektion metod, visar koncentration-och tidsberoende ökning av NFAT-luciferasaktivitet i närvaro av TLCS (Fig. 6B och 6C).
Figur 1. Representant bilder av celler i bukspottkörteln acinära följande olika preparat. (A) körtelceller förberedd för Ca2 +-mätningar, som visualiseras vid 630X förstoring. Översta raden visar ljusfältsmikroskopi, skildrar nedersta raden acinar celler laddade med Ca 2 + dye Fluo-4 och visualiseras med fluorescens mikroskopi. (B) körtelceller förberedda för cytotoxicitetsanalyser, som visualiseras vid 400X förstoring.
Figur 2. . The perifusion kammaren (A) Kammaren består av tre skikt:. En metallbas, en gummipackning, och ett plasthölje (B) Gummipackningen placeras ovanpå av metallen bas och en 22x22 mm täckglas innehållande cellerna placeras uppåt ovanpå gummipackningen. Plasten skruvas till metallen bas och en 18x18 mm täckglas placeras ovanpå. (C) Kammaren är sedanfäst vid mikroskop scenen. Slangar, innehållande buffert eller agonist, matas in i inloppen ligger på kammarens kant (pil). Separat slang leder till ett vakuum (pilspets).
Figur 3. En typisk topp-platån kalcium signal vid stimulering med karbakol (1 M). (A) Från vänster till höger, Bright fält över ett acinus märkta vid (A) Pical och (B) asolateral områden av intresse från en körtelcell. Celler laddades med kalcium indikator Fluo-4 (5 M). Vid stimulering med fysiologisk karbakol (1 uM, Ach analog), efterföljande bilderna visar initieringen av kalcium-signalen i den apikala regionen följt av smittspridning till basala regionen (B) Varje panel bild (1-4), motsvarar en bildruta. längs en representant spåra förändringar i fluorescens över tiden för varje region av intresse. Bilder ärrepresenterade i pseudofärger med en färgskala (nederst till höger). Vänster och höger pilar visar tiden för första kalcium stiger i de apikala och basala orter. Denna siffra var ursprungligen publicerad i Journal of Biological Chemistry. (Orabi AI, Shah AU, Muili K., Luo Y., Mahmood SM, Ahmad A., Reed A., Husain SZ Etanol ökar karbakol-inducerad proteasaktivering och accelererar kalcium vågor i isolerad rått pankreaskörtelgång. The Journal of Biological Chemistry , 2 86, 14.090-14.097 (2011)).
Figur 4. En typisk kalcium oscillation vid stimulering kaerulein (22:00). (A) Förändringar i hela cellen cytosoliskt kalcium mättes en gång per sekund genom time-lapse konfokalmikroskopi med kalcium färgämnet Fluo-4 / AM. Bilderna representerade i pseudofärger med en färg scale (överst till höger). (B) representativ kurva av fluorescens över tiden registrerades från en enda cell som behandlats med kaerulein (10:00) vid pH 7,4. Denna siffra var ursprungligen publicerad i Journal of Biological Chemistry. (Reed AM, Husain SZ, Thrower E., Alexandre M., Shah A., Gorelick FS, Nathanson MH Låg Extracellular pH Orsakar skador på bukspottskörteln körtelcell genom att öka kalcium signalering Journal of Biological Chemistry, 286, 1919-1926 ( 2011)).
Figur 5. Mätning cellskada från acinar celler behandlade med olika pankreatit-inducerande agonister. I enstaka körtelceller, var laktatdehydrogenas (LDH) läckage används som ett biochemical skadeindikator. Isolerade acinar-celler behandlades med varierande koncentrationer av (A) kaerulein (1-100 nM) (B) karbakol (1 uM -1 mM) och (C) TLCS (50-500 pM), och% LDH läckage mättes efter två tim. (N = 3). #, *, P <0,05 jämfört med kontrollgruppen och TLCS ensam, respektive.
Figur 6. Mätning luciferasaktivitet i celler i bukspottkörteln acinar infekterade med adeno-NFAT-luciferas. (A) Schema för infektion av primära acinära mus pankreasceller med adenovirus NFAT-luciferas. (B) Administration av TLCS (5-500 nM) inducerad NFAT-luciferasaktivitet. (C) Tid kurs visar ackumulering av luminiscens med TLCS (500 iM) som gavs under en 6hr period. (N = 3). *, #, P <0,05, i förhållande till kontrollen eller TLCS ensam, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den cellisolering metod och efterföljande analyser skildras här utgör kraftfulla verktyg som man kan studera de fysiologiska och patofysiologiska funktioner i exokrina pankreas. Den metod för att isolera dispergerade bukspottkörtel acinar beskrevs först av Amsterdam och Jamieson 1972 11. De metoder som presenteras här har anpassats senare isolering metoder som beskrivs av Van Acker och kollegor 12. Även om dessa tekniker är mycket reproducerbar och lättlärd, finns det flera viktiga funktioner för varje metod som skall utföras noggrant. Att förstå dessa tekniska detaljer kommer att möjliggöra enklare felsökning och förbättrad tillämpning.
Vid framställning av celler för kalcium mätningar, har vi funnit att bukspottkörteln från yngre gnagare ger jämnare resultat. De acini är mer jämnt fördelade, möjligen eftersom de innehåller mindre fibro-fettvävnad. För Ca2 + mätningar, vi förbereder mindre acini för optimal enskild cell imaging. Detta kräver en högre koncentration kollagenas (1,1 mg / ml eller 200 U / ml) än den som används för LDH-mätningar. För LDH mätningar, förbereder vi större acini eftersom denna metod orsakar mindre skada vid baslinjen. Beredningen därför får en lägre kollagenas koncentration (0,5 mg / ml eller 91 U / ml).
För Ca2 +-mätningar, är det viktigt att celler pläterade på syra-tvättade täckglas. Syftet med syra-wash är att åstadkomma en ren yta samt elektrostatiska interaktioner som gör att maximal vidhäftning av acini. Cell Tak (BD Bioscience) kan användas i stället för eller i tillägg till denna metod. Dessutom är det viktigt att Ca2 + färgämne är laddad i en BSA-fri inkubationsbuffert för (1) för att förhindra färgen från bindning till BSA och (2) att låta acini till maximalt följa syra-tvättade täckglas .
t "> perfusionskammaren beskrivs var skräddarsytt. Kommersiella kammare och system flöde, dock är tillgängliga via Warner Instruments. Förutom perfusion, inrätta ett väl reglerat vakuum är en kritisk faktor för att förebygga körtelceller från att sugas bort täckglas.Vid mätning kalcium signaler från bukspottkörtel acinära beskriver vi användandet av en konfokalmikroskop. Confocal avbildning använder ett nålhål framför ett fotomultiplikatorrör för att eliminera ljus ovanifrån eller underifrån fokalplanet. Däremot upptäcker brett fält avbildning ljus hela excitation väg provet, vilket gör ofokuserad ljus (dvs. ljus över och under den önskade plan fokus) att förorena fluorescens bild av provet. Fördelen med konfokalmikroskopi över breda fält är att det möjliggör tunna sektionen avbildning av ett prov, samt 3D-rekonstruktion av optiska skivor som samlats längsen Z-axel. Dessutom ger konfokalmikroskopi höghastighetståg insamlingssystem som kan fånga snabba förändringar i kalcium fluorescens med hjälp av en snurrande skiva, line scanner, sweptfield scanner, eller ens förträngda områden från en punkt scanner.
Rumsliga och tidsmässiga förändringar i kalcium signalering mönster såsom vågor och svängningar, respektive, kan tillförlitligt sätt med användning av F / F 0 beräkningen, men detta är inte en sann indikator på [Ca 2 +]. Kvantitativa mätningar av [Ca2 +] kan beräknas med hjälp av en enda våglängd excitation och emission färgämnen kalcium såsom Fluo-4, men fel kan uppstå i dessa mätningar på grund fotoblekning och färgämne förlust 13,14. [Ca2 +] kan mätas mer exakt genom att använda ratiometriska färgämnen, såsom fura2 eller Indo1 15, men detta är opraktiskt på mest konfokala mikroskop på grund av kravet på en UV laser för excitation. Å andra sidan, concomitant användning av Fluo-3 eller Fluo-4 och Fura-röd kan tillåta ratio avbildning med 488 linjen nm excitation som finns på de flesta konfokala mikroskop 16.
LDH läckage är ett känsligt verktyg för att mäta körtelcell skada 7,17. En annan kompletterande metod är propidiumjodid upptag 18. Adenovirusinfektioner uppnå hög smittade i odlade acini 19. Koncentrationen av virus kan behöva titreras. Dessutom är det bra att ge jämförbar kontrollgrupp villkor som någon annan irrelevant adenoviralt konstruktionen också smittade. De flesta av våra infektionsstudier senaste för under 12 timmar. Men för längre perioder, kan antibiotika sättas till DMEM-F12-medium i utgångsläget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en National Institutes of Health Grant DK083327 och DK093491 (till SZH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy. Embo J. 11, 1623-1629 (1992).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells. Embo J. 16, 242-251 (1997).
- Husain, S. Z., et al. The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).
- Raraty, M., et al. Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).
- Orabi, A. I., et al. Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).
- Shah, A. U., et al. Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).
- Muili, K. A., et al. Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Orabi, A. I., et al. Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini. J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).
- Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).
- Reed, A. M., et al. Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling. J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Van Acker, G. J., et al. Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis. J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells. J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).
- Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini. Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red. Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).
- Saluja, A. K., et al. Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini. Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).
- Husain, S. Z., et al. Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo. Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).
