Utarbeidelse av acinøse Cells for hensikten med Kalsium Imaging, celleskade Measurements, og adenovirus infeksjon

Summary

Vi beskriver en reproduserbar fremgangsmåte for fremstilling av mus acinøse celler fra en mus med det formål å undersøke acinøse celler kalsium signaler og cellulær skade med fysiologisk og patologisk relevante stimuli. En fremgangsmåte for adenoviral infeksjon av disse celler er også tilveiebrakt.

Abstract

Den acinøse celle er den viktigste parenchymal celle av den eksokrine pankreas og spiller en primær rolle i utskillelsen av pankreas enzymer inn i bukspyttkjertelen kanal. Det er også stedet for oppstart av pankreatitt. Her beskriver vi hvordan akinærceller er isolert fra hele bukspyttkjertelen vev og intracellulære kalsium signaler måles. I tillegg, beskriver vi teknikker for å transfektere disse cellene med adenovirus-konstruksjoner, og deretter måling av lekkasje av laktatdehydrogenase, en markør for celleskade, under betingelser som induserer acinøs celleskade in vitro. Disse teknikkene gir et kraftig verktøy for å karakterisere acinar celle fysiologi og patologi.

Introduction

Dynamiske endringer i cytosolic kalsium er nødvendig for både fysiologiske og patologiske acinøse celler hendelser. Disse divergerende virkninger av kalsium er antatt å resultere fra forskjellige romlige og temporale mønstre av kalsium signalisering ^en. For eksempel er enzymet og utskillelse fra cellen acinøs knyttet til kalsium pigger fra et begrenset område av den apikale pol hvor utskillelsen finner sted ^to. I kontrast er en global kalsium bølge etterfulgt av intens ikke-oscillasjon kalsium signaler forbundet med tidlige patologiske hendelser som fører til akutt pankreatitt ^3,4. Disse inkluderer intra-acinar protease aktivering, redusert enzym sekresjon, og acinar celleskade. Laboratoriet benytter isolert pankreatisk acini å studere disse tidlige patologiske hendelser som fører til sykdom både in vivo og in vitro ^5-7. Metodene beskrevet her beskriver isolering av primære akinærceller for det formål å måle cytosolic kalsiumnivå og celle skade. En fremgangsmåte for adenoviral infeksjon av disse celler er også tilveiebrakt.

Protocol

En. Forbereder acinøse Cells for Kalsium Imaging

1. Forbered HEPES inkubasjonsbuffer inneholdende 20 mM HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl _2, 1.3 mM CaCl _2, 10 mM glukose, 2 mM glutamin og 1 x minimum Eagles medium ikke-essensielle aminosyrer. Juster den endelige løsningen til pH 7,4 med NaOH.
2. Tilbered en BSA inkubasjonsbuffer ved tilsetning av BSA (1% w / v final) til 25 ml av HEPES-inkubasjonsbuffer (beskrevet ovenfor).
3. Tilbered en kollagenase fordøyelse buffer ved tilsetning av 1,1 mg / ml (200 enheter / ml) type-4 kollagenase og 1 mg / ml soyabønne trypsininhibitor til 6 ml BSA inkuberingsbuffer (beskrevet ovenfor).
4. Syre-vask 22x22 mm Dekkglass ved å involvere i to deler HNO ₃ og en del HCl for 2 hr. Deretter dekanter bruke DI vann og butikk i 70% etanol.
5. Avlive en mus med CO ₂ kvelning. Orientere dyret i liggende stilling, og forberede bukhinnen av cleAning med 70% etanol. Utfør en laparotomy å eksponere bukhulen. Dissekere ut bukspyttkjertelen og umiddelbart skylle i en liten veie båt som inneholder 6 ml collagenase fordøyelsen buffer.
6. Dissekere bort noen store biter av fett eller synlig blodårer, og deretter fjerne 5 ml collagenase fordøyelsen buffer og legge den tilbake til 15 ml konisk tube.
7. Ved hjelp av gode disseksjon saks hakke bukspyttkjertelen i den lille veiing båt som inneholder 1 ml collagenase fordøyelsen buffer. Finhakk til den resulterende løsningen synes jevnt fordelt.
8. Overfør den kvernede produkt til en 125 ml Erlenmeyer kolbe plast, og tilsett den gjenværende 5 ml collagenase fordøyelse buffer til beholderen. Sørg for at vevet er helt nedsenket i buffer.
9. Plasser flasken i et 37 ° C vannbad og rist ved 90 rpm i 30 min. I løpet av denne korte perioden med nedetid, forberede kalsium aktiverende agonister (f.eks Caerulein, carbachol) og skyll 22x22 mm syre-vasket dekseletslips med DI vann. Tørr, og deretter plassere på toppen av en flat overflate omgitt av laboratoriet film.
10. Etter 30 min digest er ferdig, overfører suspensjonen tilbake til 15 ml konisk rør og tillate cellene å slå seg. Nøye pipette ut collagenase fordøyelsen buffer og erstatte med 6 ml BSA inkubasjonsbuffer. Kraft riste røret for hånd i 10 sekunder for å dispergere cellene i mindre klynger. Umiddelbart etter risting, fjerne store, flytende avfall fra de uoppgjorte media.
11. La de resterende cellene til å bosette seg, og utveksle media med friske BSA inkubasjonsbuffer.
12. Gjenta trinn 1.11 to ganger, inntil suspensjonen er sammensatt av bare små grupper som bare er fint synlig for det blotte øye. Cellene skal ligne de som vises i figur 1A (øverste rad).
13. Fjern BSA inkubasjonsbuffer og erstatte med HEPES inkubasjonsbuffer.
14. Forbered en 750 mikrometer, 100X lager av Fluo-4AM i 10% DMSO.
15. Last inn cellene i 15 ml konisk rør inneholdende cellesuspensjonen og BSA-fritt HEPES-inkuberingsbuffer. For å gjøre dette, tilsette en egnet volum (1:100 fortynning) av stamløsningen til cellesuspensjonen. Deretter plate 500 mL av denne suspensjonen på hver 22x22 mm dekkglass.
16. Hold Dekkglass i mørke ved romtemperatur. Ta første Ca ^{2 +} mål 30 min etter lasting. Fargestoffet blir automatisk fjernet fra mediet ved start av perfusjon, som bør forekomme 30 minutter etter fargestoff lasting.

2. Måling Kalsium i bukspyttkjertelen akinærceller

1. Skyll hver perfusjon oppsett med DI vann og fylles med en passende mengde av buffer eller agonist. Prime hver sprøyte med buffer eller agonist for å sikre riktig flyt. Klemme sprøyter til en ring den stå i ca 1-2 meter over mikroskopet scenen.
2. Bruk fin pinsett til forsiktig gripe fra sin kant ett dekkglass inneholder celle suspensjon. Vipp dekseletslip 45 ° og lar den overskytende buffer til å renne av. Plasser dekkglass på toppen av gummipakningen med cellene på toppen av dekkglass, og montere kammeret (figurene 2A og 2B).
3. Sikre perfusjon kammer til det stadium, og sett som inneholder buffer slangen inn i det første innløpet av kammeret (figur 2C). Snu sprøyten inneholder buffer på og la buffer til perfuse over hele overflaten av dekkglasset. Når bufferen har nådd den motsatte ende av kammeret, sett inn en vakuumledning inn i vakuum-innløp. Sett noen andre rør (som inneholder agonist, hemmere, etc.) inn i deres riktig posisjon langs kammeret.
4. Visualisere cellene ved hjelp av enten en 200X eller 400X, 1,4 numerisk aperture objektiv og en argon laser å opphisse Fluo-4AM fargestoff med en bølgelengde på 488 nm (figur 1A, nederst). De elektriske innstillinger av laseren bør justeres slik at den fotomultiplikatorrør (PMT) Blir mettet av det utsendte lys. I tillegg må spenningen over PMT være optimalisert for maksimal lys deteksjon.
5. Long-pass utslipp signaler om> 515 nm er samlet ramme hastigheter på 2-5 sek / ramme for å visualisere treg oscillasjon mønstre og 0,2-0,3 sek / ramme for å visualisere raskere, globale kalsium bølger (figur 3 og 4).
6. Etter bildebehandling er fullført, lukker du sprøyter og fjerne all slangen. Demontere kammeret og gjenta trinn 02.02 til 02.04.
7. Samle data som numeriske verdier av fluorescens intensitet over tid og overføring til Image J (programvarepakke følger med som freeware av National Institutes of Health og kan bli funnet på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
8. Vis sanntid mobilnettet bilder og identifisere områder av interesse (ROIs, dvs. apikal, basolateral, kjernekraft, etc.)
9. Erverve fluorescensintensiteter for disse ROIs og represent som fluorescensintensiteten / baseline fluorescensintensitet (dvs. F/F0).
10. Generere tracings ved å plotte F / F ₀ g. tid. I tillegg til tracings, er representative bildene ofte gitt og vist ved hjelp PseudoColor.

3. Utarbeidelse av acinøse Cells for celleskade Analyser

1. Varme DMEM F-12 media (uten fenol rød) til 37 ° C.
2. Legg BSA (0,1% w / v final) og HCl (50 mM endelig) til DMEM F-12 media.
3. Delmengde 50 ml DMEM inn i et konisk rør.
4. Tilbered en collagenase-buffer ved tilsetning av 0,5 mg / ml (12 E / ml) av type IV collagenase til 10 ml DMEM supplert F-12 media.
5. Avlive en mus med CO ₂ kvelning. Orientere dyret i liggende stilling, og forberede bukhinnen ved å rense med 70% etanol. Utfør en laparotomy å eksponere bukhulen. Dissekere ut bukspyttkjertelen og umiddelbart skylle i en liten veiing båt containing 6 ml collagenase-buffer.
6. Finhakk vev ved hjelp av fin disseksjon saks i 3-5 min eller til den resulterende løsningen vises jevnere fordelt.
7. Overfør den kvernede vevet til en 125 ml Erlenmeyerkolbe med 5 ml ytterligere collagenase buffer, deretter sted i et 37 ° C vannbad med risting ved 90 rpm i 5 min.
8. Fjern fra shaker, tillate cellene kort skal slå seg, og utveksling med 5 ml frisk buffer collagenase. Deretter inkuberes i ytterligere 35 min i et 37 ° C vannbad med risting ved 90 rpm.
9. Kraftig resuspender fordøye med en overføring pipette til suspensjonen ser homogen med ingen åpenbare celle klumper. Deretter pipetteres forsiktig cellesuspensjonen gjennom en pre-våt nylon mesh i en konisk kolbe.
10. Kraft pipetteres ytterligere 3 ml frisk DMEM F-12 media (med collagenase) gjennom mesh, for å tvinge gjennom eventuelle gjenværende celler.
11. Legg til en annen 6-10 ml DMEM F-12 media ogllow cellene til å bosette seg i 2-3 min. Gjenta dette trinn to ganger, og fjern supernatanten etter den siste vask.
12. Legg frisk DMEM F-12 media, resuspender cellene, og platen 500 ul celle-suspensjon til hver brønn i en 48-brønners vevkulturplate. Cellene bør ligne dem som vist i figur 1B.
13. At platen kan sitte i et 37 ° C vannbad ved 90 rpm i 5 min før tilsetning agonister.
14. Stimulere cellene med varierende agonister i 2-4 timer.
15. Vippe platen på skrå for å tillate cellene å feste seg og nøye pipetteres ut en alikvot av mediet (vanligvis 100 ul) og flash-frysing i flytende nitrogen.
16. Flash fryse de resterende celle suspensjon. Flash frysing er ikke avgjørende for LDH målinger. Som et alternativ kan prøvene holdt på is hvis de vil bli analysert på samme dag eller lagres i -20 ° C for langtidslagring.

4. Måle laktat dehydrogenase Lekkasje

1. Rekonstituere LDH underlaget (som er gitt i settet) med 12 ml analysebuffer (følger også med).
2. Tine frosne cellesuspensjon og medie-prøver i et vannbad ved romtemperatur.
3. Plate 50 mL av hver medieprøver i en 96-brønns plate.
4. Til denne cellesuspensjon, tilsett den nødvendige mengde av 10X lysis buffer, slik at sluttkonsentrasjonen er 1X. Vortex-kort, og inkuber ved 37 ° C i 60 min.
5. Sentrifuger lyserte prøver ved 250 xg for 4 min til pellet celle rusk.
6. For cellelysater, platen 50 pl av en 1:10 fortynning i hver brønn av en 96 brønns plate.
7. Tilsett 50 pl av rekonstituert substrat til hver brønn, Inkuber platen i mørke ved romtemperatur i 30 min.
8. Stopp reaksjonen ved åtilsetning av 50 ul av stopp-oppløsning (levert med settet) til hver brønn.
9. Måle absorbans ved 490 nm.
10. Bruk følgende formler for å beregne% LDH lekkasje. De optiske tettheter nedenfor er korrigert ved å trekke ut en blank OD lesing fra en brønn som bare inneholder PBS, substrat og stopp løsning.

LDH i media = (Media OD492) x (media fortynning faktor) x (vol. av media) * Siden det er vanligvis unødvendig å fortynne media prøver, fortynningsfaktoren vil oftest equal1.

Total LDH = ((Lysate OD ₄₉₀₎ x (lysate fortynning faktor) x (vol. i celle suspensjon)) + ((Media OD ₄₉₀₎ x (fortynning faktor) x (vol. av media alikvoteres for prøvetaking))

5. Infisere acinøse Cells med Adenovirus

1. Forberedacinøse celler som beskrevet i pkt. 3.
2. Etter trinnet 3.12, tilsett 10 ⁷ smittsomme enheter (IFUS) av adenovirus til cellesuspensjonen og inkuberes i 30 min ved 37 ° C.
3. Jevnt plate 2 ml cellesuspensjon i en 6-brønns plate.
4. For de fleste ekspresjonskonstruksjoner, bør være tilstrekkelig celler infisert i løpet av 18 timer, og for noen luciferase konstruksjoner, bare innen 6 timer.

Representative Results

Et eksempel på acinøse celler kalsiummålinger som reaksjon på fysiologiske stimuli er gitt i figur 3.. Akinærceller ble lastet med kalsium dye Fluo-4 og perfused med acetylkolin analog carbachol (CCH, 1 mikrometer)) ^8. Celler svarte i form av en kalsium bølge som starter i den apikale regionen og forplanter til basolateral regionen ^3,9. Representative tracings vist i Figur 3B viser den typiske topp-platået mønster ofte observert med en mikrometer carbachol. Omvendt, ved hjelp av sub-maksimal dose av den analoge Caerulein cholecystokinin (22:00) gir oscillasjon kalsium responser (Figur 4) ^10.

Lekkasje av LDH fra akinærceller i respons til pankreatitt-induserende agonister er vist i figur 5.. Her har vi demonstrere konsentrasjonsavhengige økninger i LDH lekkasje i nærvær av Caerulein, karbakol, eller than gallesyre taurolithocholic syre-3 sulfat (TLCS). Konsentrasjonene er nødvendig for å indusere maksimal lekkasje av LDH er konsistente med de som kreves for å indusere intra-acinar protease aktivering og patologiske kalsium signalering, tyder disse hendelsene kan føre til skade.

Akinærceller var infisert med et luciferase reporter adenovirus, som er drevet av en promoter for Cn nedstrøms effektor, nukleær faktor av aktiverte T-celler (NFAT, Fig. 6A). Vi gir representative data validering vår infeksjon metoden, viser konsentrasjon-og tidsavhengig økning i NFAT-luciferase aktivitet i nærvær av TLCS (Tall 6B og 6C).

Figur 1. Representative bilder av bukspyttkjertelen akinærceller folgende ulike preparater. (A) akinærceller forberedt for Ca ^{2 +} målinger, som visualiseres ved 630X forstørrelse. Øverste raden viser lyse felt mikroskopi, viser nederste raden akinærceller lastet med Ca ^{2 +} dye Fluo-4 og visualiseres ved hjelp av fluorescens mikroskopi. (B) akinærceller forberedt for cytotoksisitetstester analyser, som visualiseres på 400X forstørrelse.

Figur 2. . Den perifusion kammer (A) Kammeret består av tre lag:. En metallbasis, en gummipakning, og et plastdeksel (B) gummipakningen er plassert på toppen av metall-basen, og et 22x22 mm dekkglass inneholdende celler plasseres oppover på toppen av gummipakningen. Plastdekselet skrus i metall base og en 18x18 mm dekkglass er plassert på toppen. (C) Kammeret er dafestet til mikroskopet scenen. Rør, som inneholder buffer eller agonist, blir matet inn i innløpene plassert på trakten i forkant (pil). Separate rør fører til et vakuum (pilhodet).

Figur 3. En typisk topp-platået kalsium signal ved stimulering med carbachol (1 mikrometer). (A) Fra venstre; Bright feltet visning av en acinus merket på (A) pical og (B) asolateral regioner av interesse fra en acinar celle. Celler ble ladet med den kalsium-indikator Fluo-4 (5 uM). Ved stimulering med fysiologisk karbakol (1 jim, Ach analoge), etterfølgende bilder viser initiering av kalsium signal i apikal region fulgt av forplantning i den basale regionen (B) Hver panelt bilde (1-4), svarer til en ramme. langs en representant sporing av endringer i fluorescens over tid for hvert område av interesse. Bildene errepresentert i PseudoColor med en fargeskala (nederst til høyre). Venstre og høyre piler viser tidspunktet for første kalsium økning i apikale og basale regioner, henholdsvis. Dette tallet ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. (Orabi AI, Shah AU, Muili K., Luo Y., Mahmood SM, Ahmad A., Reed A., Husain SZ Etanol øker carbachol-indusert protease aktivering og akselererer kalsium bølger i isolerte rotte bukspyttkjertelen acini. The Journal of Biological Chemistry , to 86, 14090-14097 (2011)).

Figur 4. En typisk kalsium pendling ved stimulering Caerulein (22:00). (A) Endringer i hele cellen cytosolic kalsium ble målt en gang per sekund ved time-lapse konfokalmikroskopi hjelp av kalsium dye Fluo-4 / AM. Bildene er representert i PseudoColor med en farge sCale (øverst til høyre). (B) Representant tomt på fluorescens over tid ble registrert fra en enkelt celle behandlet med Caerulein (22:00) ved pH 7,4. Dette tallet ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. (Reed AM, Husain SZ, Thrower E., Alexandre M., Shah A., Gorelick FS, Nathanson MH lav Ekstracellulær pH induserer Skade i acinøse Cell ved å styrke kalsium signalisering The Journal of Biological Chemistry, 286, 1919-1926 ( 2011)).

Figur 5. Målecellen skade fra akinærceller behandlet med forskjellige pankreatitt-induserende agonister. I isolerte akinærceller ble laktatdehydrogenase (LDH) lekkasje brukt som en biochemical indikator på skade. Isolerte akinærceller ble behandlet med varierende konsentrasjoner av (A) Caerulein (1-100 nM) (B) karbakol (1 uM -1 mM) og (C) TLCS (50-500 uM), og% LDH lekkasje ble målt etter 2 hr. (N = 3). #, *, P <0,05 sammenlignet med kontrollgruppen og TLCS alene, henholdsvis.

Figur 6. Måling luciferase aktivitet i acinøse celler infisert med adeno-NFAT-luciferase. (A) Skjema for smitte av primære mus acinøse celler med adenoviral NFAT-luciferase. (B) Administrasjon av TLCS (5-500 mm) indusert NFAT-luciferase aktivitet. (C) Tid kurs demonstrere opphopning av luminescens med TLCS (500 mikrometer) gitt over en 6timersperiode. (N = 3). *, # P <0,05, sammenlignet med kontrollgruppen eller TLCS alene, respektivt.

Discussion

Cellen isolasjon metode og påfølgende analyser avbildet her representerer kraftige verktøy som brukes til å studere fysiologiske og patofysiologiske trekk ved eksokrin pankreas. Metoden for å isolere spredt acinøse celler ble først beskrevet av Amsterdam og Jamieson i 1972 ^11. Metodene som presenteres her har blitt tilpasset fra nyere isolasjon metoder beskrevet av Van Acker og kolleger ^12. Selv om disse teknikkene er meget reproduserbart og lett lært, er det flere viktige funksjoner til hver metode som må utføres nøyaktig. Forstå disse tekniske detaljene vil tillate enklere feilsøking og forbedret søknad.

Ved utarbeidelse av celler for kalsium målinger, har vi funnet ut at bukspyttkjertelen fra yngre gnagere gir mer konsistente resultater. De acini er mer jevnt fordelt, muligens fordi de inneholder mindre fibro-fatty vev. For Ca ^{2 +} målinger, forbereder vi mindre acini for optimal enkelt celle bildebehandling. Dette krever en høyere konsentrasjon kollagenase (1,1 mg / ml eller 200 U / ml) enn det som brukes til LDH-målinger. For LDH målinger, forbereder vi større acini fordi denne metoden fører til mindre skade ved baseline. Fremstillingen derfor får en lavere konsentrasjon kollagenase (0,5 mg / ml eller 91 U / ml).

For Ca ^{2 +} målingene, er det avgjørende at cellene bli belagt på syre-vasket Dekkglass. Formålet med syre-vask er å tilveiebringe en ren overflate, samt elektrostatiske interaksjoner som vil tillate maksimal vedheftingsevne acini. Cell Tak (BD Biovitenskap) kan brukes i stedet for eller i tillegg til denne metoden. I tillegg er det viktig at den Ca ^{2 +} fargestoff er lagt i en BSA-fri inkuberingsbuffer i rekkefølge (1) for å forhindre at fargestoffet fra binding til BSA, og (2) å tillate den acini å maksimalt følge den syre-vasket dekkglass .

t "> The perfusjon kammer beskrevet ble tilpasset designet. Kommersielle kamre og flow systemer, men er tilgjengelig gjennom Warner Instruments. I tillegg til perfusjon, sette opp en riktig regulert vakuum er en kritisk faktor for å hindre akinærceller fra å bli suges av dekkglass.

Ved måling av kalsium-signaler fra pankreatiske akinærceller, beskriver vi bruken av en konfokalmikroskop. Konfokal avbildning benytter et pinhole foran et fotomultiplikatorrør for å eliminere lys ovenfra eller nedenfra fokalplanet. I kontrast, detekterer bredt felt avbildning lys hele magnetisering bane av prøven, som tillater ut av fokus lys (dvs. lys over og under den ønskede fokusplanet) for å forurense den fluorescens bilde av prøven. Fordelen med konfokal mikroskopi enn bred-felt, er at det gir mulighet for tynne avsnitt avbildning av en prøve, samt 3D rekonstruksjon av optiske stykker som samles langsen Z-akse. I tillegg gir konfokalmikroskopi høyhastighets samling systemer som kan fange raske endringer i kalsium fluorescens ved hjelp av en roterende disk, line skanner, sweptfield skanner, eller enda smalere regioner fra et punkt skanner.

Romlige og tidsmessige endringer i kalsium signalisering mønstre som bølger og svingninger, henholdsvis, kan bli pålitelig målt med F / F ₀ beregningen, men dette er ikke en sann indikator på [Ca ^{2 +].} Kvantitative målinger av [Ca ^{2 +]} kan beregnes ved hjelp av enkelt bølgelengde eksitasjon og utslipp kalsium fargestoffer som Fluo-4, men feil kan oppstå i disse målingene grunn photobleaching og fargestoff tap ^{13,14. [Ca2 +]} kan måles mer nøyaktig ved hjelp av Ratiometrisk fargestoffer, slik som Fura2 eller Indo1 ^15, men dette er upraktisk på mest konfokale mikroskop på grunn av kravet til en UV-laser til magnetisering. På den annen side, concomitant bruk av Fluo-3 eller Fluo-4 og Fura-Red kan tillate forholdet avbildning ved hjelp av den 488 nm eksitasjon linje som er tilstede på de fleste konfokale mikroskop ^16.

LDH lekkasje er et følsomt verktøy for å måle acinar celleskade ^7,17. En annen komplementær metode er propidium jodid opptak ^18. Adenovirus infeksjoner oppnå høy infeksjon priser i kultivert acini ^19. Konsentrasjonen av virus kan trenge å bli titrert. I tillegg, er det nyttig å gi sammenlignbare kontroll forhold hvor et annet irrelevant adenoviral konstruere er også infisert. De fleste av våre infeksjonsstudier siste for under 12 timer. Men for lengre perioder, kan antibiotika bli lagt til DMEM-F12 media i utgangspunktet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 um pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110