Summary
Se describe un método reproducible de la preparación de las células acinares pancreáticas de ratón de un ratón con el fin de examinar las señales de calcio de células acinares y el daño celular con estímulos fisiológica y patológicamente relevantes. Un método para la infección adenoviral de estas células también se proporciona.
Abstract
La célula acinar pancreática es la principal de células de parénquima del páncreas exocrino y desempeña un papel principal en la secreción de enzimas pancreáticas en el conducto pancreático. También es el sitio para la iniciación de la pancreatitis. A continuación se describe cómo se aíslan las células acinares del tejido pancreático conjunto y señales intracelulares de calcio se miden. Además, se describen las técnicas de transfección de estas células con las construcciones adenovirales, y, posteriormente, la medición de la fuga de lactato deshidrogenasa, un marcador de la lesión de las células, en condiciones que inducen la lesión de las células acinares in vitro. Estas técnicas proporcionan una poderosa herramienta para caracterizar la fisiología y la patología de células acinares.
Introduction
Los cambios dinámicos en el calcio citosólico son necesarios para los eventos de células acinares tanto fisiológicas como patológicas. Estos efectos divergentes de calcio se cree que son el resultado de diferentes patrones espaciales y temporales de calcio de señalización 1. Por ejemplo, la enzima y la secreción de fluidos a partir de las células acinares están vinculados a los picos de calcio a partir de una región restringida del polo apical donde la secreción tiene lugar 2. En contraste, una onda de calcio mundial seguido de intensas señales de calcio no oscilatorios se asocia con eventos patológicos tempranos que conducen a la pancreatitis aguda 3,4. Estos incluyen la activación intra-acinar proteasa, la secreción de enzimas reducida y daño celular acinar. Nuestro laboratorio utiliza acinos pancreáticos aislados para estudiar estos eventos patológicos tempranos que conducen a la enfermedad tanto in vivo como in vitro 5-7. Los métodos detallados siguientes describen el aislamiento de las células acinares primarias para el propósito de medir CYtosolic los niveles de calcio y el daño celular. Un método para la infección adenoviral de estas células también se proporciona.
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Protocol
1. Preparación de las células acinares pancreáticas de Imagen de calcio
- Preparar HEPES tampón de incubación que contiene 20 mM de HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM de MgCl 2, 1,3 mM de CaCl2, 10 mM de glucosa, 2 mM de glutamina, y 1 × aminoácidos no esenciales del medio mínimo de Eagle. Ajustar la solución final a pH 7,4 con NaOH.
- Preparar un tampón de incubación de BSA mediante la adición de BSA (1% w / v final) a 25 ml de HEPES el tampón de incubación (descrito anteriormente).
- Preparar un tampón de digestión de colagenasa mediante la adición de 1,1 mg / ml (200 unidades / ml) de colagenasa de tipo 4 y 1 mg / ml de inhibidor de tripsina de soja a 6 ml de tampón de incubación de BSA (descrito anteriormente).
- Ácido-lavado cubreobjetos de 22x22 mm por inmersión en dos partes HNO 3 y una parte de HCl durante 2 horas. Entonces decantar con agua DI y guardar en etanol al 70%.
- La eutanasia a un ratón por asfixia de CO 2. Oriente el animal en posición supina, y preparar la superficie abdominal por cleANING con etanol al 70%. Realizar una laparotomía para exponer la cavidad abdominal. Diseccionar el páncreas y enjuagar inmediatamente en un pequeño bote sopesar contiene 6 ml de tampón de digestión con colagenasa.
- Diseccionar las grandes piezas de los vasos sanguíneos de grasa o visible, extraiga 5 ml de tampón de digestión con colagenasa y agregarlo de nuevo al tubo cónico de 15 ml.
- Usando tijeras de disección finas pelos en el páncreas en el pequeño recipiente de pesar que contiene 1 ml de tampón de digestión de colagenasa. Picar hasta que la solución resultante aparece dispersa uniformemente.
- Transferir el producto picado a un matraz Erlenmeyer de plástico de 125 ml, y añadir el 5 ml restantes de tampón de digestión de colagenasa en el contenedor. Asegúrese de que el tejido esté totalmente sumergido en tampón.
- Colocar el matraz en un baño de agua a 37 ° C y se agita a 90 rpm durante 30 min. Durante este corto periodo de tiempo de inactividad, preparar los agonistas activadores de calcio (por ejemplo, ceruleína, carbacol) y enjuagar la cubierta mm lavada con ácido 22x22se desliza con agua DI. En seco, y luego se coloca encima de una superficie plana revestida por una película de laboratorio.
- Después de 30 min la digestión es completa, transferir la suspensión de nuevo al tubo cónico de 15 ml y permitir que las células se asienten. Pipetear con cuidado el tampón de digestión colagenasa y reemplazar con 6 ml de tampón de incubación de BSA. Agite vigorosamente el tubo con la mano durante 10 segundos con el fin de dispersar las células en grupos más pequeños. Inmediatamente después de la sacudida, eliminar los residuos grandes, flotantes de los medios de comunicación pendientes.
- Permita que las células restantes se asienten y cambio de los medios de comunicación con el tampón de incubación BSA fresco.
- Repita el paso 1.11 dos veces, hasta que la suspensión se compone de sólo pequeñas agrupaciones que son sólo finamente visible para el ojo desnudo. Las células deben asemejarse a los que se representan en la Figura 1 (fila superior).
- Retirar el tampón de incubación BSA y reemplazar con HEPES buffer de incubación.
- Prepare un 750 mM, acciones 100X de Fluo-04 a.m. en el 10% DMSO.
- Cargar las células en el tubo cónico de 15 ml que contiene la suspensión de células y HEPES libre de BSA tampón de incubación. Para ello, agregue un volumen apropiado (1:100 dilución) de la solución madre a la suspensión celular. A continuación, la placa 500 l de esta suspensión sobre cada cubreobjetos de 22x22 mm.
- Mantenga cubreobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente. Tome la primera Ca 2 + mediciones de 30 minutos después de la carga. El colorante se elimina de forma automática a partir del medio al iniciar la perfusión, lo que debe ocurrir 30 minutos después de la carga de colorante.
2. El calcio de medición en las células acinares pancreáticas
- Enjuague cada perfusión de configuración con agua DI y se llene con una cantidad apropiada de tampón o agonista. Primer cada jeringa con tampón o agonista para asegurar el flujo adecuado. Sujete jeringas a un anillo de soporte aproximadamente 1-2 pies sobre la platina del microscopio.
- Use unas pinzas finas para captar cuidadosamente su borde un cubreobjetos suspensión celular que contiene. Incline la cubiertadeslizamiento 45 °, y permitir que el exceso de tampón se escurra. Coloque el cubreobjetos en la parte superior de la junta de goma con las células en la parte superior del cubreobjetos, y montar la cámara (Figuras 2A y 2B).
- Fije la cámara de perfusión a la etapa e insertar el tubo que contiene tampón en la primera entrada de la cámara (Figura 2C). Girar la jeringa que contiene tampón y deje que el tampón para perfundir sobre toda la superficie del cubreobjetos. Una vez que la memoria intermedia ha alcanzado el extremo opuesto de la cámara, insertar una línea de vacío en la entrada de vacío. Inserte los demás tubos (que contienen agonistas, inhibidores, etc) en su posición apropiada a lo largo de la cámara.
- Visualizar las células utilizando ya sea una, apertura numérica 1.4 objetivo 200X o 400X y un láser de argón para excitar el colorante Fluo-4 a.m. a una longitud de onda de 488 nm (Figura 1A, parte inferior). Los ajustes de potencia del láser deberían ser ajustados de tal manera que el tubo fotomultiplicador (PMT) No está saturado por la luz emitida. Además, el voltaje a través de la PMT debe ser optimizado para la detección de luz máxima.
- Señales de emisión de paso largo de> 515 nm se recogen a una velocidad de trama de 2-5 seg / marco para la visualización de los patrones oscilatorios lentos y 0,2-0,3 seg / marco para la visualización más rápido, olas globales de calcio (Figuras 3 y 4).
- Después de la filmación, cierre las jeringas y quitar toda la tubería. Desmontar la cámara y repita los pasos 2.2 a 2.4.
- Recopilar datos como valores numéricos de la intensidad de fluorescencia en el tiempo y la transferencia a la imagen J (paquete de software que se proporciona como freeware por los Institutos Nacionales de Salud y se puede encontrar en http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
- Ver imágenes móviles en tiempo real e identificar regiones de interés (ROI, es decir apical, basolateral, nuclear, etc)
- Adquirir intensidades de fluorescencia para estas regiones de interés y represent como intensidad de fluorescencia / intensidad de la fluorescencia basal (es decir f/f0).
- Genere trazados por el trazado de F / F 0 vs tiempo. Además de los trazos, imágenes representativas son suministradas normalmente y se muestran usando pseudocolor.
3. Preparación de las células acinares pancreáticas para los ensayos de lesión de la célula
- DMEM caliente F-12 los medios de comunicación (sin rojo fenol) a 37 ° C.
- Añadir BSA (0,1% final de w / v), y HCl (50 mM final) a las DMEM F-12 los medios de comunicación.
- Parte alícuota de 50 ml de DMEM en un tubo cónico.
- Preparar un tampón de colagenasa mediante la adición de 0,5 mg / ml (12 U / ml) de colagenasa tipo IV de 10 ml de DMEM suplementado F-12 los medios de comunicación.
- La eutanasia a un ratón por asfixia de CO 2. Oriente el animal en posición supina, y preparar la superficie abdominal mediante la limpieza con etanol al 70%. Realizar una laparotomía para exponer la cavidad abdominal. Diseccionar el páncreas y enjuagar inmediatamente en un pequeño barco de pesaje containing 6 ml de tampón de colagenasa.
- Picar el tejido con tijeras de disección finas durante 3-5 minutos o hasta que la solución resultante aparece dispersa uniformemente.
- Transferir el tejido picado a un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 5 ml de tampón de colagenasa adicional, entonces coloque en un baño de 37 ° C el agua con agitación a 90 rpm durante 5 min.
- Eliminar de la coctelera, permiten que las células se asienten brevemente, y el intercambio con 5 ml de tampón de colagenasa reciente. A continuación, se incuba durante un 35 minutos adicionales en un baño de agua a 37 ° C con agitación a 90 rpm.
- Vigorosamente resuspender el producto de digestión usando una pipeta de transferencia hasta que la suspensión tiene un aspecto homogéneo y sin grumos celulares obvias. A continuación pipetear suavemente la suspensión celular a través de un nylon pre-mojado malla en un matraz cónico.
- Vigorosamente pipetear un 3 ml adicionales de DMEM fresco F-12 con los medios de comunicación (colagenasa) a través de la malla, con el fin de forzar a través de las células restantes.
- Añadir otra 6-10 ml de DMEM F-12 medios de comunicación y unallow las células que conformarse con 2-3 min. Repita este paso dos veces, y eliminar el sobrenadante después del último lavado.
- Añadir DMEM fresco F-12 los medios de comunicación, resuspender las células, y la placa 500 l de suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 48 pocillos. Las células deberían ser similares a los representados en la Figura 1B.
- Permitir que la placa para sentarse en un baño de agua a 37 ° C a 90 rpm durante 5 min antes de la adición de los agonistas.
- Estimular las células con diferentes agonistas de 2-4 horas.
- Inclinar la placa en un ángulo para permitir que las células se asientan y la pipeta con cuidado una parte alícuota de los medios de comunicación (por lo general 100 l) y congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido.
- Flash congelar la suspensión celular restante. Flash de congelación no es esencial para las mediciones de DHL. Como un muestras alternativas se pueden mantener en hielo si van a ser ensayadas en el mismo día o se almacenan en -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
4. Medición de fugas lactato deshidrogenasa
- Reconstituir el sustrato de LDH (que se proporciona en el kit) con 12 ml de tampón de ensayo (también proporcionado).
- Descongele suspensión de células congeladas y muestras de medio en un baño de agua a temperatura ambiente.
- Placa de 50 l de cada muestra de papel en una placa de 96 pocillos.
- Para la suspensión de células, añadir el volumen necesario de tampón de lisis 10 veces de modo que la concentración final es 1X. Vórtice brevemente y se incuba a 37 ° C durante 60 min.
- Centrifugar las muestras lisadas a 250 g durante 4 min a sedimento de restos celulares.
- Para lisados de células, la placa 50 l de una dilución 1:10 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Añadir 50 l de sustrato reconstituido a cada pocillo, se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
- Detenga la reacciónla adición de 50 l de la solución de parada (proporcionado en el kit) a cada pocillo.
- Medir la absorbancia a 490 nm.
- Utilice las siguientes fórmulas para calcular el% de fuga LDH. Las densidades ópticas a continuación se corrigen restando a cabo una lectura de OD en blanco de un único pozo que contiene PBS, sustrato y solución de paro.
LDH en medios = (Media OD492) x (factor de dilución media) x (volumen de los medios de comunicación) * Ya que por lo general no es necesario diluir las muestras de los medios, el factor de dilución será lo más a menudo equal1.
Total LDH = ((Lysate OD 490) x (factor de dilución de lisado) x (volumen de suspensión celular)) + ((Media OD 490) x (factor de dilución) x (volumen de los medios de alícuotas para el muestreo))
5. Infectar las células acinares pancreáticas con Adenovirus
- Prepararcélulas acinares pancreáticas como se describe en la sección 3.
- Siguiendo paso 3.12, añadir 10 7 unidades infecciosas (IDU) de adenovirus a la suspensión de células y se incuba durante 30 min a 37 ° C.
- Uniformemente la placa 2 ml de la suspensión celular en una placa de 6 pocillos.
- Para la mayoría de las construcciones de expresión, las células deben estar infectadas adecuadamente dentro de 18 horas, y para algunos luciferase construcciones, sólo dentro de 6 horas.
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Representative Results
Un ejemplo de las mediciones del calcio de células acinares en respuesta a estímulos fisiológicos se proporciona en la Figura 3. Las células acinares se cargaron con el colorante de calcio Fluo-4 y se perfundieron con el análogo de acetilcolina carbacol (CCh; 1 M)) 8. Las células respondieron en la forma de una onda de calcio que se inicia en la región apical y se propaga a la región basolateral 3,9. Trazados representativos se muestran en la Figura 3B muestran el patrón típico de pico meseta comúnmente observados con 1 mM carbachol. Por el contrario, el uso de dosis submáximas del análogo de ceruleína colecistoquinina (22:00) produce respuestas de calcio oscilatorios (Figura 4) 10.
La fuga de LDH de las células acinares en respuesta a agonistas que inducen la pancreatitis se muestra en la Figura 5. Aquí demostramos aumentos dependientes de la concentración en pérdida de LDH en presencia de ceruleína, carbacol, o tque la bilis ácido taurolitocólico ácido 3-sulfato (TLCS). Las concentraciones necesarias para inducir la fuga máxima de LDH son consistentes con las requeridas para inducir la activación de la proteasa intra-acinares y la señalización del calcio patológicos, que sugiere que estos acontecimientos pueden conducir a lesiones.
Las células acinares se infectaron con un adenovirus indicador de luciferasa, que es impulsado por el promotor para un factor de Cn efector corriente abajo, nuclear de células T activadas (NFAT; Figura 6A). Nosotros proporcionamos datos representativos validación de nuestro método de infección, lo que demuestra la concentración-y dependiente del tiempo aumentos en la actividad de NFAT-luciferasa en la presencia de TLCS (Figuras 6B y 6C).
Figura 1. Imágenes representativas de células acinares pancreáticas folguientes diversas preparaciones. (A) Las células acinares preparados para Ca 2 + mediciones, como se visualiza con un aumento de 630X. La fila superior representa microscopía de campo claro, la fila inferior representa las células acinares cargadas con el Ca 2 + colorante Fluo-4 y se visualizó mediante microscopía de fluorescencia. (B) Las células acinares preparados para ensayos de citotoxicidad, como visualizado con un aumento de 400X.
Figura 2. . La cámara de perifusion (A) La cámara se compone de tres capas:. Una base de metal, una junta de goma, y una cubierta de plástico (B) La junta de goma se coloca en la parte superior de la base de metal y un cubreobjetos de 22x22 mm, que contiene las células se colocan hacia arriba en la parte superior de la junta de goma. La cubierta de plástico se atornilla a la base de metal y un cubreobjetos de 18x18 mm se coloca en la parte superior. (C) La cámara es luegofijado a la platina del microscopio. Tubo de ensayo, que contiene tampón o agonista, se introducen en las entradas situadas en el borde de la cámara (flecha). Tubería separada conduce a un vacío (cabeza de flecha).
Figura 3. Una señal de calcio pico meseta típica a la estimulación con carbacol (1 M). (A) De izquierda a derecha: vista de campo claro de un acino marcados en el (A) pical y (B) asolateral regiones de interés a partir de una célula acinar. Se cargaron las células con el indicador de calcio Fluo-4 (5 M). Tras la estimulación con carbacol fisiológica (1 M; Ach analógicas), las imágenes siguientes muestran el inicio de la señal de calcio en la región apical seguido por propagación a la región basal (B) Cada imagen paneles (1-4), corresponde a un marco. a lo largo de un representante de rastreo de cambio en la fluorescencia con el tiempo para cada región de interés. Las imágenes sonrepresentado en pseudocolor con una escala de colores (parte inferior derecha). Las flechas izquierda y derecha muestran el tiempo de la primera subida de calcio en las regiones apicales y basales, respectivamente. Esta cifra fue publicado originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. (Orabi AI, Shah AU, Muili K., Luo Y., Mahmood SM, Ahmad A., A. Reed, Husain SZ etanol aumenta la activación de la proteasa inducida por carbacol y acelera las ondas de calcio en forma aislada acinos pancreáticos de rata. The Journal of Biological Chemistry , 2 86, 14090-14097 (2011)).
La Figura 4. Una oscilación típica de calcio a la estimulación ceruleína (22:00). (A) Cambios en el conjunto de calcio citosólico de células se midieron una vez por segundo por time-lapse microscopía confocal utilizando el calcio colorante Fluo-4 / AM. Las imágenes se representan en pseudocolor con un color scale (arriba a la derecha). (B) Representante parcela de fluorescencia con el tiempo se registraron a partir de una sola célula tratada con ceruleína (22:00) a un pH de 7,4. Esta cifra fue publicado originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. (Reed AM, Husain SZ, Lanzador E., Alexandre M., A. Shah, Gorelick FS, Nathanson MH bajo pH extracelular induce daños en el páncreas acinar celular por calcio Mejoramiento de Señalización The Journal of Biological Chemistry, 286, 1919-1926 ( 2011)).
Figura 5. Medición de lesión de las células a partir de células acinares tratados con diversos agonistas que inducen la pancreatitis. En las células acinares aisladas, lactato deshidrogenasa fugas (LDH) se utilizó como un biIndicador ochemical de lesiones. Células acinares aisladas fueron tratadas con diferentes concentraciones de (A) ceruleína (1-100 nM) (B) carbacol (1 mM -1 mM) y (C) TLCS (50-500 mM), y% de fuga de LDH se midió después de 2 hora (N = 3). #, *, P <0,05 en comparación con el control y la TLCS solo, respectivamente.
La Figura 6. Medición de la actividad de luciferasa en las células acinares pancreáticas infectadas con adeno-NFAT-luciferasa. (A) Esquema para la infección de las células acinares pancreáticas de ratón primarias con adenoviral NFAT-luciferasa. (B) Administración de TLCS (5-500 mM) inducida por la actividad NFAT-luciferasa. (C) demostrar Evolución temporal de acumulación de la luminiscencia con TLCS (500 M) se administran en un 6hr período. (N = 3). *, #, P <0,05, en relación con el control o TLCS solo, respectivamente.
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Discussion
El método de aislamiento de células y ensayos posteriores representadas aquí representan poderosas herramientas con las que estudian las características fisiológicas y fisiopatológicas del páncreas exocrino. El método para aislar células acinares pancreáticas dispersos fue descrita por primera vez por Amsterdam y Jamieson en 1972 11. Los métodos que aquí se presentan han sido adaptados de los métodos de aislamiento más recientes descritos por Van Acker et al 12. Aunque estas técnicas son altamente reproducible y fácil de aprender, hay varias características críticas a cada método que debe ser llevada a cabo con precisión. La comprensión de estos detalles técnicos permitirá una aplicación más fácil la resolución de problemas y la mejora.
En la preparación de las células para la medición de calcio, hemos encontrado que el páncreas de los roedores más jóvenes produce resultados más consistentes. Los acinos una distribución más uniforme, posiblemente debido a que contienen menos tejido fibro-graso. Para Ca 2 + mediciones, preparamos acinos más pequeño para imágenes de células único óptimo. Esto requiere una concentración mayor de colagenasa (1,1 mg / ml o 200 U / ml) que el utilizado para las mediciones de LDH. Para las mediciones de DHL, preparamos mayor acinos porque este método causa menos daño al inicio del estudio. La preparación, por lo tanto, recibe una concentración inferior colagenasa (0,5 mg / ml o 91 U / ml).
Para Ca 2 + mediciones, es fundamental que las células se cultivaron en cubreobjetos lavados con ácido. El propósito de la ácido-lavado es proporcionar una superficie limpia, así como las interacciones electrostáticas que permitan la máxima adherencia de los acinos. Célula Tak (BD Bioscience) se puede utilizar en lugar de o además de este método. Además, es fundamental que el Ca 2 + colorante se carga en un tampón de incubación libre de BSA en orden (1) para evitar que el colorante de unión a BSA y (2) para permitir que los acinos a que se adhieran al máximo a los cubreobjetos lavados con ácido .
t "> La cámara de perfusión descrito fue diseñado. cámaras comerciales personalizados y sistemas de flujo, sin embargo, están disponibles a través de Warner Instrumentos. Además de la perfusión, la creación de un vacío regulado correctamente es un factor crítico en la prevención de las células acinares de ser succionado fuera de la cubreobjetos.Cuando la medición de señales de calcio de las células acinares pancreáticas, se describe el uso de un microscopio confocal. Confocal de imagen utiliza un agujero de alfiler en frente de un tubo fotomultiplicador con el fin de eliminar la luz desde arriba o por debajo del plano focal. En contraste, formación de imágenes de campo amplio detecta la luz a lo largo de la trayectoria de excitación de la muestra, lo que permite fuera de la luz de enfoque (es decir, luz por encima y por debajo del plano de foco deseada) a contaminar la imagen de fluorescencia de la muestra. La ventaja de la microscopía confocal de más de campo amplio es que permite para-sección delgada de imágenes de una muestra, así como la reconstrucción 3D de las rebanadas ópticos recogidos a lo largoun eje Z. Además, la microscopía confocal proporciona sistemas de recogida de alta velocidad que pueden capturar los cambios rápidos en la fluorescencia de calcio utilizando un disco giratorio, escáner lineal, escáner sweptfield o regiones incluso se redujo de un escáner de punto.
Cambios espaciales y temporales en los patrones de señalización de calcio, como las ondas y oscilaciones, respectivamente, pueden ser valorados con fiabilidad mediante el cálculo 0 F / F, pero esto no es un verdadero indicador de la [Ca 2 +]. Las mediciones cuantitativas de [Ca2 +] se puede calcular utilizando sola longitud de onda de excitación y de emisión de los tintes de calcio tales como Fluo-4, aunque se pueden producir errores en estas mediciones debido a photobleaching y la pérdida de colorante 13,14. [Ca2 +] se puede medir con más precisión mediante el uso de colorantes radiométricos, tales como Fura2 o Indo1 15, pero esto no es práctico en la mayoría de los microscopios confocales, debido a la exigencia de un láser UV para la excitación. Por otro lado, concomitant uso de Fluo-3 o Fluo-4 y Fura-rojo puede permitir una relación de imagen usando la línea de excitación de 488 nm que está presente en la mayoría de los microscopios confocales 16.
Pérdida de LDH es una herramienta sensible para la medición de lesión de las células acinares 7,17. Otro método complementario es de propidio la captación de yodo 18. Las infecciones por adenovirus lograr altas tasas de infección en cultivos de acinos 19. Puede necesitar ser valorada La concentración del virus. Además, es útil para proporcionar las condiciones de control comparables en el que también está infectado otra construcción adenoviral irrelevante. La mayoría de los estudios de infección duran menos de 12 horas. Sin embargo, durante períodos más largos, los antibióticos pueden ser añadidos a los medios de comunicación DMEM-F12 al principio.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención DK083327 y DK093491 (a SZH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
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- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells. Embo J. 16, 242-251 (1997).
- Husain, S. Z., et al. The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).
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