Summary
Опишем воспроизводимый способ получения мышь ацинарных клетках поджелудочной железы у мыши с целью изучения ацинарных клетки кальция сигналов и повреждение клеток с физиологически и патологически соответствующие стимулы. Способ аденовирусной инфекции этих клеток также предоставляется.
Abstract
Клетки поджелудочной ацинарным является основной паренхимы клетки поджелудочной железы внешней секреции и играет главную роль в секреции ферментов поджелудочной железы в проток поджелудочной железы. Это также место для начала панкреатита. Здесь мы описываем ацинарных клеток выделяют из цельной ткани поджелудочной железы и внутриклеточных сигналов кальция измерены. Кроме того, мы описываем методы трансфекции эти клетки с аденовирусные конструкции, а затем измерение утечки лактатдегидрогеназы, маркер повреждения клеток, при условиях, которые индуцируют ацинарных повреждение клеток в пробирке. Эти методы обеспечивают мощный инструмент для характеристики ацинарным клеточной физиологии и патологии.
Introduction
Динамические изменения в цитозольного кальция являются необходимыми для физиологических и патологических событий ацинарных клетки. Эти различные эффекты кальция, как полагают, в результате различных пространственных и временных форм сигналов кальция 1. Например, фермент и секрецию жидкости из ацинарных клеток связаны с кальцием шипы из ограниченной области апикального полюса, где секреции происходит 2. В отличие от глобальной волны кальция последующим интенсивным неколебательных сигналов кальция связан с ранним патологических событий, которые ведут к остром панкреатите 3,4. Они включают в себя внутри-ацинарным активации протеаз, снижение секреции ферментов и повреждение ацинарным клетки. Наша лаборатория использует изолированы ацинусов поджелудочной железы для изучения этих ранних патологических событий, которые приводят к болезни как в естественных условиях и в пробирке 5-7. Методы подробно описаны здесь описаны выделение первичной ацинарных клетках с целью измерения суtosolic уровни кальция и повреждение клеток. Способ аденовирусной инфекции этих клеток также предоставляется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка ацинарных клетках поджелудочной железы для Кальций изображений
- Подготовка HEPES инкубационного буфера, содержащего 20 мМ HEPES, 95 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 0,6 мМ MgCl 2, 1,3 мМ CaCl 2, 10 мМ глюкозы, 2 мМ глутамина и 1 × минимальный Дульбекко несущественных аминокислот. Отрегулируйте окончательного решения до рН 7,4 с помощью NaOH.
- Подготовка буфера BSA инкубации добавлением BSA (1% вес / об окончательном) к 25 мл буфера HEPES инкубации (описано выше).
- Подготовьте буфер коллагеназой добавлением 1,1 мг / мл (200 единиц / мл) типа-4 коллагеназы и 1 мг / мл соевого ингибитора трипсина, в 6 мл BSA инкубационном буфере (описано выше).
- Кислотно-мыть 22x22 мм покровные стекла путем погружения в двух частях HNO 3 и одной части HCl в течение 2 часов. Затем перелить использованием DI воды и хранить в 70% этанола.
- Усыпить одна мышь СО 2 удушья. Orient животного в лежачем положении, а также подготовить брюшной поверхности НКУAning с 70% этанола. Выполните лапаротомии, чтобы разоблачить брюшной полости. Рассеките из поджелудочной железы и немедленно промыть в небольшой вес лодки, содержащий 6 мл коллагеназы буфера пищеварения.
- Отсечь любые большие куски жира или видимые кровеносные сосуды, затем снимите 5 мл коллагеназы буфера пищеварения и добавить его обратно в 15 мл коническую трубку.
- Использование тонкими ножницами рассечение фарш поджелудочной железы в малом весе лодки, содержащий 1 мл коллагеназы буфера пищеварения. Пропустить через мясорубку, пока полученный раствор не появится равномерно рассеяны.
- Передача фарш продукт 125 мл колбу Эрленмейера пластиковых и добавьте оставшиеся 5 мл коллагеназы буфера пищеварения в контейнер. Убедитесь, что ткань полностью погружен в буфер.
- Поместить колбу в 37 ° С водяной бане и трясти на 90 оборотов в минуту в течение 30 мин. За этот короткий период простоя, подготовить кальция активирующих агонистов (например церулеин, карбахол) и промойте 22x22 мм промытого кислотой крышкойскользит дистиллированной водой. Сухой, а затем поместить на вершине плоскую поверхность выстлана фильма лаборатории.
- После 30 мин дайджест завершения передачи задняя подвеска в 15 мл коническую трубку и позволяют клеткам, чтобы обосноваться. Тщательно пипетки из буфера коллагеназой и заменить 6 мл инкубационного буфера BSA. Энергично встряхнуть трубку вручную в течение 10 секунд для диспергирования клеток в небольших кластеров. Сразу же после встряхивания, удалите все большие, плавающего мусора из нерешенных СМИ.
- Разрешить оставшиеся клетки осесть и обменять СМИ со свежими инкубационного буфера BSA.
- Повторите шаг 1,11 раза, пока суспензия не будет состоять только из небольших кластеров, которые являются лишь тонко видны невооруженным глазом. Клетки должна напоминать тем, которые изображены на рисунке 1А (верхний ряд).
- Снимите буфера BSA инкубации и заменить инкубационного буфера HEPES.
- Подготовьте 750 мкм, 100X запас Fluo-4 утра в 10% ДМСО.
- Загрузите клеток в 15 мл коническую пробирку, содержащую суспензию клеток и БСА без HEPES буфере для инкубации. Чтобы сделать это, добавьте соответствующий объем (разбавление 1:100) исходного раствора к клеточной суспензии. Затем пластина 500 мкл этой суспензии на каждой 22x22 мм покровным.
- Держите покровные в темноте при комнатной температуре. Возьмите первый Ca 2 + измерения 30 мин после загрузки. Краситель, автоматически удаляется из среды после начала перфузии, который должен происходить через 30 мин после красителем.
2. Измерение кальция в клетках поджелудочной железы Ацинарных
- Промыть каждую перфузии настройки деионизированной водой и залить соответствующее количество буфера или агониста. Премьер каждый шприц с буфером или агонисты, чтобы обеспечить надлежащий поток. Зажим шприцы с кольцом стоят примерно 1-2 футов над столике микроскопа.
- Используйте тонкий пинцет, чтобы тщательно понять от его края одного покровного суспензии, содержащей клетки. Наклонить крышкускольжения 45 °, и позволить избыточный буфер бежать. Поместите покровное на верхней части резиновой прокладкой с клетками в верхней части покровного, и собрать камеру (фиг.2А и 2В).
- Закрепите перфузии камеры на сцену и вставить трубку, которая содержит буфер в первом входе камеры (рис. 2С). Включите шприц, содержащий буфер и позволяют буфера заливать по всей поверхности покровного стекла. Как только буфер достигает противоположного конца камеры, вставьте вакуумной линии в вакуумный впуск. Вставить любой другой трубы (содержащий агонист, ингибиторы и т.п.) в их соответствующем положении по длине камеры.
- Визуализация клеток с использованием либо 200X или 400X, 1,4 числовой апертуры объектива и аргонового лазера для возбуждения Fluo-4 утра красителя при длине волны 488 нм (рис. 1А, внизу). Настройки мощности лазерного должна быть отрегулирована таким образом, чтобы фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) Не насыщается излучаемого света. Кроме того, напряжение на ФЭУ должна быть оптимизирована для максимальной детектирования света.
- Длинный-проход излучения сигналов> 515 нм собираются в кадр скорости 2-5 сек / кадр для визуализации медленных колебательных моделей и 0,2-0,3 сек / кадр для визуализации быстрее, глобальные волны кальция (рис. 3 и 4).
- После завершения визуализации, закройте шприцы и удалить все трубки. Разберите камеру и повторите шаги 2.2-2.4.
- Сбор данных в виде числовых значений интенсивности флуоресценции с течением времени и передачу изображения J (программный пакет, предоставляемый как бесплатное программное обеспечение Национальным институтом здоровья и могут быть найдены в http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
- Просмотр в режиме реального времени изображения клеток и определить регионах, представляющих интерес (трансформирования, т.е. верхушечные, базолатеральным, ядерной и т.д.)
- Приобретать интенсивности флуоресценции для этих областей исследования и Represent как интенсивность флуоресценции / исходная интенсивность флуоресценции (т.е. F/F0).
- Создание обводка путем построения F / F 0 против времени. В дополнение к обводка, представитель изображения, как правило, предоставляются и отображаются с помощью псевдо.
3. Подготовка ацинарных клетках поджелудочной железы для анализа клеточной травмы
- Теплый DMEM F-12 среды (без фенола красного) до 37 ° С.
- Добавить BSA (0,1% вес / об окончательном) и HCl (50 мкМ окончательный) в DMEM F-12 среды.
- Аликвоты 50 мл DMEM в коническую трубку.
- Подготовьте коллагеназы буфер добавлением 0,5 мг / мл (12 ед / мл), коллагеназы типа IV к 10 мл DMEM, дополненный F-12 среды.
- Усыпить одна мышь СО 2 удушья. Orient животного в лежачем положении, а также подготовить брюшной поверхности путем очистки с 70% этанола. Выполните лапаротомии, чтобы разоблачить брюшной полости. Рассеките из поджелудочной железы и немедленно промыть в небольшой лодке с весомontaining 6 мл коллагеназы буфера.
- Фарш ткани с помощью тонких ножниц вскрытие в течение 3-5 мин или пока полученный раствор появляется равномерно рассеяны.
- Передача измельченной ткани в 125 мл коническую колбу с 5 мл коллагеназы дополнительный буфер, то места в 37 ° С водяной бане при встряхивании со скоростью 90 оборотов в минуту в течение 5 мин.
- Удалить из шейкера, позволяют клеткам кратко осесть, и обмен с 5 мл свежего буфера коллагеназы. Тогда инкубировать в течение дополнительных 35 мин при 37 ° С на водяной бане при встряхивании со скоростью 90 оборотов в минуту.
- Энергично ресуспендируйте дайджест помощью пипетки, пока суспензия не выглядит гомогенной без очевидных сгустки клетки. Затем осторожно пипетки клеточной суспензии через предварительно увлажненный нейлоновой сеткой в коническую колбу.
- Энергично пипетки дополнительно 3 мл свежей среды DMEM F-12 среды (коллагеназы) через сетку, для того, чтобы заставить через любые оставшиеся клетки.
- Добавьте еще 6-10 мл DMEM F-12 средств массовой информации иLlow клетки урегулировать в течение 2-3 мин. Повторите этот шаг дважды, и удалить супернатант После последней промывки.
- Добавить свежий DMEM F-12 среды, ресуспендирования клеток, и пластина 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 48-луночного планшета для культуры ткани. Клетки должна напоминать тем, которые изображены на рисунке 1b.
- Позволить плате сидеть в 37 ° С водяной бане при 90 оборотах в минуту в течение 5 минут перед добавлением агонистов.
- Стимулировать клетки с различной агонистов в течение 2-4 часов.
- Наклон пластины под углом, чтобы позволить клеткам осесть и осторожно пипеткой из аликвоты среды (обычно 100 мкл) и флэш-замораживание в жидком азоте.
- Ледяная вспышка оставшейся суспензии клеток. Флэш замораживания не является необходимым для измерения ЛДГ. В качестве альтернативы образцы можно хранить на льду, если они будут проанализированы в тот же день или хранятся в -20 ° C для длительного хранения.
4. Измерение лактата дегидрогеназы утечки
- Развести подложки ЛДГ (который предусмотрен в комплекте) с 12 мл буфера для анализа (также предусмотрено).
- Разморозить замороженные клеточной суспензии и образцы печатных носителей в ванну с водой при комнатной температуре.
- Пластина 50 мкл каждого образца среды в 96-луночный планшет.
- К клеточной суспензии, добавляют необходимый объем 10X буфера для лизиса, так что конечная концентрация 1X. Кратко Vortex и инкубировать при 37 ° С в течение 60 мин.
- Лизированных Центрифуга образцов при 250 мкг в течение 4 мин, чтобы мусор осадок клеток.
- Для клеточных лизатов, пластина 50 мкл разведения 1:10 в каждую лунку 96-луночного планшета.
- Добавить 50 мкл восстановленного субстрата в каждую лунку, инкубировать пластины в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Остановить реакциюдобавлением 50 мкл стоп-раствора (входящих в комплект) в каждую лунку.
- Измерьте оптическую плотность при 490 нм.
- Используйте следующие формулы для расчета утечки% ЛДГ. Оптические плотности ниже корректируются путем вычитания из пустой чтения OD от лунку, содержащую только PBS, субстрат, и остановить решение.
ЛДГ в СМИ = (Media OD492) х (коэффициент разбавления СМИ) х (объем носителя) * Потому что это обычно не требуется, чтобы разбавить образцы печатных носителей, коэффициент разбавления чаще всего equal1.
Всего ЛДГ = ((Lysate OD 490) х (коэффициент разбавления лизата) х (объем в клеточной суспензии)) + ((Media OD 490) х (коэффициент разбавления) х (т. СМИ аликвоты для отбора проб))
5. Заражение ацинарных клетках поджелудочной железы с аденовирусом
- Готовитьацинарных клетках поджелудочной железы, как описано в разделе 3.
- Следующим шагом 3,12, добавляют 10 7 инфекционных единиц (IFUs) аденовируса к суспензии клеток и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
- Равномерно пластина 2 мл клеточной суспензии в 6-луночный планшет.
- Для большинства конструкций выражения, камеры должны быть адекватно инфицированными в течение 18 часов, а для некоторых конструкций люциферазы, только в течение 6 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример измерений ацинарных клетки кальция в ответ на физиологические стимулы обеспечивается на рисунке 3. Ацинарных клетки нагружали красителем кальция Fluo-4 и перфузию ацетилхолина аналог карбахола (ЦХ; 1 мкМ)) 8. Клетки ответ в виде кальция волна, которая инициирует в апикальной области и распространяется к базолатеральной области 3,9. Представитель обводка показано на фигуре 3В показывают типичные пика плато картина обычно наблюдается с 1 мкМ карбахола. С другой стороны, использование субмаксимальной дозы холецистокинина аналог церулеин (10 вечера) дает колебательный ответов кальция (рис. 4) 10.
Утечка ЛДГ из ацинарных клетках в ответ на панкреатит вызывающие агонистов показано на рисунке 5. Здесь показано зависимое от концентрации увеличение утечек ЛДГ в присутствии церулеин, карбахол или третОн желчных кислот taurolithocholic-3 кислоты сульфат (TLCS). Концентрациях, необходимых, чтобы вызвать максимальную утечку ЛДГ соответствует той, необходимых, чтобы вызвать внутри ацинарным активации протеазы и патологических сигнализации кальция, предполагая, эти события могут привести к травмам.
Ацинарных клетки инфицировали аденовирусом репортер люциферазы, то есть под контролем промотора на выходе Cn эффектора ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT; фиг.6А). Мы предлагаем репрезентативные данные проверки наши инфекции метод, демонстрируя концентрации и зависящие от времени увеличение NFAT-активности люциферазы в присутствии TLCS (фиг. 6В и 6С).
Рисунок 1. Типичные изображения панкреатических ацинарных клетках следующимLowing различных препаратов. (A) Ацинарных клетки, полученные для Ca 2 + измерений, а визуализировали при увеличении 630X. Верхний ряд изображает яркие микроскопии, нижний ряд изображает ацинарных клеток, нагруженных Са 2 + красителем Fluo-4 и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. (B) Ацинарных клетки, полученные на цитотоксичность, как визуализировали при 400-кратном увеличении.
Рисунок 2. . Perifusion камеру (А) камера состоит из трех слоев:. Металла; резиновой прокладкой и пластиковой крышкой (B) резиновая прокладка размещена на верхней части основного металла и покровное 22х22 мм, содержащие клетки помещают вверх на верхней части резиновой прокладкой. Пластиковая крышка накручивается на металлическую базу и 18x18 мм покровного находится на вершине. (C) Затем камеракрепится к столику микроскопа. Трубки, содержащие буфер или агонисты, подают в губы расположен на берегу палаты (стрелка). Отдельные трубки приводит к вакуум (стрелки).
Рисунок 3. Типичный пик плато кальций сигнал при стимуляции карбахола (1 мкМ). (A) слева направо; Bright View области ацинусе помечены на (A) Pical и (B) asolateral регионах, представляющих интерес с ацинарным клетки. Клетки были загружены индикатора кальция Fluo-4 (5 мкМ). При стимуляции физиологических карбахола (1 мкМ; Ach аналог), последующие изображения показывают инициирования кальций сигнала в апикальной области последующим распространением в базальной области (В) Каждое изображение панелей (1-4), соответствующий кадру. вместе представитель отслеживание изменений флуоресценции с течением времени для каждой области, представляющей интерес. Изображенияпредставлены в псевдоцвете с цветовой шкалой (внизу справа). Левая и правая стрелки показывают время первого повышения кальция в апикальных и базальных областях соответственно. Эта цифра была первоначально опубликована в журнале Biological Chemistry. (Orabi А.И., Шах AU, Muili К., Ло Ю., SM Махмуд Ахмад А., Рид А., Хусейн SZ Этанол повышает карбахолом индуцированной активации протеазы и ускоряет кальция волн в изолированном ацинусов поджелудочной железы крысы. Журнал биологической химии , 2 86, 14090-14097 (2011)).
Рисунок 4. Типичные колебания кальция при стимуляции церулеин (10 вечера). (А) изменения в целой клетки цитозольные кальция измеряли один раз в секунду на покадровой конфокальной микроскопии с использованием кальция красителя Fluo-4 / AM. Изображения представлены в псевдоцвете с цветом сКейл (вверху справа). (B) представитель участок флуоресценции с течением времени были записаны из одной клетки обрабатывают церулеин (10 вечера) при рН 7,4. Эта цифра была первоначально опубликована в журнале Biological Chemistry. (Reed А.М., Хусейн SZ, Метатель Е., Александр М., Шах А., Горелик FS, Натансон MH Низкий рН внеклеточной Индуцирует ущерб в сотовых ацинуса поджелудочной железы путем усиления сигналов кальция Журнал биологической химии, 286, 1919-1926 ( 2011)).
Рисунок 5. Измерительной ячейки травмы от ацинарных клетках, обработанных различными панкреатит вызывающие агонистов. В отдельных ацинарных клетках, лактатдегидрогеназы (LDH), утечка была использована в качестве бирадиохимический показатель травмы. Изолированные ацинарных клетках обрабатывали различными концентрациями (A) церулеин (1-100 нМ) (B) карбахола (1 мкМ -1 мМ) и (С) TLCS (50-500 мкм), и утечка% LDH измеряли через два HR. (N = 3). #, * Р <0,05 по сравнению с контролем и TLCS один, соответственно.
Рисунок 6. Измерение активности люциферазы в панкреатических ацинарных клетках, инфицированных адено-NFAT-люциферазы. (A) схемы для заражения первичным мыши панкреатических ацинарных клеток с аденовирусной NFAT-люциферазы. (B) Администрация TLCS (5-500 мкм) индуцированное NFAT-активности люциферазы. (С) Время конечно демонстрируя накопления люминесценции с TLCS (500 мкм) передано 6HR период. (N = 3). *, #, P <0,05, по сравнению с контрольной или TLCS один, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способ выделения клеток и последующего анализа изображен здесь представляют собой мощные инструменты, с которыми изучать физиологические и патофизиологические особенности экзокринной поджелудочной железы. Способ выделения дисперсных ацинарных клетках поджелудочной железы был впервые описан Джеймисон Амстердаме и в 1972 году 11. Методы, представленные здесь, были адаптированы из последних изоляции методами, описанными Ван Акер и коллеги 12. Хотя эти методы являются высоко воспроизводимым и легко изучена, есть несколько критических функций каждого метода, которое должно быть выполнено точно. Понимание этих технических деталей позволит легче устранения неисправностей и улучшенные приложения.
При подготовке клеток для измерения кальция, мы обнаружили, что поджелудочная железа от молодых грызунов дает более надежные результаты. Ацинусах распределялись более равномерно, возможно, потому что они содержат меньше фиброзно-жировой ткани. Для Са 2 + измерениях, мы готовим меньше ацинусов для оптимальной визуализации одной клетке. Это требует более высокой концентрации коллагеназы (1,1 мг / мл или 200 ед / мл), чем для измерения LDH. Для измерений ЛДГ, мы готовим большую ацинусах потому что этот метод вызывает меньше травм в начале исследования. Препарат, таким образом, получает более низкой концентрации коллагеназы (0,5 мг / мл и 91 Ед / мл).
Для Ca 2 + измерениях, то очень важно, что клетки высевают на быть промытый кислотой покровные. Целью кислотно-мыть, чтобы обеспечить чистую поверхность, а также электростатических взаимодействий, которые позволят максимальное соблюдение ацинусов. Сотовые Так (BD Bioscience) могут быть использованы вместо или в дополнение к этому методу. Кроме того, важно, что Са 2 + краситель загружают в BSA без инкубационном буфере в порядке (1) для предотвращения красителя с привязкой к БСА, и (2), чтобы позволить ацинусов максимально придерживаться промытого кислотой покровные .
Т "> перфузии камеры описана была специально разработана. Коммерческая камер и проточные системы, однако, доступны через инструменты Warner. Помимо перфузии, создание надлежащего регулирования вакуума является решающим фактором в предотвращении ацинарным ячеек от отсасывают покровное.При измерении кальция сигналы от ацинарных клетках поджелудочной железы, опишем использованием конфокальной микроскопии. Конфокальной изображения использует Пинхол перед ФЭУ с целью устранения свет сверху или снизу фокальной плоскости. В противоположность этому, широким полем изображений обнаруживает свет в течение возбуждения путь образца, что позволяет не в фокусе света (то есть свет выше и ниже желаемой плоскостью фокуса) загрязнять флуоресценции изображение образца. Преимущество конфокальной микроскопии над широким полем является то, что она позволяет тонкого сечения визуализации образца, а также реконструкции 3D оптических ломтиками собраны вместеZ-оси. Кроме того, конфокальной микроскопии обеспечивает высокоскоростной системы сбора, который может захватить быстрые изменения в кальции флуоресценции с помощью вращающегося диска, линейный сканер, Sweptfield сканер, или даже сузился регионов с точки сканера.
Пространственные и временные изменения в кальция сигнальные структуры, такие как волны и колебания, соответственно, может быть надежно измерена с помощью F / F 0 расчетов, но это не является истинным показателем [Ca 2 +]. Количественные измерения [Са 2 +], может быть рассчитана с использованием одной длины волны возбуждения и излучения кальция красители, такие как Fluo-4, хотя могут возникать ошибки в этих измерений из-за фотообесцвечивания и краситель потери 13,14. [Ca 2 +] можно измерить более точно, используя радиометрические красители, такие как Fura2 Indo1 или 15, но это непрактично, на большинстве конфокальный микроскоп из-за требования из УФ-лазера для возбуждения. С другой стороны, concomitaNT использование Fluo-3 или Fluo-4 и Фура-красный может позволить соотношение визуализации с использованием 488 нм возбуждения линии, которая присутствует на большинстве конфокальный микроскоп 16.
ЛДГ утечки является чувствительным инструментом для измерения ацинарным повреждения клеток 7,17. Другой дополнительный метод заключается пропидий поглощение йодида 18. Аденовирусной инфекции достичь высоких темпов инфекции в культурах ацинусах 19. Концентрацию вирусов может потребоваться титрование. Кроме того, было бы полезно обеспечить сопоставимых условиях управления, в котором другая значения аденовирусной конструкции также инфицированы. Большинство наших инфекции обучение длится до 12 часов. Однако в течение более длительных периодов, антибиотики могут быть добавлены в DMEM-среды F12 в самом начале.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при поддержке Национального института здоровья Грант DK083327 и DK093491 (в СЖ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy. Embo J. 11, 1623-1629 (1992).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells. Embo J. 16, 242-251 (1997).
- Husain, S. Z., et al. The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).
- Raraty, M., et al. Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).
- Orabi, A. I., et al. Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).
- Shah, A. U., et al. Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).
- Muili, K. A., et al. Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Orabi, A. I., et al. Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini. J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).
- Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).
- Reed, A. M., et al. Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling. J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Van Acker, G. J., et al. Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis. J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells. J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).
- Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini. Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
- Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red. Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).
- Saluja, A. K., et al. Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini. Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).
- Husain, S. Z., et al. Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo. Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).
