Summary
Biz fizyolojik ve patolojik ilgili uyaranlara ile asiner hücre kalsiyum sinyalleri ve hücresel hasarı incelemek amacıyla bir fare fare pankreas asiner hücre hazırlama tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücrelerin, adenoviral enfeksiyon için bir yöntem de sağlanmaktadır.
Abstract
Pankreas asiner hücre ekzokrin pankreasın ana parankimal hücre ve pankreatik kanal içine pankreatik enzimlerin salgılanmasını birincil rol oynar. Ayrıca pankreatit başlatılması için bir sitedir. Burada bütün pankreas dokusu ve hücre içi kalsiyum sinyallerinden asiner hücreler izole nasıl tarif ölçülür. Buna ek olarak, in vitro olarak hücre hasarının neden asinar koşullarında, Adeno yapıları bu hücreleri transfekte etmek, ve daha sonra laktat dehidrojenaz, hücre hasarının işareti olan kaçak ölçme teknikleri tarif eder. Bu teknikler asiner hücre fizyolojisi ve patolojisi karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Sitozolik kalsiyum dinamik değişiklikler fizyolojik hem de patolojik asiner hücre olayları için gereklidir. Kalsiyumun bu farklı etkileri 1 sinyal kalsiyum farklı mekansal ve zamansal desen kaynaklandığı düşünülmektedir. Örneğin, asinar hücreden enzim ve sıvı salgılamadan yerine 2 alır apikal kutbunun bir kısıtlı bölge kalsiyum sivri bağlantılıdır. Buna karşılık, yoğun olmayan salınımlı kalsiyum sinyalleri tarafından izlenen bir küresel dalga kalsiyum akut pankreatit 3,4 yol patolojik erken olayları ile ilişkilidir. Bu içi asiner proteaz aktivasyonu, düşük enzim salgılanmasını ve asiner hücre hasarı içerir. Bizim laboratuvar in vivo ve in vitro 5-7 hem hastalığına yol bu erken patolojik olayları incelemek için izole pankreas acini kullanır. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntemler cy ölçmek amacıyla birincil asiner hücrelerin izolasyonu tariftosolic kalsiyum düzeyleri ve hücre hasarı. Bu hücrelerin, adenoviral enfeksiyon için bir yöntem de sağlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kalsiyum Görüntüleme için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması
- 20 mM HEPES, 95 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 0.6 mM MgCl2, 1.3 mM CaCl2, 10 mM glükoz, 2 mM glutamin, 1 x ve en az Eagle ortamının esansiyel olmayan amino asitler ihtiva eden HEPES inkübasyon tamponu hazırlayın. NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın, nihai çözelti.
- HEPES kuluçka tampon maddesi (yukarıda tarif edilmiştir), 25 ml BSA (% 1 w / v son) eklenerek bir BSA inkübasyon tamponu hazırlayın.
- 1.1 mg / ml (/ 200 adet mi) tip-4 kolajenaz ve 1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile 6 BSA kuluçka tampon maddesi (yukarıda açıklandığı gibi) ml ilave edilerek bir kollajenaz sindirim tamponu hazırlayın.
- İki parça HNO 3 ve 2 saat için, bir parça HCI daldırarak asitle yıkama 22x22 mm lamelleri. Daha sonra% 70 etanol içinde DI su ve mağaza ile süzün.
- CO 2 boğulma bir fare Euthanize. Orient yatar pozisyonda hayvan ve cle ile karın yüzeyi hazırlamak% 70 etanol ile Aning. Karın boşluğuna ortaya çıkarmak için bir laparotomi gerçekleştirin. Pankreas inceleyin ve hemen kollajenaz sindirim tampon 6 ml içeren küçük bir tartmak tekne durulayın.
- Yağ veya görünür kan damarlarının herhangi bir büyük parça parçalara ayır, sonra kollajenaz sindirim tampon 5 ml çıkarın ve 15 ml konik tüp geri ekleyin.
- Ince diseksiyon makas kullanarak kollajenaz sindirim tampon 1 ml içeren küçük tartı tekne pankreas kıyma. Nihai çözelti, eşit şekilde dağılmış görünene kadar kıyma.
- 125 ml'lik bir Erlenmeyer şişeye plastik kıyılmış ürünü aktarın ve konteyner kollajenaz sindirimi tampon kalan 5 ml ilave edilir. Doku tamamen tampon altında olduğundan emin olun.
- 37 ° C su banyosu içinde şişenin yerleştirin ve 30 dakika boyunca 90 rpm'de karıştırın. Kesinti bu kısa dönemde, kalsiyum aktive agonistleri (örneğin Caerulein, karbakol) hazırlamak ve 22x22 mm asitle yıkanmış kapak durulamaDI su ile fişleri. Kuru ve daha sonra laboratuvar filmi ile kaplı düz bir yüzeyin üzerine yerleştirin.
- 30 dakika özeti tamamlandıktan sonra, 15 ml konik tüp geri süspansiyonu transfer ve hücreler razı sağlar. Dikkatlice kollajenaz sindirim tampon dışarı pipetle ve BSA kuluçka tampon 6 ml ile değiştirin. Şiddetle küçük kümeler halinde hücreleri dağıtmak için 10 saniye boyunca elle tüp sallayın. Hemen sallayarak üzerine, huzursuz medyadan herhangi bir büyük, yüzen pislikleri temizleyin.
- Kalan hücreler yerleşmek ve taze BSA kuluçka tamponu ile medya alışverişi için izin verin.
- Süspansiyon çıplak gözle sadece ince görünür sadece küçük kümeleri oluşur kadar, iki kez 1.11 adımı tekrarlayın. Hücreler Şekil 1A (üst sıra) tasvir bu benzer.
- BSA kuluçka tamponu çıkarın ve HEPES inkübasyon tamponu ile değiştirin.
- 10% DMSO içinde bir 750 mcM, Fluo-04:00 arasında 100X stok hazırlayın.
- Hücre süspansiyonu ve BSA içermeyen HEPES inkübasyon tamponu içeren 15 ml'lik konik bir tüp içinde hücrelerin yerleştirin. Bunu yapmak için, hücre süspansiyonu için stok solüsyonu uygun bir hacmi (1:100 seyreltme) ekleyin. Her 22x22 mm lamel üzerine bu süspansiyon daha sonra plaka 500 ul.
- Oda sıcaklığında karanlıkta lamelleri tutun. İlk Ca 2 + ölçümleri yükleme sonra 30 dakika sürer. Boya otomatik boya yükleme sonra 30 dakika gerçekleşmesi gereken perfüzyon, başlangıç üzerine orta kaldırılır.
2. Pankreas Asiner Hücreler kalsiyum Ölçme
- DI suyla her perfüzyon kurulum yıkayın ve tampon ya da agonistinin uygun bir miktar ile doldurun. Doğru akışı sağlamak için tampon veya agonist ile Başbakan her şırınga. Bir halka şırınga kelepçe mikroskop sahne üzerinde yaklaşık 1-2 metre durmak.
- Dikkatle kenarından bir lamel içeren hücre süspansiyonu kavramak için ince cımbız kullanın. Kapağın eğin45 ° kayma ve aşırı tampon kaçıp sağlar. Lamel üzerine hücreler ile kauçuk conta üstüne lamel yerleştirin ve bölme (Şekil 2A ve 2B) birleştirin.
- Sahneye perfüzyon odasının Güvenli ve odası (Şekil 2C) ilk girişine tampon içeren boru takın. Tampon içeren şırınga açın ve tampon lamel tüm yüzey üzerinde serpmek sağlar. Tampon odasının karşı ucuna ulaştığında, sonra, vakum girişi ve bir vakum hattı yerleştirin. Odanın birlikte bunların uygun pozisyona başka bir boru (içeren agonist, inhibitörleri, vb) yerleştirin.
- 488 nm (Şekil 1A, alt) bir dalga boyunda Fluo-04:00 boya heyecanlandırmak için ya bir 200X veya 400X, 1.4 sayısal açıklık objektif ve argon lazer kullanarak hücrelerin gözünüzde canlandırın. Lazer güç ayarlarını ayarlanmalıdır şekilde photomultiplier tüp (PMT) Yayılan ışık ile doymuş değil. Buna ek olarak, PMT üzerindeki gerilim maksimum ışık algılama için optimize edilmesi gerekmektedir.
- > 515 nm uzun geçiş emisyon sinyalleri 2-5 çerçeve hızlarda toplanır sn, hızlı küresel kalsiyum dalgaları (Şekil 3 ve 4) görselleştirmek için yavaş salınımlı desen ve 0.2-0.3 sn / kare görüntülenmesi için / çerçeve.
- Görüntüleme tamamlandıktan sonra, şırınga kapatın ve tüm boru çıkarın. Odası ve adımları tekrarlayın 2.2-2.4 sökün.
- Resim J zaman ve transfer içinde floresan sayısal değerleri (Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından ücretsiz olarak sağlanan ve bulunabilir yazılım paketi olarak veri toplamak http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
- Gerçek zamanlı hücresel görüntüleri ve ilgi alanları (ROI, yani nükleer, bazolateral, apikal, vb) tespit
- Bu ROI ve r için floresan yoğunlukları Edinmefloresan / temel floresan (yani F/F0) olarak epresent.
- F / F 0 vs komplo ile iz oluşturmak zaman. Iz ek olarak, temsili görüntülerinin yaygın sağlanan ve Pseudocolor kullanılarak görüntülenir.
3. Hücre Sakatlık Tahliller için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması
- Sıcak DMEM F-12 ortamı (fenol kırmızısı olmadan) 37 ° C'ye kadar
- DMEM F-12 vasatı içinde, BSA (% 0.1 w / v son) ve HCI (50 uM nihai) ilave edilir.
- Konik bir tüp içine kısım DMEM 50 mi.
- Takviye edilmiş DMEM F-12 vasatı içinde, 10 ml kollajenaz tip IV 0.5 mg / mL (12 U / ml) ekleyerek, kolajenaz tamponu hazırlayın.
- CO 2 boğulma bir fare Euthanize. Orient yatar pozisyonda hayvan, ve% 70 etanol ile temizleyerek karın yüzeyi hazırlar. Karın boşluğuna ortaya çıkarmak için bir laparotomi gerçekleştirin. Pankreas inceleyin ve hemen küçük bir tartı tekne c durulamakolajenaz tamponu 6 ml ontaining.
- 3-5 dakika ya da çıkan çözelti eşit dağılmış görünene kadar ince diseksiyon makas kullanarak doku kıyma.
- 5 dakika boyunca 90 rpm'de çalkalanarak 37 ° C su banyosu içine ilave kolajenaz tamponu ve ardından yerine 5 ml, 125 ml'lik bir Erlenmeyer şişeye kıyılmış doku aktarın.
- Shaker kaldırmak, hücreleri kısa bir süre yerleşmek için izin ve taze kollajenaz tampon 5 ml ile değişim. Daha sonra 90 rpm'de çalkalanarak 37 ° C su banyosu içinde, ek 35 dakika inkübe edilir.
- Süspansiyon belirgin bir hücre kümeleri ile homojen görünene kadar şiddetle bir transfer pipet kullanarak sindirmek tekrar süspansiyon. Sonra yavaşça bir erlene önceden ıslak naylon örgü ile hücre süspansiyonu pipetle.
- Kuvvetlice kalan hücreler aracılığıyla zorlamak için, örgü ile taze DMEM F-12 ortamı (kolajenaz ile birlikte) arasında ek bir 3 ml pipetle.
- Başka bir 6-10 DMEM F-12 ortamı ilave edildi ve bir ekleme2-3 dakika razı hücreleri llow. Iki kez bu adımı yineleyin ve son yıkamadan sonra süpernatant kaldırmak.
- 48-çukurlu bir doku kültür plakasının her bir oyuğuna taze DMEM F-12 vasatı içinde, hücreler tekrar süspansiyon ve hücre süspansiyonu plaka 500 ul ekleyin. Hücreler, Şekil 1B tasvir edilen benzer olmalıdır.
- Plaka agonistleri eklemeden önce 5 dakika boyunca 90 rpm'de 37 ° C su banyosunda oturup bekleyin.
- 2-4 saat için agonistler değişen hücreleri uyarır.
- Hücrelerin yerleşmek ve dikkatli bir şekilde bir medya kısım (genellikle 100 ul) ve sıvı azot içinde dondurularak üzerinden flaş pipetle izin vermek için bir açıyla plaka eğin.
- Flaş kalan hücre süspansiyonu dondurma. Flaş dondurma LDH ölçümleri için gerekli değildir. Aynı gün tahlil ya da uzun süreli depolama için -20 ° C olarak kaydedilir ise bir alternatif örnekleri buz üzerinde tutulmalıdır gibi.
4. Laktat Dehidrogenaz Kaçak Ölçüm
- Sulandırın LDH substrat (kitinde olduğu) analiz tamponu içinde 12 ml (aynı zamanda verilmiştir).
- Oda sıcaklığında bir su banyosu içinde dondurulmuş hücre süspansiyonu ve ortam örnekleri çözülme.
- 96 oyuklu bir plaka içindeki her bir ortam örneği Levha 50 ul.
- Nihai konsantrasyonu 1x olur, böylece, hücre süspansiyonu için, 10X lizis tamponu gerekli hacim ekleyin. 60 dakika 37 ° C'de vorteks kısaca ve inkübe.
- Pelet hücre artıkları için 4 dakika 250 x g parçalanmış örnekleri santrifüj.
- Hücre lizatları, bir 96 yuvalı plakanın her yuvası içine 1:10 seyreltme plaka 50 ul.
- Her bir kuyucuğa sulandırılmış substrat 50 ul ekle, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin.
- Reaksiyonu durdurunher bir kuyunun elden çözüm (Set ile birlikte) 50 ul ekleyerek.
- 490 nm'de absorbansı ölçülür.
- % LDH kaçak hesaplamak için aşağıdaki formülleri kullanın. Aşağıdaki optik yoğunlukları iyi içeren sadece PBS, yüzeyden boş bir OD okuma dışarı çıkarılarak düzeltilmiş ve stop çözüm vardır.
Medya = LDH (Medya OD492) x (medya seyreltme faktörü) x (medya vol.) bu ortam örnekleri sulandırmak için genellikle gereksiz olduğu için *, seyreltme faktörü olacak en sık equal1.
Toplam LDH = ((Lizat OD 490) x (lizat seyreltme faktörü) x (hücre süspansiyonu olarak vol.)) + ((Medya OD 490) x (seyreltme faktörü) x (örnekleme için aliquoted medya vol.))
5. Adenovirüs ile Pankreas Asiner hücreler bulaşmasını
- Hazırlamakpankreas asiner hücreler olarak Bölüm 3'te açıklanan.
- Adım 3.12 sonra, hücre süspansiyonu için adenovirüs 10 7 bulaşıcı birimi (IFUs) ekleyin ve 37 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe
- 6 çukurlu bir plaka içinde hücre süspansiyonu eşit olarak plakası 2 mi.
- En ifade yapıları için, hücreler yeterli 18 saat içinde enfekte olmalıdır ve sadece 6 saat içinde bazı lusiferaz yapıları, için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fizyolojik uyarıcıya tepki olarak hücre kalsiyum asinar ölçümlerinin bir örneği Şekil 3'te verilmektedir. Acinar hücreleri kalsiyum ile yüklenen boya Fluo-4 ve asetilkolin analog karbakol (CCh, 1 uM) ile perfüze) 8. Hücreler, apikal bölgedeki başlatır ve bazolateral bölge 3,9 ile yayılan bir kalsiyum dalga şeklinde verdi. Şekil 3B gösterilen Temsilcisi iz yaygın olarak 1 mcM karbakol ile gözlenen tipik tepe-plato desen göstermektedir. Tersine, kolesistokinin analog Caerulein (22:00) arasında alt maksimal doz kullanılarak salınımlı kalsiyum yanıtları (Şekil 4) 10 elde edilir.
Pankreatit uyaran agonistlere cevap olarak asiner hücrelerden LDH Kaçak Şekil 5 'de gösterilmiştir. Burada Caerulein, karbakol, ya da t varlığında LDH sızıntısına konsantrasyona bağlı bir artış gösterecekO safra asidi taurolithocholic asidi-3 sülfat (TLCS). LDH maksimal sızıntı ikna etmek için gerekli olan konsantrasyon, intra-asiner proteaz aktivasyonu ve patolojik kalsiyum sinyal elde etmek için gerekli tutarlı olan bu olaylar öne zararlara yol açabilir.
Asiner hücreler, aktive edilmiş T hücrelerinin bir alt-Cn efektör, nükleer faktör (• Şekil 6A NFAT) için promoteri tarafından tahrik edilen bir lusiferaz haberci adenovirüs ile enfekte edildi. Biz TLCS (Şekil 6B ve 6C) varlığında, NFAT-lusiferaz aktivitesinde konsantrasyonu ve zamana bağlı artış gösteren, bizim enfeksiyon yöntem doğrulamak için temsili veriler sağlar.
Şekil 1. Pankreas asiner hücrelerinin Temsilcisi görüntüleri folçeşitli hazırlıklar iyice silinir. (A) 'Asiner hücreler olarak 630X büyütme ile görselleştirildiği gibi, Ca2 + ölçümü için hazırlanmıştır. Üst satır parlak bir alan mikroskobu gösteriyor, alt sıra Ca 2 + boya Fluo-4 yüklü asiner hücreleri gösteriyor ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. (B) Asiner hücreler olarak 400X büyütmede görüntülendi, sitotoksisite deneyleri için hazırlanmış.
Şekil 2. . Perifusion haznesi (A) haznesi üç katmandan oluşmaktadır., Bir lastik conta, bir metal taban ve plastik bir kapak (B), kauçuk conta metal taban üstüne yerleştirilir ve hücreler içeren bir 22x22 mm lamel üzerine yerleştirilir lastik conta üzerine yukarı. Plastik kapak metal taban vidalanır ve 18x18 mm lamel üzerine yerleştirilir. (C) odası daha sonramikroskop sahneye güvenli. Boru içeren tampon veya agonist, odanın kenarında (ok) üzerinde bulunan girişleri beslenir. Ayrı boru bir vakum (ok başı) yol açar.
Şekil 3,. Karbakol (1 mcM) ile uyarılması üzerine tipik bir tepe-plato kalsiyum sinyali. . (A) Soldan sağa, bir (A) Pical de etiketli acinus ve (B) bir asiner hücreden ilgi asolateral bölgelerin Aydınlık alan görüntüsü Hücreler, kalsiyum göstergesi Fluo-4 (5 uM) ile yüklendi. Fizyolojik karbakol (1 uM, Ach analog) ile uyarılması üzerine, sonraki görüntü bazal bölgeye yayılma takiben, apikal bölgedeki kalsiyum sinyalinin başlatılması göstermektedir (B) her bir panel dosyasını (1-4), bir çerçeveye karşılık gelir. ilgi her bölge için zaman içinde floresan değişim izleme temsilcisi boyunca. Görüntülerbir renk skalası (sağ alt) ile Pseudocolor temsil. Sol ve sağ oklar sırasıyla, apikal ve bazal bölgelerde ilk kalsiyum artış zaman gösterecek. Bu rakam aslında Biyolojik Kimya Dergisi'nde yayınlanmıştır. (Orabi AI, Şah AU, Muili K., Luo Y., Mahmood SM, Ahmed A., Reed A., Hüseyin SZ Etanol karbakol bağlı proteaz aktivasyonu artırır ve izole sıçan pankreas acini kalsiyum dalgaları hızlandırır. Biyolojik Kimya Dergisi , 2 86, 14.090-14.097 (2011)).
Şekil 4. Stimülasyon Caerulein (10 pM) ile. Üzerine tipik bir kalsiyum salınım (A) tüm hücre sitozolik kalsiyum değişiklikler boya Fluo-4 / AM kalsiyum kullanarak zaman atlamalı konfokal mikroskobu ile saniyede bir kez ölçüldü. Görüntüler bir renk s Pseudocolor temsil edilmektedircale (sağ üst). (B) zaman içinde floresan Temsilcisi arsa pH 7.4 de Caerulein (10 pM) ile tedavi edilen tek bir hücreden kaydedildi. Bu rakam aslında Biyolojik Kimya Dergisi'nde yayınlanmıştır. (Reed AM, Hüseyin SZ, atıcı E., Alexandre M., Şah A., Gorelick FS, Nathanson MH Düşük Hücre dışı pH Biyolojik Kimya Dergisi, 286, 1919-1926 (Sinyal artırılması Kalsiyum tarafından Pankreas Asiner Hücre Hasar indükler 2011)).
Şekil 5,. Çeşitli pankreatit-uyaran agonistleri ile tedavi asiner hücrelerinden hücre hasarı ölçüm. Izole asiner hücrelerde, laktat dehidrogenaz (LDH) kaçak bir iki olarak kullanılmıştıryaralanma Biyokimya göstergesi. İzole hücreleri (A) Caerulein (1-100 nM), (B), karbakol (1 uM -1 mM) ve (C) TLCS (50-500 uM) ve% 2 LDH kaçak sonra ölçülmüştür, değişen konsantrasyonlarda ile muamele edildi sa. (N = 3). #, * P <0.05, sırasıyla, kontrol ve TLCS yalnız göre.
6 Şekil. Adeno ile NFAT-lusiferaz ile enfekte pankreatik acinar hücreleri içinde lusiferaz faaliyeti ölçülür. (A) TLCS ile lüminesans adenoviral NFAT-lusiferaz. (B) TLCS (5-500 mcM) bağlı NFAT-lusiferaz aktivite. İdaresi (C) Zaman Tabii gösteren birikimi ile Birincil fare pankreas asiner hücrelerin enfeksiyonu için Şema (500 mcM) 6 boyunca verilendönemi hr. (N = 3). *, #, P tek başına ya da kontrol TLCS göre <0.05,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre izolasyonu yöntemi ve sonraki deneyleri pankreas fizyolojik ve patofizyolojik özellikleri incelemek için hangi ile güçlü araçlar temsil burada tasvir. Dağınık pankreas asiner hücreleri izole etmek için yöntemi ilk kez 1972 11 Amsterdam ve Jamieson tarafından tanımlanmıştır. Burada sunulan yöntem Van Acker ve arkadaşları 12 tarafından tarif daha yeni izolasyon yöntemleri uyarlanmıştır. Bu tekniklerin son derece tekrarlanabilir ve kolay öğrenilen olmasına rağmen, tam olarak gerçekleştirilmelidir her yöntem için birkaç önemli özellik vardır. Bu teknik detayları anlamak sorun giderme daha kolay ve gelişmiş uygulama için izin verir.
Kalsiyum ölçümleri için hücreler hazırlarken, biz genç kemirgenler, pankreas daha tutarlı sonuçlar verdiği tespit ettik. Daha az fibro-yağ dokusu içeren muhtemelen çünkü acini, daha eşit dağıtılır. Için Ca 2 + ölçümleri, biz en uygun tek bir hücre görüntüleme için daha küçük acini hazırlar. LDH Bu ölçümler için kullanılan daha yüksek bir kolajenaz konsantrasyonu (1.1 mg / ml veya 200 U / ml) gerektirir. Bu yöntem başlangıçta daha az yaralanma neden olduğundan, LDH ölçümleri için, biz daha büyük acini hazırlamak. Hazırlık, bu nedenle, daha düşük bir kolajenaz konsantrasyonu (0.5 mg / ml veya 91 U / mL).
Ca 2 + ölçümleri, bu hücreler asitle yıkanmış lamelleri kaplama olması önemlidir. Asitle yıkama amacı, temiz bir yüzey yanı sıra asinüs maksimum yapışma sağlayacak elektrostatik etkileşim sağlamaktır. Hücre Tak (BD Bioscience) yerine ya da bu yöntem ek olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, Ca2 + boya BSA bağlanma arasındaki boya önlemek amacıyla, bir BSA içermeyen kuluçka tampon maddesi (1) yerleştirilmiş ve (2) asinüs maksimum asitle yıkanmış lamelleri yapışmasına izin veren bu kritik .
t "açıklanan> perfüzyon odasının özel tasarlanmış. Ticari odaları ve akış sistemleri, ancak, Warner Instruments edinilebilir edildi. perfüzyon ek olarak, düzgün düzenlenmiş vakum kurma kapalı Emilen olmaktan asiner hücreleri önlemede önemli bir faktördür lamel.Pankreas asiner hücrelerden kalsiyum sinyalleri ölçerken, bir konfokal mikroskop kullanımı açıklanmaktadır. Konfokal görüntüleme üzerinde veya odak düzlemi altında ışık ortadan kaldırmak için bir foto çoğaltıcı tüp önünde bir iğne deliği kullanır. Bunun aksine, geniş alan görüntüleme numunenin floresan görüntü kontamine (odak istenen düzlemi üstünde ve altında, yani ışık) odak ışık üzerinden sağlayan örnek, bir uyarma yolu boyunca ışığı tespit eder. Geniş bir alan üzerinde konfokal mikroskopi avantajı, ince kesitli bir örnek görüntüleme yanı sıra boyunca alınmış optik dilim 3D rekonstrüksiyonu için olanak sağlamasıdırZ-ekseni. Buna ek olarak, konfokal mikroskopi, satırı tarayıcı, sweptfield tarayıcı veya bir nokta tarayıcıdan bile daralmış bölgelere dönen bir disk kullanarak kalsiyum floresan hızlı değişiklikleri yakalayabilir yüksek hızlı toplama sistemleri sağlar.
Bu sırasıyla dalgalar ve salınımlar, gibi kalsiyum sinyal desen mekansal ve zamansal değişimler, güvenilir F / F 0 hesaplama ölçülen, ama bu [Ca 2 +] gerçek bir göstergesi değildir olabilir. Kantitatif ölçümleri [Ca2 +] hataları kaybı 13,14 Photobleaching ve boya nedeniyle bu ölçümlerde oluşabilir, ancak tek dalga boyu uyarılması ve bu Fluo-4 gibi emisyon kalsiyum boyalar kullanılarak hesaplanabilir. [Ca 2 +] gibi Fura2 veya Indo1 15 gibi rasyometrik boyalar kullanılarak daha doğru ölçülen, ama bu çünkü uyarma için bir UV lazer ihtiyacının en konfokal mikroskoplar üzerinde pratik edilebilir. Öte yandan, concomita üzerindeFluo-3 ya da Fluo-4 ve Fura-Kırmızı nt kullanımı en fazla konfokal mikroskop 16 üzerinde mevcut olan 488 mm uyarım hattı ile oranı görüntüleme izin verebilir.
LDH kaçak asiner hücre hasarı 7,17 ölçmek için hassas bir araçtır. Başka bir tamamlayıcı yöntem propidium iyodür alımı 18'dir. Adenovirüs enfeksiyonu kültürlü acini 19 yüksek enfeksiyon oranları elde. Virüs konsantrasyonu titre edilmesi gerekebilir. Buna ek olarak, bir başka alakasız adenoviral oluşturmak da enfekte olduğu karşılaştırılabilir kontrol koşulları sağlamak için yararlıdır. 12 saat altında son bizim enfeksiyon çalışmaların çoğu. Bununla birlikte, daha uzun süreler boyunca, antibiyotikler başlangıçta DMEM-F12 ortam eklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Hibe DK083327 ve DK093491 bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (SZH için) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy. Embo J. 11, 1623-1629 (1992).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells. Embo J. 16, 242-251 (1997).
- Husain, S. Z., et al. The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).
- Raraty, M., et al. Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).
- Orabi, A. I., et al. Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).
- Shah, A. U., et al. Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).
- Muili, K. A., et al. Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Orabi, A. I., et al. Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini. J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).
- Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).
- Reed, A. M., et al. Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling. J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Van Acker, G. J., et al. Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis. J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells. J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).
- Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini. Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red. Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).
- Saluja, A. K., et al. Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini. Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).
- Husain, S. Z., et al. Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo. Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).
