Summary
Nós descrevemos um método reprodutível de preparação de células acinares pancreáticas de rato de um rato com a finalidade de examinar os sinais de cálcio de células acinares e lesão celular com estímulos fisiologicamente e patologicamente relevantes. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.
Abstract
As células acinares do pâncreas é a principal célula do parênquima do pâncreas exócrino e desempenha um papel primordial na secreção de enzimas pancreáticos no ducto pancreático. É também o local para o início da pancreatite. Aqui, nós descrevemos como células acinares são isolados a partir de sinais de cálcio intracelular tecido e pâncreas todo são medidos. Além disso, descrevem-se as técnicas de transfecção destas células com as construções adenovirais, e, subsequentemente, medindo a fuga de lactato desidrogenase, um marcador de lesão da célula, em condições que induzem a lesão das células acinares, in vitro. Estas técnicas proporcionam uma ferramenta poderosa para caracterizar acinar celular fisiologia e patologia.
Introduction
Estas alterações dinâmicas em cálcio intracelular são necessárias para os eventos de células acinares tanto fisiológicos e patológicos. Estes efeitos divergentes de cálcio são pensados para resultar de padrões espaciais e temporais distintos de cálcio de sinalização 1. Por exemplo, a enzima e a secreção de fluido a partir da célula acinar estão ligadas a pontos do cálcio a partir de uma região limitada do pólo apical onde ocorre a secreção de 2. Em contraste, uma onda de cálcio global seguida de sinais de cálcio não-oscilatórias intensas está associada com eventos patológicos iniciais que conduzem a pancreatite aguda 3,4. Estes incluem a ativação intra-acinar protease, a secreção de enzimas reduzida e lesão celular acinar. O nosso laboratório utiliza isolado ácinos pancreáticos de estudar estes eventos patológicos iniciais que conduzem a doença, tanto in vivo como in vitro 5-7. Os métodos descritos aqui descrevem o isolamento de células acinares primárias com a finalidade de medir cyníveis de cálcio tosolic e lesão celular. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.
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Protocol
1. Preparando células pancreáticas acinares para Imagem de cálcio
- Preparar tampão de incubação contendo HEPES a 20 mM HEPES, 95 mM de NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1,3 mM de CaCl2, 10 mM de glucose, 2 mM de glutamina e 1 × aminoácidos não essenciais do meio mínimo de Eagle. Ajuste da solução final a pH 7,4 com NaOH.
- Preparar um tampão de incubação de BSA por adição de BSA (1% w / v final) a 25 ml de tampão de incubação de HEPES (descrito acima).
- Preparar um tampão de digestão de colagenase por adição de 1,1 mg / mL (200 unidades / ml), colagenase tipo 4 e 1 mg / ml de inibidor de tripsina de soja a 6 ml de tampão de incubação de BSA (descrito acima).
- Ácido-lavagem mm lamelas 22x22 por imersão em duas partes HNO 3 e uma parte de HCl por 2 horas. Decantar com água DI e armazenar em etanol 70%.
- Sacrificá um rato por asfixia CO 2. Orientar o animal em decúbito dorsal, e preparar a superfície abdominal por cledesmame com etanol a 70%. Realizar uma laparotomia para expor a cavidade abdominal. Dissecar o pâncreas e lave imediatamente em um pequeno barco pesar contendo 6 ml de tampão de digestão colagenase.
- Dissecar afastado qualquer grandes pedaços de vasos sanguíneos de gordura ou visível, em seguida, retire 5 ml de tampão de digestão colagenase e adicioná-lo de volta para o tubo cônico de 15 ml.
- Com uma tesoura de dissecção fina picar o pâncreas no pequeno barco pesando contendo 1 ml de tampão de digestão colagenase. Tritura até que a solução resultante aparece uniformemente dispersas.
- Transferir o produto triturado para um frasco de plástico ml de Erlenmeyer de 125, e adicionar os restantes 5 ml de tampão de digestão de colagenase para o recipiente. Certifique-se de que o tecido é completamente submerso em tampão.
- Colocar o balão num banho de água a 37 ° C e agitar a 90 rpm por 30 min. Durante este curto período de tempo de inatividade, preparar agonistas ativação de cálcio (por exemplo ceruleina, carbacol) e lavar o mm capa ácido lavado 22x22desliza com água DI. A seco, e, em seguida, colocar em cima de uma superfície plana, revestida por filme de laboratório.
- Após 30 min a digerir está completa, transferir a suspensão de volta para o tubo de 15 ml cónica e permitir que as células assentar. Pipetar cuidadosamente o tampão de digestão colagenase e substituir com 6 ml de tampão de incubação BSA. Agitar vigorosamente o tubo à mão durante 10 segundos, a fim de dispersar as células em agrupamentos mais pequenos. Imediatamente após a agitação, retirar qualquer grande, detritos flutuantes da mídia não liquidados.
- Permitir que as células restantes para resolver, e trocar os meios de comunicação com tampão de incubação fresco BSA.
- Repetir o passo 1.11, duas vezes, até a suspensão é composta por apenas pequenos aglomerados que só são finamente visível a olho nu. As células devem se assemelham aos descritos na Figura 1A (linha superior).
- Remover o tampão de incubação de BSA e HEPES substituir com tampão de incubação.
- Prepare um 750 mM, estoque 100X de Fluo-04:00 em 10% DMSO.
- Carregar as células no tubo cónico de 15 ml contendo a suspensão de células e o tampão de incubação de BSA livre de HEPES. Para fazer isso, adicionar um volume apropriado (diluição 1:100) da solução à suspensão de células. Então placa 500 ul desta suspensão em cada lamela 22x22 mm.
- Mantenha lamelas no escuro à temperatura ambiente. Dê o primeiro Ca 2 + medições 30 min após o carregamento. O corante é automaticamente removida do meio após o início da perfusão, o que deve ocorrer após 30 min de carga de corante.
2. Medição de cálcio em células pancreáticas acinares
- Lavar cada perfusão set-up com água DI e preencha com uma quantidade adequada de tampão ou agonista. Primeiro cada seringa com tampão ou agonista para garantir o fluxo adequado. Grampo seringas a um anel de ficar cerca de 1-2 metros acima do palco microscópio.
- Use uma pinça fina para agarrar com cuidado a partir de sua borda uma suspensão de células contendo lamela. Inclinar a tampaescorregar 45 °, e permitir que o excesso de tampão para fugir. Coloque a lamela sobre a vedação de borracha com as células na parte superior da lamela e montar a câmara (Figuras 2A e 2B).
- Fixar a câmara de perfusão para a fase e inserir o tubo que contém tampão para a primeira entrada da câmara (Figura 2C). Rodar a seringa contendo tampão e permitir que o tampão para perfundir sobre toda a superfície da lamela. Uma vez que o tampão tenha atingido a extremidade oposta da câmara, inserir uma linha de vácuo para a boca de aspiração. Insira quaisquer outros tubos (contendo agonistas, inibidores, etc) em sua posição apropriada ao longo da câmara.
- Visualizar as células utilizando qualquer um, 1,4 objectiva 200X ou 400X abertura numérica e de um laser de árgon para excitar o corante Fluo-04:00 comprimento de onda de 488 nm (Figura 1A, parte inferior). As configurações do laser de potência deve ser ajustada de modo que o tubo fotomultiplicador (PMT) Não está saturado com a luz emitida. Além disso, a tensão através do PMT tem de ser optimizado para a detecção de luz máxima.
- Sinais de> 515 nm de emissão de passa-longo são coletados em velocidades de quadro de 2-5 seg / frame para a visualização de padrões oscilatórios lentos e 0,2-0,3 seg / quadro para a visualização rápida, ondas de cálcio globais (Figuras 3 e 4).
- Depois de imagens estiver concluída, feche as seringas e remover toda a tubulação. Desmonte a câmara e repita os passos de 2,2-2,4.
- Coletar dados como valores numéricos de intensidade de fluorescência ao longo do tempo e transferência à Imagem J (pacote de software fornecido como freeware pelo National Institutes of Health e podem ser encontradas em http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
- Veja as imagens de celular em tempo real e identificar regiões de interesse (ROI, ou seja, apical, basolateral, nuclear, etc)
- Adquirir intensidades de fluorescência para estes ROIs erepresent como intensidade de fluorescência / linha de base da intensidade da fluorescência (isto é F/F0).
- Gerar traçados traçando F / F 0 vs tempo. Além de traçados de imagens representativas são geralmente fornecidas e exibida usando pseudo.
3. Preparação de células pancreáticas acinares para Ensaios lesão celular
- Quentes DMEM F-12 mídia (sem vermelho de fenol) a 37 ° C.
- Adicionar BSA (0,1% w / v final), e HCl (50 mM final) para os F-12 DMEM mídia.
- Alíquotas de 50 ml de DMEM para um tubo cónico.
- Preparar um tampão de colagenase por adição de 0,5 mg / ml (12 U / mL) de colagenase tipo IV de 10 ml de DMEM suplementado F-12 media.
- Sacrificá um rato por asfixia CO 2. Orientar o animal em decúbito dorsal, e preparar a superfície abdominal por limpeza com álcool 70%. Realizar uma laparotomia para expor a cavidade abdominal. Dissecar o pâncreas e lave imediatamente em um pequeno barco pesando containing 6 ml de tampão de colagenase.
- Picar o tecido com uma tesoura de dissecção multa para 3-5 minutos ou até que a solução resultante aparece uniformemente dispersas.
- Transferir o tecido triturada para um balão de Erlenmeyer de 125 ml com 5 ml de tampão de colagenase adicional, em seguida, colocar num banho de água em ° C 37 ° C com agitação a 90 rpm durante 5 min.
- Retire do agitador, para permitir que as células assentar brevemente, e troca com 5 ml de tampão de colagenase fresco. Em seguida incubar durante um adicional de 35 min num banho de água a 37 ° C com agitação a 90 rpm.
- Vigorosamente ressuspender a digest, utilizando uma pipeta de transferência até a suspensão se torna homogénea, sem grumos de células visíveis. Em seguida, pipeta suavemente a suspensão de células através de nylon de malha pré-molhado num erlenmeyer.
- Vigorosamente pipetar um adicional de 3 ml de DMEM fresco F-12, com meios (colagenase) através da malha, a fim de forçar através de quaisquer células restantes.
- Adicionar outro 6-10 ml de DMEM F-12 mídia e umGUARDE as células que se contentar com 2-3 min. Repetir este passo duas vezes, e remover o sobrenadante, após a última lavagem.
- Adicionar DMEM fresco F-12 media, ressuspender as células, e placa de 500 ul de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços. As células devem assemelhar-se aos representados na Figura 1B.
- Permitir que a placa para se sentar em um banho de água 37 ° C a 90 rpm por 5 min antes de adicionar agonistas.
- Estimular as células com diferentes agonistas para 2-4 horas.
- Inclinação da placa em um ângulo para permitir que as células que se contentar com cuidado e pipetar uma aliquota dos meios de comunicação (normalmente 100 l) e congelamento de flash em azoto líquido.
- Flash congelar a suspensão de células remanescente. Congelamento de inflamação não é essencial para a medição de LDH. Como uma alternativa as amostras podem ser mantidas em gelo, se eles vão ser testadas no mesmo dia, ou armazenado em -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
4. Medição de lactato desidrogenase Vazamento
- Reconstituir o substrato LDH (que é fornecido com o kit) com 12 ml de tampão de ensaio (também fornecidos).
- Descongelar suspensão de células congeladas e amostras de meio num banho de água à temperatura ambiente.
- Placa de 50 ul de cada amostra de material em uma placa de 96 poços.
- Para a suspensão de células, adiciona o volume necessário de 10X de tampão de lise de modo que a concentração final é de 1X. Brevemente Vortex e incubar a 37 ° C durante 60 min.
- Centrifugar as amostras lisadas a 250 xg durante 4 min a detritos sedimento celular.
- Para lisados celulares, placa 50 ul de uma diluição de 1:10 para cada poço de uma placa de 96 poços.
- Adicionar 50 ul de substrato reconstituído a cada poço, incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 min.
- Parar a reacçãoadição de 50 ul da solução de paragem (fornecida com o kit) para cada poço.
- Medir a absorvância a 490 nm.
- Use a seguinte fórmula para calcular% LDH fugas. As densidades ópticas abaixo são corrigidos subtraindo uma leitura OD em branco de um poço contendo apenas PBS, substrato e solução de paragem.
LDH em media = (Media OD492) x (fator de diluição media) x (vol. de mídia) * Uma vez que não é normalmente necessário para diluir amostras de mídia, o fator de diluição na maioria das vezes equal1.
Total de LDH = ((Lysate OD 490) x (fator de diluição lysate) x (vol. em suspensão de células)) + ((Media OD 490) x (fator de diluição) x (vol. de mídia alíquota para amostragem))
5. Infectando células pancreáticas acinares com Adenovirus
- Prepararcélulas acinares pancreáticas, como descrito na seção 3.
- Seguindo o passo 3.12, adicionar 10 7 unidades infecciosas (IFUs) de adenovírus para a suspensão de células e incubar durante 30 min a 37 ° C.
- Uniformemente placa de 2 ml de suspensão de células numa placa de 6 poços.
- Para a maioria das construções de expressão, as células devem ser adequadamente infectado dentro de 18 horas, e para algumas construções luciferase, apenas dentro de 6 horas.
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Representative Results
Um exemplo de medições de cálcio de células acinares, em resposta a estímulos fisiológicos é fornecido na Figura 3. As células acinares foram carregados com o corante Fluo-cálcio 4 e perfundido com a acetilcolina análogo carbacol (CCh, 1 uM)) 8. Células reagiu, sob a forma de uma onda de cálcio, que tem início na região apical e propaga à região basolateral de 3,9. Traçados representativos mostrados na Figura 3B mostram o padrão típico de pico-planalto vulgarmente observado com um uM carbacol. Por outro lado, o uso de doses sub-máximas de colecistocinina análogo ceruleina (22:00) produz respostas de cálcio oscilatórias (Figura 4) 10.
Vazamento da LDH a partir de células acinares, em resposta aos agonistas pancreatite indutores é mostrado na Figura 5. Aqui demonstramos aumento dependente da concentração nos LDH na presença de ceruleina, carbacol, ou tele ácido biliar ácido taurolitocólico 3-sulfato (TLCS). As concentrações necessárias para induzir fuga de LDH máxima são consistentes com aquelas necessárias para induzir a activação de protease intra-acinares e sinalização patológicas do cálcio, sugerindo que estes eventos podem levar a lesão.
As células acinares foram infectadas com adenovírus um repórter de luciferase, que é conduzida pelo promotor para um factor de Cn efector a jusante, nuclear das células T activadas (NFAT, figura 6A). Nós fornecer dados representativos validando o nosso método de infecção, demonstrando a concentração e tempo-dependente do aumento da actividade de NFAT-luciferase na presença de TLCS (Figuras 6B e 6C).
Figura 1. Imagens representativas de células acinares pancreáticas foltes diversas preparações. (A) As células acinares preparados para medições de Ca 2 +, como visualizado com uma ampliação de 630x. Linha superior mostra a microscopia de campo brilhante, linha de baixo mostra células acinares carregados com o Ca 2 + corante Fluo-4 e visualizados através de microscopia de fluorescência. (B) células acinares preparado para ensaios de citotoxicidade, como visualizado no aumento de 400X.
Figura 2. . A câmara de perifusão (A) A câmara é constituída por três camadas:. Uma base de metal, um anel de borracha, e uma tampa de plástico (B), a junta de borracha é colocado em cima da base de metal e uma lamela de 22x22 mm contendo células é colocada para cima no topo da junta de borracha. A tampa de plástico é aparafusada à base de metal e uma lamela de 18x18 mm é colocado no topo. (C) A câmara é entãogarantiu para a fase de microscópio. Tubos, contendo tampão ou agonista, é alimentado em entradas localizadas na borda da câmara (seta). Tubulação separada leva a um vácuo (cabeça de seta).
Figura 3. Um sinal de cálcio pico planalto típico com a estimulação com carbacol (1 mM). (A) Da esquerda para a direita; campo de visão brilhante de uma acinus rotulados no (A) Pical e (B) asolateral regiões de interesse a partir de uma célula acinar. As células foram carregadas com o indicador de cálcio Fluo-4 (5 uM). Por estimulação com carbacol fisiológico (1 uM; Ach análogos), as imagens subsequentes mostram o início do sinal de cálcio na região apical, seguido de propagação para a região da base (B) Cada imagem painéis (1-4), corresponde a uma armação. ao longo de um traçado representativo da alteração na fluorescência ao longo do tempo para cada região de interesse. As imagens sãorepresentado em pseudo com uma escala de cores (parte inferior direita). Setas esquerda e direita mostram momento da primeira elevação de cálcio nas regiões apical e basal, respectivamente. Esta figura foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. (Orabi AI, Shah UA, Muili K., Luo Y., Mahmood SM, Ahmad A., Reed A., Husain SZ Etanol aumenta a ativação induzida por carbacol protease e acelera as ondas de cálcio em ratos ácinos isolado de pâncreas. The Journal of Biological Chemistry , 2 86, 14090-14097 (2011)).
Figura 4. A oscilação normal de cálcio com a estimulação ceruleina (22:00). (A) Variação de toda célula cálcio citosólico foram medidos uma vez por segundo por time-lapse microscopia confocal usando o cálcio corante Fluo-4 / AM. As imagens são representadas em pseudocores com uma cor scale (canto superior direito). (B) enredo Representante da fluorescência ao longo do tempo foram registrados a partir de uma única célula tratada com ceruleina (10:00), pH 7,4. Esta figura foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. (Reed AM, Husain SZ, Thrower E., Alexandre M., A. Shah, Gorelick FS, Nathanson MH baixo pH extracelular causa danos no pâncreas Acináceo celular, aumentando Cálcio Sinalização The Journal of Biological Chemistry, 286, 1919-1926 ( 2011)).
Figura 5. Medindo a lesão celular a partir de células acinares tratados com vários agonistas induzem pancreatite. Em células acinares isolado, desidrogenase (LDH), lactato de vazamento foi utilizada como um biochemical indicador de lesão. As células acinares isolados foram tratados com várias concentrações de (A) ceruleina (1-100 nM) (B), carbacol (1 mM mM -1) e (C) TLCS (50-500 uM), e% de fuga de LDH foi medida após 2 hr. (N = 3). #, *, P <0,05 comparado com o controlo e TLCS sozinho, respectivamente.
Figura 6. Medindo a actividade da luciferase em células acinares pancreáticas infectadas com adeno-NFAT-luciferase. (A) Esquema para a infecção de células acinares pancreáticas de rato primários com adenovírus NFAT-luciferase. (B) Administração de TLCS (5-500 mM) atividade NFAT-luciferase induzida. (C) curso Tempo demonstrando acúmulo de luminescência com TLCS (500 iM), constantes ao longo de um 6hr período. (N = 3). *, #, P <0,05, em relação ao controlo ou TLCS sozinho, respectivamente.
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Discussion
O método de isolamento de células e ensaios subseqüentes descritos aqui representam poderosas ferramentas com as quais estudam os aspectos fisiológicos e fisiopatológicos do pâncreas exócrino. O método de isolamento de células pancreáticas acinares dispersas foi descrita pela primeira vez por Amesterdão e Jamieson, em 1972, 11. Os métodos aqui apresentados foram adaptados a partir de métodos de isolamento mais recentes descritos por Van Acker e colegas 12. Embora estas técnicas são altamente reprodutível e facilmente aprendido, há vários aspectos críticos de cada método, que devem ser realizados com precisão. Entender esses detalhes técnicos vai permitir mais fácil resolução de problemas e melhoria da aplicação.
Na preparação das células para medições de cálcio, descobrimos que o pâncreas de roedores jovens produz resultados mais consistentes. Os ácinos são mais uniformemente distribuída, possivelmente porque contêm menos tecido fibro-gorduroso. Para Ca 2 + medições, preparamos ácinos menor para imagens de células único ideal. Isto requer uma maior concentração de colagenase (1,1 mg / ml ou 200 U / ml) do que a utilizada para as medições da LDH. Para medições de LDH, preparamos maior ácinos porque este método causa menos lesões no início do estudo. A preparação, por conseguinte, recebe uma concentração inferior de colagenase (0,5 mg / ml ou 91 U / ml).
Para Ca 2 + medições, é fundamental que as células ser semeadas em lamínulas ácido-lavadas. O propósito do ácido de lavagem consiste em proporcionar uma superfície limpa, bem como interacções electrostáticas que permitem a aderência máxima de ácinos. Célula Tak (BD Bioscience), pode ser utilizado em vez de ou em adição a este método. Além disso, é essencial que o Ca2 + corante é colocado num tampão de incubação de BSA livre de encomenda (1) para evitar que o corante de ligação a BSA e (2) para permitir que os ácinos a aderir ao máximo para as lamelas de cobertura lavadas com ácido .
t "> A câmara de perfusão descrito foi concebido. câmaras comerciais personalizados e sistemas de fluxo, no entanto, estão disponíveis através da Warner Instruments. Além da perfusão, a criação de um vácuo devidamente regulamentada é um fator crítico na prevenção de células acinares de ser aspirada para fora da lamela.Ao medir sinais de cálcio a partir de células acinares pancreáticas, que descrevem o uso de um microscópio confocal. Confocal utiliza um orifício na frente de um tubo fotomultiplicador, a fim de eliminar a luz a partir de acima ou abaixo do plano focal. Em contraste, a imagem de campo amplo detecta a luz ao longo do caminho de excitação do espécime, que permite que a luz de focagem (isto é, luz acima e abaixo do plano do foco desejado) para contaminar a imagem da fluorescência da amostra. A vantagem de microscopia confocal sobre-vasto campo é que ele permite a imagiologia de secção fina de uma amostra, bem como a reconstrução 3D de fatias ópticas recolhidos juntamenteum eixo Z. Além disso, a microscopia confocal fornece sistemas de recolha de alta velocidade que pode capturar rápidas mudanças na fluorescência de cálcio usando um disco giratório, scanner linha, scanner sweptfield, ou mesmo regiões reduziu-se de um scanner ponto.
Alterações espaciais e temporais em padrões de sinalização de cálcio, tais como ondas e oscilações, respectivamente, pode ser mensurado de forma confiável usando F / F 0 cálculo, mas isso não é um verdadeiro indicador de [Ca 2 +]. As medições quantitativas de [Ca 2 +] pode ser calculado usando único comprimento de onda de excitação e de emissão de corantes de cálcio, tais como Fluo-4, embora os erros podem ocorrer em tais medidas, devido à fotodegradação e a perda de corante 13,14. [Ca 2 +] pode ser medida com maior precisão utilizando corantes, tais como raciométrica Fura2 Indo1 ou 15, mas isto é impraticável em microscópios confocais mais, devido ao requisito de um laser de UV para a excitação. Por outro lado, concomitant uso de Fluo-3 ou de Fluo-4 e Fura-vermelho pode permitir imagiologia escala utilizando a linha de excitação de 488 nm, que está presente na maioria dos microscópios confocais 16.
Vazamento de LDH é uma ferramenta sensível para medir o dano celular acinar 7,17. Outro método é complementar a captação de iodeto de propídio 18. Infecções por adenovírus alcançar altas taxas de infecção em cultura ácinos 19. A concentração de vírus pode precisar de ser ajustada. Além disso, é útil para proporcionar as condições de controlo comparáveis, em que uma outra construção de adenovírus também é irrelevante infectado. A maioria dos nossos estudos de infecção duram menos de 12 horas. No entanto, durante períodos mais longos, os antibióticos podem ser adicionados ao meio de DMEM-F12 no início.
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Disclosures
Não há conflito de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde Grant DK083327 e DK093491 (a SZH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 um pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 | |
References
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