Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral

Summary

Descriviamo un metodo riproducibile di preparazione del mouse pancreatiche cellule acinose da un mouse con lo scopo di esaminare i segnali di calcio delle cellule acinose e lesioni cellulari con stimoli fisiologicamente e patologicamente rilevanti. Viene inoltre fornito un metodo per l'infezione adenovirale di queste cellule.

Abstract

L'cellule acinose pancreatiche è il principale parenchima cellulare del pancreas esocrino e svolge un ruolo primario nella secrezione di enzimi pancreatici nel dotto pancreatico. E 'anche il sito per l'avvio di pancreatite. Qui si descrive come le cellule acinose sono isolati da tutto il tessuto del pancreas e dei segnali intracellulari di calcio sono misurati. Inoltre, si descrivono le tecniche di trasfezione queste cellule con costrutti adenovirali, e successivamente misurando la fuoriuscita di lattato deidrogenasi, un marker di danno cellulare, in condizioni che inducono lesioni cellule acinose in vitro. Queste tecniche forniscono un potente strumento per la caratterizzazione delle cellule acinose fisiologia e patologia.

Introduction

Cambiamenti dinamici nel calcio citosolico sono necessari per gli eventi delle cellule acinose sia fisiologiche che patologiche. Questi effetti divergenti di calcio sono pensati per derivare da diversi modelli spaziali e temporali di calcio di segnalazione ^1. Per esempio, enzimi e la secrezione fluido dalla cellule acinose sono legate a picchi di calcio da una regione ristretta del polo apicale in cui la secrezione avviene ^2. Al contrario, un'onda calcio globale seguito da intensi segnali di calcio non-oscillatorie è associato ad eventi patologici precoci che portano alla pancreatite acuta ^3,4. Questi includono attivazione intra-acinare proteasi, enzima secrezione ridotta e danno cellulare acinare. Il nostro laboratorio utilizza isolato acini pancreatici per studiare questi eventi patologici precoci che portano alla malattia, sia in vivo che in vitro ^5-7. I metodi qui descritti descrivono isolamento di cellule acinose primarie a scopo di misurare cylivelli di calcio tosolic e lesioni delle cellule. Viene inoltre fornito un metodo per l'infezione adenovirale di queste cellule.

Protocol

1. Preparazione acinose pancreatiche Cellule per Imaging di calcio

1. Preparare HEPES tampone di incubazione contenente HEPES 20 mM, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM _MgCl2, 1.3 mM CaCl _2, 10 mM di glucosio, 2 mM glutammina, e 1 × medie aminoacidi non essenziali del minimo Aquila. Regolare la soluzione finale a pH 7.4 con NaOH.
2. Preparare un tampone di incubazione aggiungendo BSA BSA (1% w / v finale) a 25 ml di tampone di incubazione HEPES (descritta sopra).
3. Preparare un tampone di digestione collagenasi aggiungendo 1,1 mg / ml (200 Unità / ml) di tipo-4 collagenasi e 1 mg / ml di inibitore della tripsina di soia per 6 ml di BSA tampone di incubazione (descritta sopra).
4. Acid-wash 22x22 mm coprioggetto immergendo in due parti HNO ₃ e una parte di HCl per 2 ore. Poi decantare con acqua deionizzata e conservare in etanolo al 70%.
5. Euthanize un mouse da CO ₂ asfissia. Orientare l'animale in posizione supina, e preparare la superficie addominale da cleAning con il 70% di etanolo. Eseguire una laparotomia per esporre la cavità addominale. Sezionare il pancreas e sciacquare immediatamente in una piccola barca a pesare contenente 6 ml di tampone di digestione collagenasi.
6. Sezionare grossi pezzi di vasi sanguigni di grassi o visibile, quindi rimuovere 5 ml di tampone di digestione collagenasi e aggiungerlo di nuovo al tubo da 15 ml.
7. Utilizzando sottili forbici dissezione tritare il pancreas nella piccola barca pesa contenente 1 ml di tampone di digestione collagenasi. Tritare fino a quando la soluzione risultante viene uniformemente disperso.
8. Trasferire il prodotto macinate in un pallone di Erlenmeyer da 125 ml di plastica, e aggiungere il restante 5 ml di tampone di digestione collagenasi al contenitore. Assicurarsi che il tessuto è completamente sommerso nel buffer.
9. Porre il pallone in un bagno di 37 ° C acqua e agitare a 90 rpm per 30 min. Durante questo breve periodo di inattività, preparare agonisti attivazione di calcio (ad esempio caerulein, carbachol) e sciacquare il coperchio lavata con acido 22x22 mmscivola con acqua deionizzata. Secco, e poi posto sulla cima di una superficie piana rivestita da film di laboratorio.
10. Dopo 30 min la digest è completa, trasferire la sospensione posteriore al tubo da 15 ml e permettono alle cellule di stabilirsi. Pipetta con cautela il tampone di digestione collagenasi e sostituirlo con 6 ml di tampone di incubazione BSA. Agitare vigorosamente il tubo a mano per 10 sec per disperdere le cellule in cluster più piccole. Subito dopo l'agitazione, rimuovere qualsiasi grande, detriti galleggianti da parte dei media instabili.
11. Lasciare le cellule rimanenti di stabilirsi, e scambiare i mezzi di comunicazione con il tampone di incubazione BSA fresca.
12. Ripetere il punto 1.11 due volte, fino a quando la sospensione è composta di soli piccoli cluster che sono solo finemente visibili ad occhio nudo. Le cellule dovrebbero assomigliare a quelli raffigurati nella Figura 1A (riga superiore).
13. Rimuovere il tampone di incubazione BSA e sostituirlo con HEPES tampone di incubazione.
14. Preparare una 750 micron, magazzino 100X di Fluo-04:00 nel 10% di DMSO.
15. Caricare le cellule nel tubo da 15 ml contenente la sospensione cellulare e HEPES BSA tampone privo di incubazione. Per fare questo, aggiungere un volume adeguato (diluizione 1:100) della soluzione di riserva alla sospensione cellulare. Poi piatto 500 ml di questa sospensione su ogni coprioggetto 22x22 mm.
16. Tenere coprioggetto al buio a temperatura ambiente. Prendere la prima a Ca ^{2 +} misurazioni 30 min dopo il caricamento. Il colorante viene rimosso automaticamente dal mezzo all'avviamento del perfusione, che dovrebbe avvenire 30 min dopo il caricamento colorante.

2. Misurazione di calcio in cellule acinose pancreatiche

1. Sciacquare ogni perfusione set-up con acqua deionizzata e riempire con una quantità appropriata di tampone o agonista. Prime ogni siringa con il tampone o agonista per assicurare il flusso corretto. Bloccare siringhe a un anello riposare circa 1-2 metri sopra il palco microscopio.
2. Utilizzare una pinzetta sottile di cogliere con attenzione dal suo bordo un vetrino sospensione cellulare contenente. Inclinare il coperchioslip 45 °, e lasciare il tampone in eccesso di defluire. Posizionare il coprioggetto sopra della guarnizione di gomma con cellule sulla parte superiore del vetrino, e montare la camera (Figure 2A e 2B).
3. Fissare la camera di perfusione alla fase e inserire il tubo che contiene tampone nel primo ingresso della camera (Figura 2C). Ruotare la siringa contenente tampone e permettere che il buffer di perfusione su tutta la superficie del vetrino. Quando il buffer ha raggiunto l'estremità opposta della camera, inserire una linea di vuoto dalla presa di vuoto. Inserire altri tubi (contenenti agonisti, inibitori, ecc) nella loro posizione appropriata lungo la camera.
4. Visualizzare le cellule utilizzando sia una, 1.4 Apertura obiettivo 200X o 400X numerico ed un laser ad argon per eccitare il colorante Fluo-04:00 alla lunghezza d'onda di 488 nm (Figura 1A, in basso). Le impostazioni di potenza del laser devono essere regolati in modo che il tubo fotomoltiplicatore (PMT) Non è saturato dalla luce emessa. Inoltre, la tensione attraverso il PMT deve essere ottimizzato per il rilevamento massima luce.
5. Segnali di emissione a lungo passaggio di> 515 nm sono raccolti a velocità fotogramma di 2-5 sec / frame per la visualizzazione di modelli di oscillatori lenti e 0,2-0,3 sec / frame per la visualizzazione più rapida, le onde di calcio globali (figure 3 e 4).
6. Dopo l'imaging, chiudere le siringhe e rimuovere tutti i tubi. Smontare la camera e ripetere i passaggi 2,2-2,4.
7. Raccogliere i dati come valori numerici di intensità di fluorescenza nel tempo e trasferimento immagine J (pacchetto software fornito come freeware dal National Institutes of Health e può essere trovato a http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
8. Guarda le immagini cellulari in tempo reale e di individuare le regioni di interesse (ROI, cioè apicale, basolaterale, nucleare, ecc)
9. Acquisire intensità di fluorescenza per queste zone di interesse e di represent come intensità di fluorescenza / basale intensità di fluorescenza (cioè F/F0).
10. Generare tracciati tracciando F / F ₀ vs tempo. Oltre ai tracciati, immagini rappresentative sono comunemente forniti e visualizzati utilizzando pseudocolore.

3. Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per saggi danno cellulare

1. Caldo DMEM F-12 supporti (senza rosso fenolo) a 37 ° C.
2. Aggiungere BSA (0,1% w / v finale) e HCl (50 mM finale) ai DMEM F-12 media.
3. Aliquotare 50 ml di DMEM in un tubo conico.
4. Preparare un buffer collagenasi aggiungendo 0,5 mg / ml (12 U / ml) di collagenasi di tipo IV da 10 ml di DMEM integrato F-12 media.
5. Euthanize un mouse da CO ₂ asfissia. Orientare l'animale in posizione supina, e preparare la superficie addominale con la pulizia con il 70% di etanolo. Eseguire una laparotomia per esporre la cavità addominale. Sezionare il pancreas e sciacquare immediatamente in una piccola barca di peso containing 6 ml di tampone di collagenasi.
6. Tritare il tessuto utilizzando sottili forbici dissezione per 3-5 minuti o fino a quando la soluzione risultante appare uniformemente disperso.
7. Trasferire il tessuto macinata ad una beuta Erlenmeyer da 125 ml con 5 ml di tampone di collagenasi supplementare, poi posto in un bagno d'acqua ° C 37 in agitazione a 90 rpm per 5 min.
8. Togliere dal shaker, consentono alle cellule di stabilirsi in breve, e lo scambio con 5 ml di tampone di collagenasi fresca. Poi incubare per un ulteriore 35 min in un bagno d'acqua ° C 37 con agitazione a 90 rpm.
9. Vigorosamente risospendere il digest con una pipetta di trasferimento fino a quando la sospensione appare omogenea senza grumi di cellule evidenti. Poi pipettare delicatamente la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon pre-bagnato in una beuta.
10. Vigorosamente Pipettare 3 ml di DMEM fresco aggiuntiva F-12 supporti (con collagenasi) attraverso la maglia, in modo da forzare attraverso qualsiasi celle rimanenti.
11. Aggiungere un altro 6-10 ml di DMEM F-12 media e unseguite la cellule per 2-3 min. Ripetere questa operazione due volte, e rimuovere il surnatante dopo il lavaggio finale.
12. Aggiungere DMEM fresco F-12 supporti, risospendere le cellule, e la piastra 500 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti. Le celle dovrebbero somigliare quelli raffigurati in Figura 1B.
13. Lasciare che la piastra di sedersi in un 37 ° C a bagnomaria a 90 rpm per 5 minuti prima di aggiungere agonisti.
14. Stimolare le cellule con diversi agonisti per 2-4 ore.
15. Inclinare la piastra con un angolo per permettere alle cellule di stabilirsi e Pipettare attentamente fuori una aliquota di mezzi (in genere 100 ml) e flash congelare in azoto liquido.
16. Flash congelare la sospensione cellulare rimanente. Flash congelamento non è essenziale per le misure di LDH. In qualità di campioni alternativi possono essere tenuti in ghiaccio se saranno analizzati il ​​giorno stesso o conservati in -20 ° C per la conservazione a lungo termine.

4. Misurare lattato deidrogenasi di dispersione

1. Ricostituire il substrato LDH (fornito nel kit) con 12 ml di tampone di saggio (anche fornito).
2. Scongelare sospensione cellulare campioni congelati e multimediali in un bagno di acqua a temperatura ambiente.
3. Tavola 50 microlitri di ciascun campione media in una piastra a 96 pozzetti.
4. Alla sospensione cellulare, aggiungere il volume necessario di tampone di lisi 10X in modo che la concentrazione finale è 1X. Brevemente nel vortex e incubare a 37 ° C per 60 min.
5. Centrifugare i campioni lisati a 250 xg per 4 min a detriti cellulari pellet.
6. Per lisati cellulari, piastra 50 pl di una diluizione 1:10 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
7. Aggiungere 50 ml di substrato ricostituito in ogni pozzetto, incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 min.
8. Bloccare la reazioneaggiungendo 50 microlitri della soluzione di arresto (fornito nel kit) a ciascun pozzetto.
9. Misurare l'assorbanza a 490 nm.
10. Utilizzare le seguenti formule per calcolare% di dispersione LDH. Le densità ottiche inferiori vengono corrette sottraendo un OD lettura vuota da un pozzo contenente solo PBS, substrato e soluzione di bloccaggio.

LDH nei media = (Media OD492) x (fattore di diluizione media) x (vol. di media) * Dal momento che è di solito necessario per diluire i campioni dei media, il fattore di diluizione sarà molto spesso equal1.

Totale LDH = ((lisato OD ₄₉₀₎ x (lisato fattore di diluizione) x (vol. in sospensione cellulare)) + ((Media OD ₄₉₀₎ x (fattore di diluizione) x (vol. di supporti aliquotati per il campionamento))

5. Infettare cellule acinose pancreatiche con Adenovirus

1. Prepararecellule acinose pancreatiche come descritto nella sezione 3.
2. Seguendo passo 3.12, aggiungere 10 ⁷ unità infettive (IFUS) di adenovirus alla sospensione cellulare e incubare per 30 min a 37 ° C.
3. Uniformemente piastra 2 ml di sospensione cellulare in una piastra da 6 pozzetti.
4. Per la maggior parte dei costrutti di espressione, le cellule devono essere adeguatamente infettati entro 18 ore, e per alcuni costrutti luciferasi, appena entro 6 ore.

Representative Results

Un esempio di misurazioni calcio delle cellule acinose in risposta a stimoli fisiologici è fornita in figura 3. Cellule acinose state caricate con il colorante calcio Fluo-4 e perfusi con l'acetilcolina analogico carbachol (CCH, 1 mM)) ^8. Cellule risposto nella forma di un'onda di calcio che avvia nella regione apicale e propaga alla regione basolaterale ^3,9. Tracciati Rappresentante mostrato in Figura 3B dimostrano il tipico modello di punta plateau comunemente osservato con 1 mM carbachol. Viceversa, utilizzando dosi sub-massimali della colecistochinina analogica caerulein (22:00) produce risposte di calcio oscillatorie (Figura 4) ^10.

Perdita di LDH dalle cellule acinose in risposta ad agonisti pancreatite induttori è mostrato in Figura 5. Qui mostriamo aumenta concentrazione-dipendenti perdite LDH in presenza di caerulein, carbachol, oppure tegli acidi biliari taurolithocholic acido 3-solfato (TLCS). Le concentrazioni necessarie per indurre la perdita massima di LDH sono coerenti con quelli richiesti per indurre l'attivazione della proteasi intra-acinare e segnalazione di calcio patologiche, suggerendo questi eventi che possono causare lesioni.

Cellule acinose sono state infettate con un adenovirus reporter di luciferasi, che è guidato dal promotore per un effettore Cn, fattore nucleare a valle di cellule T attivate (NFAT; Figura 6A). Forniamo i dati rappresentativi convalidano il nostro metodo di infezione, dimostrando concentrazione-e tempo-dipendente aumento dell'attività NFAT-luciferasi in presenza di TLCS (Figure 6B e 6C).

Figura 1. Immagini rappresentative di cellule acinose pancreatiche folcessivo varie preparazioni. (A) cellule dell'acino preparati per Ca ^{2 +} misurazioni, come visualizzato con ingrandimento 630X. Riga superiore raffigura microscopia in campo chiaro, riga in basso raffigura le cellule acinose caricate con il Ca ^{2 +} colorante Fluo-4 e osservata con un microscopio a fluorescenza. (B) cellule dell'acino preparati per analisi di citotossicità, come visualizzato con ingrandimento 400X.

Figura 2. . La camera di perfusione (A) La camera consiste di tre strati:. Una base di metallo, una guarnizione in gomma, ed un coperchio di plastica (B) La guarnizione di gomma è posto sulla parte superiore della base di metallo e coprioggetto 22x22 mm contenente cellule è posto verso l'alto sulla parte superiore della guarnizione di gomma. Il coperchio di plastica è avvitato alla base metallica ed un coprioggetto 18x18 mm viene posizionata sopra. (C) La camera è quindifissato alla fase microscopio. Tubing, contenente tampone o agonista, vengono immessi in insenature situate sul bordo della camera (freccia). Tubazione separata porta ad un vuoto (testa di freccia).

Figura 3. Un tipico segnale calcio picco-plateau dopo stimolazione con carbachol (1 mM). (A) Da sinistra a destra; Luminoso vista campo di un acino etichettati in (A) pical e (B), le regioni asolateral di interesse da una cellula acinare. Le cellule sono state caricate con l'indicatore di calcio Fluo-4 (5 mM). Dopo stimolazione con carbachol fisiologica (1 mM; analogici Ach), immagini successive mostrano l'inizio del segnale calcio nella regione apicale seguito dalla propagazione alla regione basale (B) Ogni immagine pannelli (1-4), corrisponde ad un frame. lungo un tracciato rappresentativo della variazione di fluorescenza nel tempo per ciascuna regione di interesse. Le immagini sonorappresentato in falsi colori con una scala di colori (in basso a destra). Frecce sinistra e destra mostrano il tempo di primo aumento di calcio nelle regioni apicali e basali, rispettivamente. Questo dato è stato originariamente pubblicato sul Journal of Biological Chemistry. (Orabi AI, Shah AU, Muili K., Luo Y., Mahmood SM, Ahmad A., Reed A., Husain SZ Etanolo migliora attivazione della proteasi carbachol indotta e accelera le onde di calcio isolato in acini pancreas di ratto. The Journal of Biological Chemistry , 2 86, 14.090-14.097 (2011)).

Figura 4. Una tipica oscillazione di calcio dopo la stimolazione caerulein (22:00). (A) Variazioni intero calcio citosolico delle cellule è stata misurata una volta al secondo per time-lapse microscopia confocale utilizzando il calcio colorante Fluo-4 / AM. Le immagini sono rappresentati in falsi colori con un colore di scale (in alto a destra). (B) Rappresentante trama di fluorescenza nel tempo sono stati registrati da una singola cellula trattata con caerulein (10:00) a pH 7,4. Questo dato è stato originariamente pubblicato sul Journal of Biological Chemistry. (Reed AM, Husain SZ, Thrower E., Alexandre M., A. Shah, Gorelick FS, Nathanson MH basso pH extracellulare induce danni al pancreas acinose cellulare da calcio Migliorare Segnalazione The Journal of Biological Chemistry, 286, 1919-1926 ( 2011)).

Figura 5. Misurando danno cellulare da cellule acinose trattate con agonisti pancreatite vari induttori. Nelle cellule acinose isolate, lattato deidrogenasi (LDH) dispersione è stato utilizzato come un biIndicatore ochemical di lesioni. Cellule acinose isolate sono state trattate con concentrazioni variabili di (A) caerulein (1-100 nM) (B) carbachol (1 mM -1 mM) e (C) TLCS (50-500 mM), e% LDH dispersione è stata misurata dopo 2 hr. (N = 3). #, *, P <0,05 rispetto al controllo e TLCS solo, rispettivamente.

Figura 6. Misurare l'attività luciferasi in cellule acinose pancreatiche infettati con adeno-NFAT-luciferasi. (A) Schema per l'infezione di topo cellule pancreatiche acinose primarie con adenoviral NFAT-luciferasi. (B) Amministrazione di TLCS (5-500 micron) indotta da attività NFAT-luciferasi. (C) Naturalmente il tempo dimostrando accumulo di luminescenza con TLCS (500 micron) somministrata per un 6hr periodo. (N = 3). *, #, P <0,05, rispetto al controllo o TLCS solo, rispettivamente.

Discussion

Il metodo di isolamento delle cellule e saggi successivi raffigurati qui rappresentano potenti strumenti con cui studiare le caratteristiche fisiologiche e fisiopatologiche del pancreas esocrino. Il metodo per isolare le cellule acinose pancreatiche dispersi è stato descritto da Amsterdam e Jamieson nel 1972 ^11. I metodi qui presentati sono stati adattati da più recenti metodi di isolamento descritte da Van Acker e colleghi ^12. Sebbene queste tecniche sono altamente riproducibili e facilmente appreso, ci sono diverse caratteristiche critiche per ogni metodo che deve essere eseguita con precisione. La comprensione di questi dettagli tecnici consentirà di facilitare la risoluzione dei problemi e una migliore applicazione.

Nel preparare le cellule per misurazioni di calcio, abbiamo scoperto che il pancreas da roditori più giovani produce risultati più coerenti. Gli acini sono più uniformemente distribuito, forse perché contengono meno tessuto fibro-adiposo. Per Ca ^{2 +} misurazione, preparano piccoli acini per l'imaging ottimale singola cellula. Ciò richiede una maggiore concentrazione collagenasi (1,1 mg / ml o 200 U / ml) rispetto a quello utilizzato per le misurazioni LDH. Per le misure di LDH, prepariamo grandi acini perché questo metodo provoca meno danni al basale. La preparazione, quindi, riceve una concentrazione inferiore collagenasi (0,5 mg / ml o 91 U / ml).

Per il Ca ^{2 +} misurazioni, è fondamentale che le cellule essere placcato su vetrini lavata con acido. Lo scopo della acido-lavaggio è di fornire una superficie pulita e interazioni elettrostatiche che permetteranno la massima adesione della acini. Cella Tak (BD Bioscience) può essere usato al posto di o in aggiunta a questo metodo. Inoltre, è fondamentale che il Ca ^{2 +} colorante viene caricato in un buffer di incubazione BSA-libero in ordine (1) per evitare che il colorante di legarsi a BSA e (2) per consentire la acini di aderire al massimo ai coprioggetti lavata con acido .

t "> La camera di perfusione descritto è stato progettato su misura. camere di commercio e sistemi di flusso, tuttavia, sono disponibili attraverso la Warner Instruments. Oltre alla perfusione, la creazione di un vuoto adeguatamente regolamentato è un fattore critico nel prevenire le cellule acinose vengano aspirati l' coprioggetto.

Quando si misurano segnali di calcio dalle cellule acinose pancreatiche, si descrive l'uso di un microscopio confocale. Confocale imaging utilizza un foro di fronte a un tubo fotomoltiplicatore per eliminare la luce da sopra o sotto il piano focale. In contrasto, l'imaging a grande campo rileva la luce in tutto il percorso di eccitazione del campione, che consente fuori fuoco luce (cioè la luce sopra e sotto il piano desiderato fuoco) per contaminare l'immagine di fluorescenza del campione. Il vantaggio di microscopia confocale oltre a grande campo è che permette di sezione sottile di immagini di un campione, nonché ricostruzione 3D di fette ottici raccolti insiemeun asse Z. Inoltre, la microscopia confocale offre sistemi di raccolta ad alta velocità in grado di catturare i cambiamenti veloci in fluorescenza di calcio con un disco rotante, line scanner, sweptfield scanner o regioni addirittura sceso da uno scanner punto.

Cambiamenti spaziali e temporali di calcio schemi di segnalazione, come le onde e oscillazioni, rispettivamente, possono essere misurati attendibilmente con il F / F ₀ calcolo, ma questo non è un vero indicatore di [Ca ^{2 +].} Le misure quantitative di [Ca ^{2 +]} può essere calcolato utilizzando un'unica lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione di coloranti calcio, come Fluo-4, anche se gli errori possono verificarsi in queste misure a causa di photobleaching e tintura perdita ^13,14. [Ca ^{2 +]} può essere misurata più accuratamente utilizzando coloranti raziometrici, come Fura2 o Indo1 ^15, ma questo è poco pratico su microscopi confocali più a causa del requisito di un laser UV per l'eccitazione. D'altra parte, concomitant uso di Fluo-3 o Fluo-4 e Fura-Red può consentire l'imaging rapporto utilizzando la linea 488 nm di eccitazione che è presente sulla maggior parte dei microscopi confocali ^16.

Perdite LDH è uno strumento sensibile per misurare lesione delle cellule acinose ^7,17. Un altro metodo complementare è propidio ioduro ^18. Infezioni da adenovirus raggiungere elevati tassi di infezione in colta acini ^19. La concentrazione del virus può essere necessario titolato. Inoltre, è utile per fornire condizioni di controllo comparabili in cui un altro costrutto adenovirale irrilevante è anche infettato. La maggior parte dei nostri studi infezione durano meno di 12 ore. Tuttavia, per periodi più lunghi, gli antibiotici possono essere aggiunte al mezzo DMEM-F12, in via preliminare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 um pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110