Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.
Hier presenteren we een workflow om de metabolische profielen te analyseren voor biologische monsters van belang, met inbegrip, cellen, serum of weefsel. Het monster wordt eerst gescheiden in polaire en niet-polaire fracties met een vloeistof-vloeistof fase-extractie, en gedeeltelijk gezuiverd downstream analyse te vergemakkelijken. Beide waterige (polaire metabolieten) en organische (niet-polaire metabolieten) fasen van de aanvankelijke extractie worden verwerkt tot een groot aantal metabolieten onderzoeken. Metabolieten worden gescheiden door verschillende vloeistofchromatografie methoden gebaseerd op hun partitie eigenschappen. In deze methode presenteren we microflow hoogperformante (UP) LC methoden, maar het protocol is schaalbaar tot hogere stromen en lagere drukken. Inleiding in de massaspectrometer kan via algemene of samengestelde geoptimaliseerde bron voorwaarden. Detectie van een breed scala van ionen wordt in volledige scan mode uitgevoerd in zowel positieve als negatieve wijze over een breed m / z assortiment met een hoge resolutie op een recent calibrated instrument. Label-free differentiële analyse wordt uitgevoerd op bioinformatica platforms. Toepassingen van deze aanpak zijn metabole route screening, de ontdekking van biomarkers en de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Als gevolg van recente technologische ontwikkelingen op het gebied van HRMS, hebben ongerichte, hypothese-genererende metabolomics aanpak een haalbare aanpak worden voor de analyse van complexe monsters. 1 massaspectrometers staat 100000 resolutie vergemakkelijken routine lage deel per miljoen (ppm) nauwkeurigheid van massa's zijn op grote schaal te worden beschikbaar zijn van meerdere leveranciers. 2,3 Dit nauwkeurigheid van massa mogelijk maakt grotere specificiteit en het vertrouwen in een voorlopige toewijzing van de identiteit analyt, isotopische patroonherkenning, en adduct identificatie. 4 In combinatie met een geschikte extractiemethode en high-performance LC of UPLC, complexe mengsels kunnen worden geanalyseerd met extra specificiteit afgeleid van retentietijdgegevens. 5 UPLC bezit chromatografische grotere efficiëntie en maakt een grotere gevoeligheid, resolutie en analysetijd die een grotere dekking van de mogelijke metabolome. 6 De resulterende grote datasets kan worden geïntegreerd in elkevan meerdere differentiële analyse software en ontgonnen bruikbare patronen of individueel te bepalen analyten. 7,8,9,10,11 Vermeende treffers kan in eerste instantie worden geïdentificeerd met behulp van een combinatie van piek-detectie-algoritmen, accurate massa gebaseerde chemische formule voorspelling, fragmentatie voorspelling, en chemische zoeken in databanken. Deze aanpak maakt prioritering van doelstellingen voor tijdrovende volledige structurele identificatie of voor de ontwikkeling van gevoeliger en specifieker stabiele isotoop verdunning UPLC / geselecteerde of meerdere reactie bewaking / MS studies dat de huidige gouden standaard methoden voor het kwantificeren zijn. 12
De wisselende aard van de biologische monsters heeft geleid tot optimalisatie van extractie protocollen voor urine 13 cellen 14, 15 serum of weefsel 16. Dit protocoleigenschappen extracties voor cellen, serum en weefsel. In voorkomend geval, zijn commentaar en extra verwijzingen opgenomen voor aanpasgen van de procedure opname van stabiele isotopen pakken, of voor opname van bijzonder onstabiel metabolieten.
Ongerichte metabolomics biedt een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van endogene of lichaamsvreemde biotransformaties, of het vastleggen van een metabool profiel van een steekproef van belang. De uitgang van de techniek schalen met de resolutie en de gevoeligheid van de gebruikte te scheiden en analyseren van het monster, het vermogen om te gaan met de grote datasets gegenereerd technologie, en de mogelijkheid om de dataset voor nuttige informatie (bv. accurate massa zoeken in databanken) delven. Onlangs…
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen de steun van NIH beurzen P30ES013508 en 5T32GM008076. We danken ook Thermo Scientific voor de toegang tot ZEEF 2.0 en Drs. Eugene Ciccimaro en Mark Sanders van Thermo Scientific voor nuttige discussies.
Reagent | |||
Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
Equipment | |||
High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |