Summary
يوفر تشتته الايض فرضية توليد قطة من الملف الشخصي الأيضية. سوف يشكل هذا البروتوكول شرح استخراج وتحليل نواتج الأيض من الخلايا، المصل، أو الأنسجة. يتم شملهم الاستطلاع مجموعة من نواتج الأيض باستخدام الاستخلاص في الطور السائل السائل، تتدفق ultraperformance السائل اللوني / عالية الدقة قياس الطيف الكتلي (UPLC-HRMS) إلى جانب لبرامج التحليل التفاضلي.
Abstract
هنا نقدم سير العمل لتحليل ملامح التمثيل الغذائي للعينات البيولوجية من الفائدة بما في ذلك؛ الخلايا، المصل، أو الأنسجة. يتم فصل العينة الأولى إلى الكسور القطبية وغير القطبية من قبل الاستخلاص في الطور السائل السائل، وتنقيته جزئيا لتسهيل تحليل المصب. تتم معالجة كل مائي (الأيض القطبية) والعضوية مراحل (مستقلبات غير القطبية) من استخراج الأولية لمسح مجموعة واسعة من المركبات. يتم فصل نواتج الأيض من قبل مختلف أساليب اللوني السائل على أساس خصائص التقسيم الخاصة بهم. في هذه الطريقة، فإننا نقدم تتدفق فائقة الأداء (UP) طرق LC، إلا أن البروتوكول هو تحجيم لارتفاع التدفقات والضغوط أقل. مقدمة في مطياف الكتلة يمكن أن تكون إما من خلال الظروف المصدر الأمثل عامة أو مركب. ويتم الكشف عن مجموعة واسعة من الأيونات في وضع المسح الضوئي الكامل في وضع حد سواء الإيجابية والسلبية على م / ض مجموعة واسعة باستخدام وارتفاع القرار مؤخرا على جalibrated الصك. ويتم تسمية خالية من التحليل التفاضلي من على منصات المعلوماتية الحيوية. وتشمل تطبيقات هذا النهج التمثيل الغذائي فحص المسار، واكتشاف العلامات البيولوجية، وتطوير العقاقير.
Introduction
بسبب التطورات التكنولوجية الحديثة في مجال إدارة الموارد البشرية، وأصبحت غير مستهدفة، وتوليد فرضية نهج الايض نهجا عمليا لتحليل العينات المعقدة. 1 الطيف الشامل قادرة على 100،000 قرار تسهيل جزءا روتينيا منخفضة لكل مليون (جزء في المليون) دقة الشامل أصبحت على نطاق واسع المتاحة من بائعين متعددين. 2،3 هذه الدقة الشامل يسمح توخي المزيد من الدقة والثقة في مهمة أولية للهوية الحليلة، والتعرف على نمط النظائر، وتحديد معقد إضافي. 4 عندما يقترن إجراء استخراج مناسبة وعالية الأداء LC أو UPLC، مخاليط معقدة يمكن تحليلها مع خصوصية إضافية مستمدة من بيانات الوقت الاحتفاظ. 5 UPLC تمتلك أكبر كفاءة الكروماتوغرافي ويسمح حساسية أكبر، والقرار وتحليل الوقت مما يجعل تغطية أشمل للmetabolome ممكن. 6 هل يمكن دمج مجموعات البيانات الكبيرة الناتجة إلى أيمن عدة برامج التحليل التفاضلي والملغومة لأنماط مفيدة أو التحاليل فرد من الفائدة. 7،8،9،10،11 الفعالية المزعومين يمكن تحديدها في البداية باستخدام مزيج من خوارزميات الكشف عن ذروة ودقيقة على التنبؤ الصيغة الكيميائية الشامل، والتنبؤ تجزئة، و البحث في قاعدة البيانات الكيميائية. يسمح هذا النهج تحديد أولويات الأهداف لتستغرق وقتا طويلا تحديد هيكلية كاملة أو لتطوير أكثر حساسية وأكثر تحديدا مستقرة تخفيف النظائر UPLC / المحددة أو متعددة رد فعل الرصد / دراسات MS التي هي الأساليب الذهب القياسية الحالية لتقدير 12
وقد أدى طبيعة متفاوتة من العينات البيولوجية لتعظيم الاستفادة من البروتوكولات استخراج البول ل13، 14 الخلايا، المصل 15، 16 أو الأنسجة. هذه الميزات بروتوكول الكميات المستخرجة للخلايا، ومصل، والأنسجة. حيثما كان ذلك مناسبا، وقد أدرجت التعليقات ومراجع إضافية لmodificaستعقد الإجراء لمعالجة إدراج النظائر المستقرة، أو لإدراج نواتج الأيض خصوصا غير مستقر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. استخراج عينة من خلايا
- لسم لوحة 10 من الخلايا: جمع 1.5 مل من تعليق خلية رفع في وسائل الإعلام إلى ما قبل صفت 10 مل زجاج أنبوب الطرد المركزي. لخطوط ملتصقة، ينبغي رفع الخلايا مع تجريف لطيف في 1.5 مل من وسائل الاعلام أبقى على الجليد الاختياري: إذا تم استخدام المعايير الداخلية، إضافة قسامة المناسبة في هذه الخطوة.
تعليق: تسقيه من الأيض الخلوي هو أمر حاسم لبعض نواتج الأيض. لتحليل نواتج الأيض حساسة للوقت، ينبغي النظر في إجراءات مثل استخراج الميثانول الباردة. 17 - إضافة 6 مل من الكلوروفورم (CHCL 3) / الميثانول (CH 3 OH) (2:1، V / V) إلى كل من أنابيب زجاجية 10 مل تحتوي على العينات. تعيين العينات في شاكر أو متعدد vortexer على سرعة منخفضة لمدة 30 دقيقة. بعد الهز، وطرد العينات مع انخفاض التسارع / التباطؤ الإعداد في 1،935 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لفصل تماما مراحل.
اختياري 3، الاستخراج يمكن أن تجرى مع ثنائي كلورو ميثان (CH 2 الكلورين 2) 18،12. - باستخدام الجذعية طويلة باستور ماصة، ونقل طبقة العضوية (أسفل) إلى ما قبل صفت 10 مل زجاج أنبوب الطرد المركزي الجديدة. تواصل 4.1.
- نقل مائي العليا في وقت لاحق إلى نظيفة من البلاستيك 2 مل أنبوب إيبندورف. تتبخر العينة تحت غاز النيتروجين. تواصل 2.6.2 لمائي مرحلة إزالة الملوحة أو الاستمرار في 4.1 لتحليل المباشر.
2. استخراج عينة من مصل الدم
- نقل 20 ميكرولتر من المصل إلى البلاستيك 2 مل أنبوب إيبندورف الاختياري: إذا تم استخدام المعايير الداخلية، إضافة قسامة المناسبة في هذه الخطوة.
- إضافة 190 ميكرولتر من CH 3 OH ودوامة لمدة 10 ثانية.
- إضافة 380 ميكرولتر من CHCL 3 ودوامة لمدة 10 ثانية.
- إضافة 120 ميكرولتر من H 2 O للحث على مرحلة الانفصال. دوامة العينات لمدة 10 ثانية، والسماح لتتوازن في RT لمدة 10دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 8،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لفصل مراحل.
- نقل المرحلة العضوية إلى أقل من البلاستيك نظيفة 2 مل أنبوب إيبندورف. تواصل 4.1.
- نقل مائي العليا في وقت لاحق إلى نظيفة من البلاستيك 2 مل أنبوب إيبندورف. تتبخر العينة تحت غاز النيتروجين.
- اعادة تعليق العينة في 200 ميكرولتر H 2 O. حمض أو قاعدة الكواشف (0.1٪ حامض الخليك، حامض الفورميك أو 0.1٪ هيدروكسيد الأمونيوم) يمكن أن تستخدم لاستخراج تفضيلي الأيض الحساسة درجة الحموضة. يصوتن لمدة 20 دقيقة على الجليد لاعادة تعليق العينة تماما.
- تفعيل الأعمدة تدور C18 مع 500 ميكرولتر CH 3 OH.
- يوازن عمود الدوران مع اثنين من يغسل من 500 ميكرولتر H 2 O ثم تحميل العينة. إذا تم استخدام حمض / قاعدة الكواشف الحفاظ على هذا التركيز في الخطوات يغسل.
- يغسل مع 500 ميكرولتر H 2 O إلى desalt العينة. مرة أخرى، إذا تم استخدام حمض / قاعدة الكواشف الحفاظ على هذا التركيز في غسلالخطوات.
- أزل مع مجلدين من 200 ميكرولتر 80٪ CH 3 OH في H 2 O إلى ما قبل المسمى نظيفة 2 مل أنبوب إيبندورف. مرة أخرى، إذا تم استخدام حمض / قاعدة الكواشف الحفاظ على هذا التركيز في الخطوات يغسل. تواصل 4.1.
3. استخراج عينة من الأنسجة
- اعتمادا على الأنسجة، واستخدام ما بين 10-100 ملغ من الأنسجة المجمدة. إضافة قطعة كاملة من الأنسجة إلى ما قبل المسمى 2 مل منخفضة الاحتفاظ أنبوب إيبندورف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (1 M، ودرجة الحموضة 6.8) في حمام جليدي الاختياري: إذا تم استخدام المعايير الداخلية، إضافة إلى المخزن المؤقت، قبل أن يضيف الأنسجة.
- تجانس الأنسجة في الجليد مع طاحونة الأنسجة الكهربائية لمدة 30 ثانية في كل إيبندورف. بين العينات، وتنظيف طاحونة الأنسجة في اثنين من أنابيب منفصلة تحتوي على CH 3 OH و H 2 O، على التوالي.
- نقل جناسة الأنسجة مع ماصة بلاستيكية إلى ما قبل صفت 10 مل زجاج أنبوب الطرد المركزي. بعد نقل، وشطف كل أنبوب إيبندورف2X مع 1 مل من CH 3 OH وإضافة يغسل إلى جناسة الأنسجة في أنابيب زجاجية.
- إضافة 4 مل من CHCL 3 إلى كل من أنابيب زجاجية 10 مل تحتوي على جناسة الأنسجة وCH 3 OH يغسل. تعيين العينات في شاكر أو متعدد vortexer على سرعة منخفضة لمدة 30 دقيقة.
- بعد الهز، وأجهزة الطرد المركزي العينات مع انخفاض التسارع / التباطؤ الإعداد في 1،935 x ج لمدة 10 دقيقة لفصل تماما مراحل الاختياري:. لتجنب استخدام الكلوروفورم، وقد تم تطوير عمليات الاستخراج مع الكلورين CH 2 2.
- باستخدام الجذعية طويلة باستور ماصة، ونقل طبقة العضوية (أسفل) إلى ما قبل صفت 10 مل زجاج أنبوب الطرد المركزي الجديدة. تواصل 4.1.
- باستخدام الجذعية طويلة باستور ماصة، ونقل الطبقة المائية إلى ما قبل صفت 10 مل زجاج أنبوب الطرد المركزي الجديدة. الذهاب إلى 2.6.2 لتحلية أو تستمر إلى 4.1.
4. اعادة تعليق والترشيح من العينات لUPLC
- تتبخر عصيدةليه تحت غاز النيتروجين.
- جفت إعادة أسفل عينات في حجم مناسب من الحل بداية لطريقة UPLC المطلوب (انظر الجدول 1). 50-100 ميكرولتر وعادة ما يكون حجم إعادة تعليق مرغوب فيه. دوامة بلطف و / أو ماصة العينة صعودا وهبوطا للمساعدة في حل التحاليل.
- نقل العينة إلى 0.22 ميكرون تصفية النايلون أنبوب وتدور بسرعة تصل إلى 14،000 XG حتى اجتاز عينة تماما من خلال فلتر (~ 5 دقائق). تأكد من أنه لا توجد رواسب مرئية المتبقية في العينة.
- نقل طاف من العينة التي تمت تصفيتها إلى قارورة UPLC قبل المسمى مع إدراج. قارورة كاب، ثم نفض الغبار القارورة لإزالة أي فقاعات من الجزء السفلي من القارورة عينة. وضع العينة في الاوتوماتيكى المبردة (4-5 درجة مئوية).
5. إعداد UPLC
- باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لالكروماتوجرافي السائل، وخلق لخوض انتخابات العينة العضوية القائم قبالة من الشروط المذكورة في
- السماح للUPLC لكي تتوازن بشكل كاف. ينبغي أن يشمل ذلك فتيلة كامل من المذيبات قبل إرفاق عمود، وبعد توجيهات الشركة المصنعة لحجم موازنة من عمود جديد (عادة 3-5 حجم العمود). المحافظة على سجل من بدء عودة الضغوط للمساعدة في تشخيص مشاكل في المستقبل.
6. إعداد مطياف الكتلة
- باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لارتفاع مطياف الكتلة القرار، إنشاء أسلوب وضع إيجابي باستخدام الشروط المذكورة في الجدول رقم 2. ثم استخدام نفس الظروف، إنشاء أسلوب وضع سلبي الاختياري: إذا مجموعة معروفة من analytes المستهدفة هي من كثافة عاليةerest، المصدر الأمثل وظروف البصريات باستخدام الثقيلة المسمى النظير من هذه المركبات، وتوليد طريقة استخدام هذه الشروط.
- تنظيف ومعايرة أجهزة القياس، إنشاء رذاذ مستقرة في مطياف، وإتاحة الوقت من أجل حل المعايرة لتبديد كاف من المصدر والبصريات. استقرار مقبولة من رذاذ ينبغي أن تعطي 3-5٪ RSD من شدة أكثر من 100 على الأقل بالاشعة مع حقن محلول المعايرة في معدل تدفق نفس الأسلوب LC المستخدمة.
- إعداد تسلسل لجميع العينات، تعيين حجم الحقن المناسبة، وتشغيل فارغة قبل العينة الأولى. إذا اشتبه في المرحل أو مصفوفة التأثيرات بين العينات، تشغيل الفراغات الكافية / يغسل. يجب أن تكون العينات الإعداد بطريقة عشوائية باستخدام مولد رقم عشوائي ومفتاح لتجنب أي آثار دفعة عرضته التحليل.
تعليق: عينات مراقبة الجودة بما في ذلك المعايير النظائر مستقرة أو المعايير التحليلية من الأهداف المحتملة يمكن أن تكونقيمة للغاية في استكشاف وضمان نتائج موثوقة، واستنساخه، وصالحة. A تكرار التقنية لعينة القياسية فقط تليها فارغة المذيبات يمكن استخدامها ليصل إلى الانحراف من شدة الإشارة والوقت الاحتفاظ، وكذلك المرحل إلى المدى فارغة. - يبدأ تسلسل ومراقبة دورية لمشكلات، منها تقلبات الضغط، أو فقدان كثافة إشارة عبر المدى. إذا تم الكشف عن مشاكل حادة، والتوقف عن المدى، وتكرار من 6.2.
7. التحليل التفاضلي
- وتعرض اثنين من مهام سير العمل لهذا البروتوكول. الأول هو من خلال SIEVE 2.0، والملكية خالية من التسمية برامج التحليل التفاضلي المباعة من قبل الحرارية فيشر. سير العمل الثاني هو من خلال XCMS على الانترنت، منبرا حرا من خلال معهد سكريبس للأبحاث. 11 قبل البدء في تحليل التفاضلي، يدويا التحقق من التشنجات اللاإرادية أو إلقاء نظرة على المخططات الاستشرابية تصفيتها لأي المجمع المعروف في العينة لضمان استنساخ أشواطوحقن / UPLC / رذاذ الاستقرار في جميع العينات.
- SIEVE
- نقل ملفات البيانات الخام من مطياف الكتلة إلى محرك الأقراص الثابتة من محطة العمل حيث تم تثبيت غربال. (ملاحظة: تشغيل SIEVE مع البيانات المخزنة على شبكة أو منفذ USB محرك الأقراص متصلا ليس من المستحسن لأنها يمكن أن تحد من سرعة تحليل.)
- فتح SIEVE، والبدء في تجربة جديدة.
- تحميل الملفات المناسبة في غربال.
- تعيين مجموعات المقارنة وتحديد ملف مرجعية واحدة للسماح SIEVE لتوليد المعلمات للتحليل.
- اتبع المطالبات وضبط أية معلمات فقا لمتطلبات من أي تجربة فردية. غالبا ما يكون من المستحسن أن تبدأ مع المعلمات صرامة ومن ثم أعود وتخفيف المعلمات كما يمكن ضبط أكثر سخاء إطالة وقت التحليل.
- تحميل قائمة معقد إضافي الصحيح لوضع ايجابي أو سلبي في المعلمات.
- XCMS على الانترنت
- تحويل ملفاتإلى تنسيق مقبول لXCMS أون لاين. في حالتنا، ونحن لتحويل شكل mzXML 19
- XCMS مفتوحة على الانترنت، وخلق الوظائف.
- تحميل وتسمية مجموعات البيانات. مجموعات البيانات اثنين فقط (على سبيل المثال التحكم مقابل العلاج) يمكن تحميلها كما XCMS مستقل يقتصر على مقارنات وجها لوجه.
- حدد الإعدادات المطلوبة من القائمة المنسدلة. هي المعلمات ما قبل بالسكان المتاحة للالاجهزة الأجهزة المختلفة، وهذه يمكن مواصلة تعديلها لتلبية الاحتياجات التجريبية. في حالتنا، ونحن نستخدم الإعدادات HPLC-Orbi2.
- تقديم وتأكيد العمل.
- تحليل البيانات
- لغربال وXCMS قائمة أطر والميزات، على التوالي، سوف يتم ملؤها بمجرد الانتهاء من التحليل. ضمان أن محاذاة LC يعلو أي قمم المعالم السياحية. إذا كان أي من أشواط LC محاذاتها تظهر انحراف كبير في قمم المعالم السياحية قد يشير هذا إلى مشكلة مع العينة.
اختياري: لSIEVE، إذا تم استخدام المعايير الداخلية، موقعالمجموعة المقابلة وتطبيع الذروة إلى الإطار المحدد. لXCMS على الخط، ويمكن أن يتم التطبيع في جدول بيانات بعد التصدير. - رسم البيانات بواسطة معامل الاختلاف (CV) ضمن عينة السكان مثل (مثل عينات مراقبة). قد يشير إلى أية قيم CV كبير مشكلة مع عينة واحدة أو أكثر. فرز قائمة على أساس الصفات المرغوبة (مثل القيمة P <0.05، تغيير طية> 1.5 والانحراف المعياري منخفض ضمن مجموعة، الخ).
- فحص كل الذروة لذروة المحاذاة المناسبة عبر مجموعات، والتكامل الذروة، ذروة جاوس الشكل، وكثافة إشارة، النظائر، وتعيين معقد إضافي.
- تصدير البيانات كما تريد لمزيد من التحليل أو لتوليد قوائم الكتلة المستهدفة لتأكيد وMS N التجارب.
- لغربال وXCMS قائمة أطر والميزات، على التوالي، سوف يتم ملؤها بمجرد الانتهاء من التحليل. ضمان أن محاذاة LC يعلو أي قمم المعالم السياحية. إذا كان أي من أشواط LC محاذاتها تظهر انحراف كبير في قمم المعالم السياحية قد يشير هذا إلى مشكلة مع العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج المقدمة تظهر البيانات المحددة من العلاج 6 ساعة من خلايا ورم أرومي دبقي SH-SY5Y مع المبيد والميتوكوندريا معقدة أنا المانع روتينون. للإيجاز، يتم تقديم البيانات الوسيلة الوحيدة العضوية مرحلة ايجابية. تم تجهيز العينات وتحليلها كما هو موضح أعلاه (الشكل 1، الجدول 1، الجدول 2) وتحميلها على منصتين التحليل التفاضلي لتسمية خالية الكمي، غربال وXCMS على الانترنت. على الرغم من أن عددا كبيرا من الفعالية (الشكل 2، الشكل 3) يتم تحديدها من قبل البرنامجين تستخدم لتحليل الفرق وتشمل هذه الميزات التحف الأرجح، قمم متكاملة على نحو رديء، وغيرها من الميزات ذات قيمة تحليلية مشكوك فيها. يمكن الحكم على ذلك من خلال فحص والفعالية لشدة الإشارة المناسبة، والتباين المنخفض بين عينات من نفس المجموعة، ومستويات الخلفية، وحسن الكروماتوغرافي الأشكال الذروة (الشكل 3).
للتدليل على downstreصباحا تأكيد الفعالية الأولي، ونحن عزل ميزة مع كتلة المقابلة لدينا علاج روتينون مركب خلال 3 جزء في المليون (الشكل 3، الشكل 4). ونحن نؤكد على هوية هذه الحليلة مع UPLC-HR/tandem قياس الطيف الكتلي (MS / MS) من عينة لدينا والمركب النقي (الشكل 5). ونحن أيضا تحديد ميزة وفرة تفاضلي خفض في المجموعة روتينون المعالجة، والتي تم تحديدها مبدئيا كما D-pantethine من قبل دقيقة قاعدة بيانات البحث الشامل (الشكل 3).
الشكل 1. مخطط التجريبية العامة لإعداد العينات وتحليلها من قبل Microspray UPLC-HRMS. الخطوط العامة لإعداد العينات، بما في ذلك إدخال اختياري من المعايير الداخلية والبروتين أو الدهون / تحليل محتوى البروتين. فصل المرحلة، اللوني السائل، وتحليل من قبل مختلف IOوترد وسائط N في مطياف الكتلة.
الجدول 1. شروط UPLC. العامة ومجمع الظروف UPLC الأمثل. وبالنسبة للمرحلة العضوية 1، ومعدل تدفق ثابت من 1.8 ميكرولتر / دقيقة من خلال مياه nanoACQUITY C18 BEH130 عمود يوضع في سخان في 35 ° C تم استخدامها. مذيب ج: 99.5٪ water/0.5٪ الأسيتونتريل مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪، المذيبات B: 98٪ الأسيتونتريل / 2٪ من المياه مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ بالنسبة للمرحلة العضوية 2، معدل تدفق ثابت من 3.4 ميكرولتر / دقيقة عن طريق اكسبرس عمود C8 Acentis يوضع في سخان في 35 ° C تم استخدامها. المذيبات A: 40٪ water/20٪ الأسيتونتريل مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ و 10 ملي فورمات الأمونيوم، المذيبات B: 90٪ isopropanol/10٪ الأسيتونتريل مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ و 10 ملي فورمات الأمونيوم للالمرحلة المائية، ومعدل التدفق المستمر لل 1.2 μ لتر / دقيقة عن طريق مياه nanoACQUITY C18 BEH130 عمود يوضع في سخان في 35 ° C تم استخدامها. مذيب ج: 95٪ من المياه / 5٪ الميثانول بنسبة 0.1٪ الأمونيوم هيدروكسيد، المذيبات B: 95٪ الميثانول / 5٪ من المياه بنسبة 0.1٪ هيدروكسيد الأمونيوم.
الشكل 2. مرآة القطعة ولدت مع XCMS. مؤامرة مرآة تظهر ملامح وفيرة تفاضلي كما الكشف عن وكميا من خلال XCMS على الانترنت من المرحلة العضوية الإيجابية وضع تحليل UPLC-MS. كل نقطة تمثل "ميزة". متميزة النقاط الخضراء هي ميزات أكثر وفرة (أكبر منطقة متكاملة) في السيطرة، في حين أن النقاط الحمراء هي أكثر وفرة في العلاج. زيادة حجم نقطة يشير إلى زيادة حجم التغير أضعاف بين المجموعات، وكثافة اللون يشير إلى تناقص ف القيمة مع زيادة تشبع اللون.
الشكل (3). قمم الحليلة. الاستشرابية تبين العضوية مرحلة وضع ايون ايجابية تحليل UPLC-MS. A) المصوبة (الانحياز) مجموع أيون الحالية (TIC) من SIEVE 2.0. B) المستخلصة كروماتوغرام ايون لميزة التعرف مبدئيا على النحو D-pantethine من خلال XCMS. C ) المستخلصة كروماتوغرام ايون لميزة عرف فيما بعد بأنه روتينون من غربال. D) XIC لميزة عرف فيما بعد بأنه روتينون من SIEVE تطبيع لTIC. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
خريج "/>
الشكل 4. . قاعدة بيانات نتائج البحث قاعدة بيانات الفعالية لأ) قاعدة بيانات Metabolome الإنسان ( http://www.hmdb.ca ) وB) ChemSpider / KEGG (عبر SIEVE) (ChemSpider وحده يمكن أيضا أن تستخدم - http://www.chemspider.com ) باستخدام تحديدات دقيقة الشامل للميزات هو مبين في الأرقام 3B، 3C، و3D المقابلة لأيونات م / ض 555.2516 395.1481 واستنادا إلى تحديد هذه الأيونات كما [MH] + الأنواع. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 5. HR / MS / MS Sتأكيد tructural. تأكيد من تحديد ميزة المقابلة لايون في 395.1481 م / ض مع الوقت الاحتفاظ 23.22 دقيقة كما روتينون على أساس المقارنة UPLC-MS/MS إلى مستوى تجاري مع A) الوقت الاحتفاظ مماثلة وب) نفس م / ض (395.1481، ~ 0 خطأ جزء في المليون) مع تجزئة متطابقة تقريبا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
| قياس الطيف الكتلي معلمة | ضبط | تعليق |
| مصدر | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| أيون الموديل | إيجابية أو سلبية | |
| طريقة طول | متغير (~ 40-60 دقيقة) | |
| قرار | 60،000-100،000 | |
| رذاذ (كيلو فولت) | 1.75 | |
| أنبوب عدسة (V) | 130 | هدف التجمع التابعة |
| درجة الحرارة الشعرية (° C) | 250 | قد يقصر حياة رذاذ غيض |
| الشعرية الجهد (V) | 50 | هدف التجمع التابعة |
| نوع البيانات | النقطه الوسطى | (لبيانات الملف، انظر المناقشة) |
الجدول 2. إعدادات MS. العامة ومجمع الأمثل إعدادات مطياف الكتلة المستخدمة لLTQ XL-Orbitrap مع Michrom الحرارية المقدمة الأسير مصدر ESI رذاذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشتته الايض يوفر أداة قوية لتحقيق التحولات الحيوية الذاتية أو أجنبي بيولوجيا، أو التقاط لمحة الأيضية من عينة من الفائدة. الناتج من المقاييس التقنية مع القرار وحساسية التكنولوجيا المستخدمة لفصل وتحليل العينة، والقدرة على التعامل مع مجموعات كبيرة من البيانات المتولدة، والقدرة على زرع الغام في مجموعة البيانات للحصول على معلومات مفيدة (مثل قاعدة بيانات دقيقة البحث الشامل). في الآونة الأخيرة، هذا وقد سهلت التقدم في ارتفاع الطيف الشامل القرار، وعالية أو فائقة الأداء اللوني السائل. وقد تناولت برامج التحليل التفاضلي عنق الزجاجة التحليل، ويمكن تحقيق التكيف الكشف عن ذروة للتحولات الاحتفاظ الوقت، والترشيح، والتحليل الإحصائي مع الإنتاجية العالية. 20،21،22 اختيار خط أنابيب المعلوماتية المناسبة ينبغي أن تشمل الاعتبارات كما أن البيانات centroiding الخوارزميات، كشف الذروة، ذروة التكامل، alignmenر، والقدرة على دمج MS / MS البيانات، والقدرة على التعامل مع النظائر أو adducts. وينبغي أيضا النظر 23 اختيار قواعد البيانات cheminformatics المناسبة. 24،25،26،27 عدم كفاية الحالية من أي قاعدة بيانات خاصة لتحديد شامل المركبات ودمج البيانات الشامل دقيقة، MS / MS البيانات، أو LC البيانات لا يزال يمثل مشكلة رئيسية في هذا المجال.
سير العمل المقدمة هنا يدمج استخراج السائل السائل، اللوني تدفق السائل الصغيرة، وارتفاع القرار مطياف الكتلة مع اثنين من الفرق المختلفة منصات برمجيات التحليل أظهر في نموذج العلاج ثقافة الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يتم سرد بروتوكولات استخراج لمصل الدم والأنسجة، وهذه قد تكون بمثابة عينات مفيدة لتحليل مماثل.
على الرغم من أي طريقة تستخدم لالايض غير مستهدفة ينبغي أن يكون الأمثل للتكرار، وظروف UPLC مستقرة، والاستقرار مصدر، بعض الاختلاف أمر لا مفر منه. كل غربال وXCMS ألووينبغي إيلاء ث تصحيح للاحتفاظ التحول الوقت، لكن عناية خاصة للتأكد من أن المعايير المحددة في التجربة كافية لتصحيح التباين. أيضا، النظائر مستقرة المسمى القياسي الداخلي (ق) يمكن دمجها بسهولة في هذا الإجراء للحد من التحف وبين عينة الاختلاف بسبب الاختلافات في العينة المستخرجة أو تحليل LC-MS 12 كما هو الحال مع جميع المحتويات المنهجية LC-MS، فمن الأهمية بمكان لاستخدام الكواشف عالية النقاء، والتأكد من أن إعداد عينة يزيل الجسيمات غير مرغوب فيه أو الكلي. يمكن أن تتولد القطع الأثرية من الاختلاف الطبيعي في الملوثات، وأنه قد يكون من المرغوب فيه للتأكد من أن الفعالية المفترضة ليست في الواقع في كل مكان من الملوثات عملية الاستخراج أو تحليل.
وأخيرا، على الرغم من أن يسمى الأسلوب بأنه "غير مستهدفة" أو "غير منحازة" الايض، وهذا هو تسمية خاطئة جزئية. سوف طبيعة الاستخراج والفصل وتحليل نواتج الأيض صالح مع بعض characterisالتشنجات اللاإرادية بما في ذلك الاستقرار خلال الاستخراج، والتفاعل مع الثابتة والمتنقلة خلال مراحل الفصل، والتأين في مصدر مطياف الكتلة. 28،29،30 اعتمادا على الأجهزة المتاحة، ويمكن تكييف هذا الإجراء لعمليات الاستخراج مختلفة، معدلات التدفق، والضغوط LC ، مصادر أيون، أو الطيف الشامل. ولذلك، فإننا قمنا بإدراج الملاحظات في الإجراء حيث يمكن أن يكون الأمثل ظروف معينة على أساس المعرفة العامة أو ممثل المعايير الداخلية من فئة من الجزيئات من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونحن نعترف الدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30ES013508 و5T32GM008076. كما نشكر الحرارية العلمية من أجل الوصول إلى SIEVE 2.0 والدكاترة. يوجين Ciccimaro ومارك ساندرز الحرارية العلمية لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
